劉婷婷，梁梓強(qiáng)，梁安文，郭技星，李廣宏，王方海

(中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//昆蟲(chóng)學(xué)研究所，廣東 廣州510275)

靶向家蠶絲素重鏈基因的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域的人工構(gòu)建*

劉婷婷，梁梓強(qiáng)，梁安文，郭技星，李廣宏，王方海

(中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//昆蟲(chóng)學(xué)研究所，廣東 廣州510275)

將多個(gè)可特異識(shí)別并結(jié)合DNA的鋅指單體串聯(lián)在一起即可構(gòu)成鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，若將其與不同的功能域因子融合，則會(huì)構(gòu)建出有很多用途的人工蛋白分子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的各種定點(diǎn)修飾或調(diào)控。以家蠶絲素重鏈基因?yàn)檠芯繉?duì)象，首先利用Zinc Finger Tools軟件篩選到了一個(gè)合適的靶標(biāo)位點(diǎn)，再采用模塊組裝技術(shù)，通過(guò)酶切、片段回收、連接、轉(zhuǎn)化等步驟成功將多個(gè)鋅指單體串聯(lián)在一起，構(gòu)建出一對(duì)靶向家蠶絲素重鏈基因特定位點(diǎn)的由4個(gè)鋅指單體組成的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，這為將來(lái)定點(diǎn)修飾或改造家蠶絲素基因，進(jìn)一步提高蠶絲質(zhì)量和產(chǎn)量，以及大幅度提升家蠶生物反應(yīng)器對(duì)外源蛋白的表達(dá)能力打下了良好的基礎(chǔ)。

家蠶；絲素重鏈基因；鋅指蛋白

鋅指是構(gòu)成鋅指蛋白(ZFP)結(jié)構(gòu)域的基本單元，為廣泛存在于多種蛋白質(zhì)中的蛋白基序，可特異介導(dǎo)蛋白質(zhì)與核酸或其它蛋白質(zhì)的相互作用。將多個(gè)可特異識(shí)別并結(jié)合DNA的鋅指單元串聯(lián)在一起后即構(gòu)成ZFP。若將ZFP與鋅指激活因子(Zinc finger activator)、 鋅指抑制因子(Zinc finger repressor)、鋅指核酸甲基化酶(Zinc finger methylase)、鋅指核酸酶等不同的功能結(jié)構(gòu)域融合，可構(gòu)建出有很多用途的人工蛋白分子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的各種定點(diǎn)修飾或調(diào)控[1]。其中鋅指核酸酶的研究報(bào)道較多，由于其可通過(guò)鋅指蛋白和特定DNA位點(diǎn)結(jié)合，從而將核酸酶帶入該部位，對(duì)附近的DNA鏈進(jìn)行酶解切割，從而可達(dá)到誘導(dǎo)DNA特定位點(diǎn)的雙鏈斷裂，大大提高同源重組的發(fā)生概率等。該技術(shù)因其具有高效和特異性的特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注和研究，已經(jīng)在多種物種(如果蠅、線蟲(chóng)、斑馬魚(yú)、大鼠等)中得到應(yīng)用，近年來(lái)已經(jīng)有多篇研究成果在Nature，Science，Nature Biotechnology等雜志上發(fā)表[2-4]。

ZFP結(jié)構(gòu)域通常由3～6個(gè)C2H2類(lèi)型的鋅指重復(fù)單元串聯(lián)而成，其基本骨架大多來(lái)自人或小鼠的天然鋅指蛋白ZIF268。通常每個(gè)鋅指可直接特異識(shí)別和結(jié)合DNA雙螺旋中某一條單鏈上的3個(gè)連續(xù)核苷酸(一個(gè)三聯(lián)子)，而由多個(gè)鋅指串聯(lián)形成的ZFP 結(jié)構(gòu)域則可識(shí)別更長(zhǎng)的靶標(biāo)序列，同時(shí)也大大增加了DNA靶向修飾的特異性[1]。

家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，其可吐絲結(jié)繭，為絲綢原料的重要來(lái)源，同時(shí)家蠶也是世界上研究較多的一種高效的生物反應(yīng)器[5]，如能對(duì)其絲素基因進(jìn)行修飾或改造，我們就有可能進(jìn)一步提高蠶絲質(zhì)量和產(chǎn)量，也就有可能對(duì)家蠶生物反應(yīng)器進(jìn)行更好的改造升級(jí)。因此本研究主要報(bào)道我們課題組以家蠶絲素重鏈基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用模塊組裝技術(shù)成功構(gòu)建出靶向家蠶絲素重鏈基因特定位點(diǎn)的一對(duì)由4個(gè)鋅指單元組成的ZFP。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒和酶

用于組裝鋅指蛋白(ZFP)結(jié)構(gòu)域的所有質(zhì)粒均源自美國(guó)Addgene公司的Modular Assembly Kit v1.0試劑盒，本實(shí)驗(yàn)中所使用的酶都是購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 構(gòu)建方法

