“珍珠—25”味丸對小鼠心臟組織VEGF基因mRNA的影響研究

韓光明++特格喜白音++杭呼格吉樂

【摘 要】 目的：研究蒙藥“珍珠-25”味丸對小鼠心臟與動脈VEGF基因mRNA的作用。方法：蒙藥“珍珠-25”味丸溶液以2次/d，連續(xù)給藥4周后把小鼠斷頸處死，取小鼠心臟用TRIzol法提取總RNA。然后設(shè)計小鼠VEGF基因響應(yīng)引物，利用qPCR技術(shù)監(jiān)測蒙藥“珍珠-25”味丸作用下的小鼠心臟VEGF基因mRNA變化。結(jié)果：各組小鼠VEGF mRNA 的表達水平在低劑量、中級量、高劑量組與對照組相比明顯增加，中劑量組和高劑量組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：蒙藥“珍珠-25”味丸對小鼠心臟與動脈VEGF基因mRNA有調(diào)控作用。

【關(guān)鍵詞】 蒙藥；心血管疾病；VEGF

【中圖分類號】R29 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2017）09-0034-03

Study on Mongolian medicine Pearl Pill -25 effect on mRNA VEGF gene in mouse heart tissue

HAN Guangming Tegexibaiyin HANG Hugejile

Inner Mongolia International Mongolian Hospital，Hohhot 010065，China

Abstract： Objective Analysis of effect of Mongolian medicine Pearl -25 Pill on mice heart and arterial VEGF gene mRNA.Methods We prepared the Mongolian medicine Pearl Pill -25 solution with 2d administered continuously for 4 weeks after the mice were sacrificed the mice heart by TRIzol method to extract total RNA.Then the mouse VEGF gene response primer was designed.Finally， using the mouse heart VEGF gene mRNA qPCR technology to monitor the change of Mongolian medicine Pearl Pill under -25.Results The expression level of VEGF mRNA in each group was significantly lower than that in the control group， the middle dose group and the high dose group had statistical significance （P<0.01）. Conclusion The Mongolian medicine Pearl -25 pill could regulate mouse cardiac and arterial VEGF gene mRNA.

Keywords： Mongolian Medicine； Cardiovascular Disease；VEGF

心腦血管疾病是危害人類健康最嚴重的一類疾病，發(fā)病因素包括：肥胖、胰島素抵抗、糖代謝異常、凝血因子升高、慢性炎癥、睡眠呼吸障礙等；此外與年齡、性別、家族史、吸煙、高血壓、糖尿病、脂代謝紊亂等也有一定的關(guān)系。最近研究表明血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）對于許多心血管疾病有著重要的生物學(xué)意義和臨床意義[1-2]。VEGF以血管內(nèi)皮細胞為特異性靶細胞，對一些伴有血管內(nèi)皮損傷的心血管疾病具有較好的實驗治療作用，面臨臨床應(yīng)用的過渡。VEGF對側(cè)枝血管形成、動脈粥樣硬化病變、血管通透性、血管損傷后的修復(fù)及腫瘤形成的影響極為突出[3，6，7]。VEGF是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一特異性促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂的生長因子，由于內(nèi)皮細胞增殖是血管形成的重要部分，故VEGF可在新生血管的形成過程中發(fā)揮重要作用，因此對心血管疾病具有潛在的治療意義[8-10]。

蒙醫(yī)認為心腦血管病屬于蒙醫(yī)學(xué)“脈管病”范疇，主要機制是機體在外因的作用下使體內(nèi)三根元素與七素平衡紊亂，使之心血管功能產(chǎn)生數(shù)到質(zhì)的變化。蒙醫(yī)學(xué)在治療心血管疾病的過程中創(chuàng)建了許多良好的方子[4]。其中，二十五味珍珠丸是蒙醫(yī)經(jīng)典方劑，始載于公元8世紀的藏醫(yī)古典巨著《四部醫(yī)典》中，以珍珠、珍珠母、訶子、余甘子等25味藥按君臣佐使等原則組成，是蒙醫(yī)治療“黑脈病”（相當于西醫(yī)心腦血管病和半身不遂的總稱）的傳統(tǒng)驗方。為開竅劑，具有安神開竅的功效，用于中風(fēng)、半身不遂，口眼歪斜、昏迷不醒、神志紊亂、譫語發(fā)狂等疾病。蒙藥“珍珠-25”味丸是名老蒙醫(yī)陳玉良教授用來治療心腦血管疾病的良方，該制劑用于臨床40多年療效明顯。雖有良好的治療效果，但其具體的作用機制并不明確。研究以蒙藥“珍珠-25”味丸治療心血管疾病為實驗依據(jù)，研究蒙藥“珍珠-25”味丸對血管內(nèi)皮功能基因VEGF的保護作用，從而進一步探討蒙藥“珍珠-25”味丸對血管內(nèi)皮功能異常對動脈粥樣硬化（AS）發(fā)病機制的影響[4-5]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Leica 200M 2000 解剖顯微鏡（Nikon），Ti-U型倒置顯微鏡，TRACE1300-ISQ LT氣質(zhì)聯(lián)用儀，實時定量PCR儀（美國Applied Biosystems 7500）， 2720-PCR儀（Applied Biosystems）。

