楊玉靜

（南陽市獸藥監(jiān)察所，河南南陽473000）

微生物脂肪酶的研究進(jìn)展及其在飼料中的應(yīng)用

楊玉靜

（南陽市獸藥監(jiān)察所，河南南陽473000）

脂肪酶，又稱三酰甘油?；饷?，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯，作為一種重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于食品、制革、飼料、洗滌、油脂化工等傳統(tǒng)的工業(yè)領(lǐng)域。自1984年，Zaks和Klibanov在有機(jī)溶劑體系中，以脂肪酶粉為催化劑，成功地催化合成了一系列有機(jī)化合物之后，非水相酶學(xué)的研究序幕被揭開，并迅速成為應(yīng)用酶學(xué)研究中最為活躍、發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域。而脂肪酶是非水相酶學(xué)中最為重要的一類酶，它顯著不同于在水相體系中的水解反應(yīng)特性，在非水相體系中具有良好的酯化、轉(zhuǎn)酯、醇解和胺解等特性，該特性使脂肪酶可被廣泛地應(yīng)用于生物能源（生物柴油）、藥物合成等應(yīng)用前景廣闊的領(lǐng)域。

脂肪酶廣泛存在于動物、植物和微生物中。動物體內(nèi)含脂肪酶較多的是高等動物的胰臟和脂肪組織等，植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子。而微生物脂肪酶則廣泛存在于細(xì)菌、酵母和霉菌中，由于其種類多，且具有比動植物脂肪酶更廣的pH值、溫度適應(yīng)性以及底物專一性，并且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因此自20世紀(jì)初首次發(fā)現(xiàn)以來，便得到廣泛研究和應(yīng)用，是工業(yè)用脂肪酶的重要來源，并且在理論研究方面也具有重要的意義。

1 微生物脂肪酶的種類

據(jù)統(tǒng)計，大約有2%的微生物產(chǎn)脂肪酶，至少包括65個屬的微生物，其中細(xì)菌28個屬、放線菌4個屬、酵母菌10個屬、其他真菌23個屬，且不同微生物來源的脂肪酶組成成分、理化特性各不相同。高產(chǎn)脂肪酶菌株多來源于細(xì)菌、酵母菌和霉菌，已開展深入研究的脂肪酶產(chǎn)生菌種主要有根霉、曲霉、青霉、毛霉、假單胞菌等具有工業(yè)應(yīng)用價值的菌種，以及與醫(yī)學(xué)相關(guān)的金黃色葡萄球菌、鉤端螺旋體、粉刺狀桿菌等。

1.1 細(xì)菌脂肪酶

細(xì)菌脂肪酶是大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)中很重要的一類脂肪酶。細(xì)菌脂肪酶大多數(shù)是胞外酶，易于液體深層發(fā)酵，生產(chǎn)比較容易。細(xì)菌脂肪酶大多數(shù)是堿性脂肪酶，且pH值在4～11、溫度30～60℃間具有良好的穩(wěn)定性。大多數(shù)細(xì)菌脂肪酶是糖蛋白，但也有些細(xì)菌胞外脂肪酶是脂蛋白。細(xì)菌脂肪酶發(fā)酵生產(chǎn)主要受溫度、pH值、碳氮源、脂類物質(zhì)、無機(jī)鹽、攪拌和溶解氧濃度等因子的影響。細(xì)菌脂肪酶的生產(chǎn)培養(yǎng)基一般是由有機(jī)氮源和油脂性的碳源組成，如：油、脂肪酸、甘油和吐溫等。通常，脂肪酶生產(chǎn)的溫度范圍為20～45℃，誘導(dǎo)時間從幾小時到3～4 d不等，但是大多數(shù)集中在72～92 h間。目前一些屬細(xì)菌的野生菌或重組菌株得到了商業(yè)開發(fā)，其中最重要的是無色桿菌，產(chǎn)堿桿菌屬、芽孢桿菌屬、色桿菌屬和假單胞菌屬等。

1.2 真菌脂肪酶

真菌脂肪酶的研究開始于20世紀(jì)50年代，但由于真菌脂肪酶具有溫度和pH值穩(wěn)定性、底物特異性以及在有機(jī)溶劑中具有高活性，提取成本比較低等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展迅速。目前商業(yè)化的真菌脂肪酶主要有：黑曲霉、米曲霉、高溫毛殼酶、少根根霉、德氏根霉、日本根霉、米根霉、皺褶假絲酵母、南極假絲酵母、柱狀假絲酵母等。