主要采用模塊組裝方法，具體參考文獻(xiàn)[6]，本實(shí)驗(yàn)以家蠶絲素重鏈基因?yàn)檠芯繉?duì)象，首先利用網(wǎng)上Zinc Finger Tools軟件(http://www.scripps.edu/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php)確定靶基因上合適的位點(diǎn)，獲得的位點(diǎn)為6個(gè)核苷酸的間隔序列，在其左右各含有4個(gè)三聯(lián)子組，再分別從現(xiàn)有的試劑盒中尋找含有能夠與各三聯(lián)子結(jié)合的鋅指質(zhì)粒，通過(guò)酶切、連接等步驟組裝成可特異結(jié)合上述連續(xù)4個(gè)三聯(lián)子組序列的ZFP。

1.3 活性檢測(cè)

通過(guò)細(xì)菌雙雜交(B2H)系統(tǒng)，在攜帶有靶位點(diǎn)DNA序列的報(bào)告基因表達(dá)體系中檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)的強(qiáng)弱來(lái)判定ZFP的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶標(biāo)位點(diǎn)的確定

我們選取了家蠶絲素重鏈基因?yàn)檠芯繉?duì)象，該基因的詳細(xì)結(jié)構(gòu)可參閱Zhou等[7]文獻(xiàn)，利用網(wǎng)上Zinc Finger Tools軟件篩選到了一個(gè)合適的靶標(biāo)位點(diǎn)，在絲素重鏈基因AF226688中，這個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)位于65 461到65 520之間。具體為間隔序列6個(gè)核苷酸，左右各由4個(gè)三聯(lián)子組組成，每個(gè)三聯(lián)子對(duì)應(yīng)于一個(gè)可以與之結(jié)合的鋅指單體，這樣可以構(gòu)建一對(duì)由4個(gè)鋅指單體組成的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，可與該段序列特異結(jié)合，如果在末端加上FokI，則可構(gòu)成鋅指核酸酶，能夠特意切斷該靶標(biāo)序列，為了便于后面的表述，我們將準(zhǔn)備構(gòu)建的能夠與這對(duì)由4個(gè)三聯(lián)子組組成的序列特異結(jié)合的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域分別命名為F1aF2aF3aF4a和F1bF2bF3bF4b，其中每一個(gè)F代表一個(gè)鋅指單體，如圖1所示。

圖1 篩選到的靶標(biāo)位點(diǎn)序列和擬構(gòu)建的一對(duì)與之可特定結(jié)合的由4個(gè)鋅指單體組成的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.1 The sequence of target sites and the zinc finger protein domain formed by 4 zinc finger units

2.2 鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域的人工構(gòu)建

首先分別選取對(duì)應(yīng)于F1a、F2a、F1b、F2b的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，用AgeⅠ和BamHⅠ酶切對(duì)應(yīng)于F1a和F1b的質(zhì)粒，獲得相應(yīng)的線形質(zhì)?？蚣?，用XmaⅠ和BamHⅠ酶切對(duì)應(yīng)于F2a和F2b的質(zhì)粒，獲得相應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量在100左右的鋅指單體，分別純化線形質(zhì)?？蚣芎弯\指單體，再經(jīng)過(guò)連接轉(zhuǎn)化、挑選陽(yáng)性克隆檢測(cè)等步驟，即可獲得含有F1aF2a和F1bF2b兩個(gè)鋅指單體的質(zhì)粒，圖2為具體酶切的電泳圖。用同樣的方法可獲得含有F1aF2aF3a和F1bF2bF3b 3個(gè)鋅指單體的質(zhì)粒，圖3為分別選取4個(gè)克隆細(xì)胞進(jìn)行酶切鑒定的電泳圖，均含有一個(gè)300 bp左右的條帶，說(shuō)明3個(gè)鋅指單體連接成功。接著再用同樣的方法可獲得含有F1aF2aF3aF4a和F1bF2bF3bF4b 4個(gè)鋅指單體的質(zhì)粒，圖4為分別選取4個(gè)克隆細(xì)胞進(jìn)行酶切鑒定的電泳圖，其中共有6個(gè)樣品均含有一個(gè)400 bp左右的條帶，說(shuō)明4個(gè)鋅指單體連接成功。

圖2 帶有相應(yīng)鋅指單體質(zhì)粒的酶切電泳圖Fig.2 The enzyme electrophoresis of plasmid with corresponding zinc finger unitsF1az、F2az、F1bz、F2bz代表相應(yīng)的質(zhì)粒；S為DNA Marker；用AgeⅠ和BamHⅠ酶切F1az和F1bz，可見(jiàn)到特別明亮的線形質(zhì)粒框架條帶，用XmaⅠ和BamHⅠ酶切F2az和F2bz，可見(jiàn)到100 bp左右的鋅指單體條帶