1.2 實驗動物 BALB/c小鼠（北京華阜康生物科技有限公司），雄性，4～6周齡，體重18～20 g，無特定病原體（SPF）級飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥 選取培養(yǎng)至第10-14d的BALB/c 小鼠，隨機分為空白組（生理鹽水）、蒙藥“珍珠-25”味丸各劑量（低劑量100μM；中劑量200μM；高劑量500μM）組，2次/d，連續(xù)灌胃4周后把小鼠斷頸處死，解剖取出心臟放入液氮保存。

2.2 TRIzol法RNA的提取 利用TRIzol法提取小鼠心臟的總RNA，為清除殘留的基因組DNA，每個RNA 樣本中加入10U DNaseⅠ（Takara，日本）37℃孵育30min。3個RNA 樣本的濃度被測定后，每個樣本各取10μg等量混合組成1個RNA 池（RNA pool，共30μg）。接著使用Oligotex mRNA Midi Kit（Qiagen，德國）分離純化樣品mRNA。整個流程RNA 的質(zhì)量和含量通過使用Nanodrop ND-1000（LabTech，美國）檢測吸光度 （A260/A280）進行測定， RNA 的完整性通過1.2%的凝膠電泳進行檢測，然后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1 RNA濃度測定 RNA濃度=（OD260-OD320）×稀釋倍數(shù)×0.04μg/μL。OD230，260，280，320分別是鹽濃度、核酸、蛋白質(zhì)等有機物和背景（溶液混濁度）的吸光度值。

2.2.2 RNA 凝膠電泳實驗 ①取出提前制備好的瓊脂糖凝膠，將凝膠放入電泳槽。加入1×TAE緩沖液恰好過膠面約1mm即可。②先加10μL Marker于點樣孔中，注意不要將凝膠弄破。③在各樣品中加入2μL，充分混合后，取10μL于點樣孔中。④接通電源，使樣品槽在負極端，用15v/cm的電壓，電泳30min時間。⑤電泳結(jié)束后，將含EB的凝膠直接放在凝膠成像分析系統(tǒng)上，打開抽屜燈箱拍照觀察。操作需在暗室觀察。

2.3 RT-PCR驗

2.3.1 引物設(shè)計 ①β-ACTIN上游引物：5' -CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3'；下游引物：5'-CCATCTCCTGCTCGAAGTCT3-'。②VEGF上游引物：5'-CCATGAACTTTCTGCTCTTC-3'；下游引物：5'-GGTGAGAGGTCTAGTTCCCGA-3'。

2.3.2 試劑配制及PCR ① RNA 1μg； Olig 1μL； dNTP2μL； dH2O 6μL。反應(yīng)溫度：65℃ 5min；4℃min。②上述反應(yīng)液 10μL；5×primer script buffer 6μL；RNase inhibitor 1μL； Reverse TranscriptasexL 1μL； dH2O 4μL。反應(yīng)溫度：42℃ 30min； 72℃ 15min；4℃ 5min。③10×buffer2μL；MgCl2 1.2μL； dNTP 0.4μL； Tag 0.3μL； dH2O 13.5μL；primer1 0.2μL；primer2 0.2μL； SYSB 1μL；cDNA 1μg；反應(yīng)溫度：95℃ 5min；95℃ 15sec；58℃ 20sec；68℃ 1min。

2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示組間比較，采用t檢驗；率的比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 小鼠心臟總RNA的提取 利用TRIzol方法提取小鼠心臟總RNA，然后用微量分光光度計測定RNA濃度，用0.8%的凝膠進行RNA電泳實驗。由圖1可知，本次提取總RNA的實驗非常成功，箭頭所指部位是RNA的雙條鏈條。

3.2 小鼠VEGF基因引物的設(shè)定 引物又名引子，是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點，在核酸合成反應(yīng)時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進行合成，因此引物的3′-OH，必須是游離的。另外，在DNA合成中DNA聚合酶僅僅可以把新的核苷酸加到已有的DNA鏈上。本次實驗根據(jù)β-actin和VEGF基因序列設(shè)計了兩對β-actin引物和兩對VEGF引物，利用PCR實驗驗證了β-actin和VEGF基因的擴增實驗。結(jié)果表明VEGF（2）和β-actin（1）的擴增情況良好。見圖2。

3.3 對小鼠心臟VEGF基因mRNA變化的影響 各組小鼠VEGF mRNA 的表達水平在低劑量、中劑量、高劑量組與對照組相比明顯增加，中劑量組和高劑量組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果如圖3。

4 討 論

心腦血管疾病嚴重威脅人類健康，50歲以上中老年人較為常見，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點，全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達1500萬人，居各種死因首位[11]。傳統(tǒng)蒙藥“珍珠-25”味丸具有安神開竅作用，常用于治療心肌炎、心絞痛、心肌梗塞、心律失常（心動過速、心律不齊）、先天性心臟病、風(fēng)濕性心臟病及動脈硬化癥等。該藥組方簡潔合理，藥源廣泛易得。將其原劑型研究改進成膠囊劑，為本品的質(zhì)量穩(wěn)定、服用方便、充分發(fā)揮療效奠定了良好基礎(chǔ)，但制備工藝有待進一步提高完善?！罢渲?25”味丸頒布標準尚缺含量測定鑒別項目，且質(zhì)量標準亟待進一步深入研究，以保證為臨床提供一種質(zhì)量穩(wěn)定可控的、療效確切的、安全無毒或低毒的、具有民族特色的蒙藥新制劑。

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（收稿日期：2017-03-03 編輯：陶希睿）