圖3 構(gòu)建含有F1aF2aF3a和F1bF2bF3b3個(gè)鋅指單體的陽(yáng)性克隆電泳鑒定圖Fig.3 Identification of cell clones containing three zinc finger F1aF2aF3a or F1bF2bF3b by electrophoresisS為DNA Marker；1、2、3、4和(1)、(2)、(3)、(4)分別代表挑選的4個(gè)克隆，用XmaⅠ和BamHⅠ酶切，均可獲得300 bp左右的條帶，表明F1aF2aF3a和F1bF2bF3b 3個(gè)鋅指單體均連接成功

圖4 構(gòu)建含有F1aF2aF3aF4a和F1bF2bF3bF4b4個(gè)鋅指單體的陽(yáng)性克隆電泳鑒定圖Fig.4 Identification of cell clones containing four zinc finger F1aF2aF3aF4a or F1bF2bF3bF4b by electrophoresisS為DNA Marker；1、2、3、4和(1)、(2)、(3)、(4)分別代表挑選的4個(gè)克隆，用XmaⅠ和BamHⅠ酶切，各有3個(gè)克隆獲得400 bp左右的條帶，表明F1aF2aF3aF4a和F1bF2bF3bF4b 4個(gè)鋅指單體連接成功

2.3 活性檢測(cè)

構(gòu)建好的2個(gè)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域F1aF2aF3aF4a和F1bF2bF3bF4b，與標(biāo)靶位點(diǎn)的結(jié)合能力，主要是通過(guò)細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)的[8]，首先分別構(gòu)建好相應(yīng)的質(zhì)粒，然后共同轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行共表達(dá)，最后觀測(cè)計(jì)算出待測(cè)樣品的半乳糖苷酶的活性強(qiáng)度，從而確定構(gòu)建好的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域與靶標(biāo)位點(diǎn)的結(jié)合能力。由表1可知，鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域F1aF2aF3aF4a的半乳糖苷酶的活性單位為10.527，與對(duì)照的比值為1.484，活性相對(duì)較高；而鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域F1bF2bF3bF4b的半乳糖苷酶的活性單位為8.726，與對(duì)照的比值為1.16，活性相對(duì)較低。

表1 鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域活性分析結(jié)果Table 1 The analysis results of zinc finger protein domain activity

3 討 論

蜘蛛絲用途非常廣泛，但資源緊缺，故人們一直嘗試使用生物技術(shù)的方法改造其它生物體來(lái)生產(chǎn)蜘蛛絲,可惜進(jìn)程緩慢[9], 目前雖能將蜘蛛絲基因?qū)爰倚Q中生產(chǎn)出蜘蛛絲纖維[10]，然而產(chǎn)量太低，原因是家蠶本身要合成大量蠶絲蛋白，占用了體內(nèi)過(guò)多的氨基酸資源。如文中所描述，我們已成功構(gòu)建出一對(duì)靶向家蠶絲素重鏈基因特定位點(diǎn)的由4個(gè)鋅指單體組成的ZFP，在此基礎(chǔ)上我們擬將其與FokⅠ核酸酶功能域融合，使其成為靶向家蠶絲素重鏈基因特定位點(diǎn)的鋅指核酸酶[11]，再結(jié)合基因打靶方法[12]敲掉家蠶絲素重鏈基因，從而提高轉(zhuǎn)入的蜘蛛絲基因的表達(dá)產(chǎn)量，一旦獲得成功，不但能解決蜘蛛絲纖維資源緊缺的問(wèn)題，且經(jīng)濟(jì)意義重大。

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Artificial construction of zinc finger protein domain targetingBombyxmorifibroin heavy chain gene

LIUTingting,LIANGZiqiang,LIANGAnwen,GUOJixing,LIGuanghong,WANGFanghai

(State Key Laboratory for Biocontrol and Institute of Entomology, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

Many zinc finger units, which can specifically recognize and bind to DNA, are strung together to form zinc finger protein domain. There are many uses to artificially construct the protein molecules, such as various site modification or regulation of the genome, by its integration with the different functional domains of active factors. This study focused on fibroin heavy chain gene of silkworm. Firstly, a suitable target site was found using Zinc Finger Tools software, and then we used module assembled technology to construct a pair of four zinc finger domain targeting the specific site of fibroin heavy chain gene, through restriction enzyme digesting, fragment recycling, linking, transforming, and other steps. The results would provide a good foundation for the fixed-point modification or reconstruction of fibroin genes to improve silk quality and production, or to greatly enhance the expression of exogenous protein in the bioreactor ofBombyxmori.

silkworm; fibroin heavy chain gene; zinc finger protein

2016-08-10 基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A010107009)

劉婷婷(1991年生)，女；研究方向：生物工程；E-mail：377085590@qq.com

王方海(1965年生)，男；研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：lsswfh@mail.sysu.edu.cn

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.02.001

Q965

A

0529-6579(2017)02-0001-04