2 脂肪酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

2.1 脂肪酶的結(jié)構(gòu)

脂肪酶是一種糖蛋白，糖基部分約占總分子量的2%～15%，以甘露糖為主。酶分子由親水區(qū)和疏水區(qū)兩部分組成，活性中心靠近疏水端。研究表明，來源不同的脂肪酶，其氨基酸組成數(shù)目從270～641不等，分子量為29 000～100 000。

Brockerhoff研究了10種脂肪酶的三維結(jié)構(gòu)，并比較了21種脂肪酶的區(qū)域選擇性，提出了脂肪酶在油界或水界面定向作用的假設(shè)模型。結(jié)果表明：①脂肪酶都包括同源區(qū)段His-X-Y-Gly-Z-Ser-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly（X、Y、Z、W表示可變氨基酸殘基）；②活性中心是絲氨酸殘基。在正常情況下，該殘基受一個α-螺旋蓋的保護(hù)，當(dāng)脂肪酶與油界或水界面接觸時，此蓋打開，露出疏水殘基團(tuán)，隱藏親水殘基團(tuán)，在絲氨酸殘基周圍形成親電子域，引起脂肪酶的構(gòu)象改變，增加了酶與脂類底物的親和性，并穩(wěn)定了催化過程中過渡態(tài)中間產(chǎn)物。酶分子周圍通常保留一定量的水分，從而保證了脂肪酶在油/水界面和脂相中的自體激活。

2.2 脂肪酶的性質(zhì)

脂肪酶的催化反應(yīng)特性主要包括最佳溫度與pH值、溫度與pH值穩(wěn)定性、水解位點(diǎn)專一性與底物脂肪酸種類專一性等幾個方面。微生物脂肪酶一般易溶于水，不溶于乙醇，通常在pH值3.5～7.5之間水解能力較強(qiáng)，部分脂肪酶在pH值2.0時仍有穩(wěn)定的活性，最適酶解溫度在38～45℃之間。

水解位點(diǎn)專一性對于脂肪酶的工業(yè)應(yīng)用是極為重要的，因此對多種脂肪酶的位點(diǎn)專一性做了詳細(xì)研究。脂肪酶對脂肪酸中立體對映結(jié)構(gòu)1位和3位具有選擇性水解能力。例如：Penicilliumsp1和Mucormiehei脂肪酶為1位和3位專一水解酶。有些脂肪酶對底物的脂肪酸組成也具有高度專一性，可對不同碳鏈長度和飽和脂肪酸表現(xiàn)出不同反應(yīng)性，不同來源脂肪酶水解不同甘油酯所表現(xiàn)出脂肪酸特異性極大，來源于葡萄孢屬的一種脂肪酶對長鏈不飽和脂肪酸和亞油酸具有專一性，而Fusariumoxysporum脂肪酶則優(yōu)先水解飽和脂肪酸鏈。

脂肪酶的催化特性還表現(xiàn)為，在油界或水界面上催化活性最高，在油界或水界面被激活的比率（即水解活力）是單一脂相中的10倍以上。油界或水界面的理化特性在很大程度上決定了一些脂肪酶在界面的吸附，磷脂和膽酸鹽等兩親物質(zhì)能明顯影響界面的理化特性。當(dāng)存在兩親物質(zhì)時，甘油三酯或水界面的親水或疏水平衡被打破，輔因子（兩親物質(zhì)）結(jié)合在脂肪酶的特定位點(diǎn)，并通過其疏水端吸附在油/水界面上，使脂肪酶活性中心周圍的保護(hù)蓋被打開，實現(xiàn)界面激活作用。

3 脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及鑒定

脂肪酶的篩選方法一般為：樣品-富集培養(yǎng)-平板分離-平板初篩（觀察透明圈大?。?搖瓶復(fù)篩（測酶活力大小）。已發(fā)現(xiàn)的微生物的作用條件因菌種的不同差異很大，不同的篩選方法對被分離的微生物種類及酶的特異性有相當(dāng)大的影響，因此篩選分離脂肪酶產(chǎn)生菌的方法應(yīng)根據(jù)應(yīng)用對象、微生物種類、酶的特性而定，最常用的方法是用含有甘油三酯的瓊脂平板，脂肪酶催化水解產(chǎn)生清晰的環(huán)帶或渾濁的脂肪酸鹽沉淀，也可利用生色底物或產(chǎn)脂肪酶微生物的某些特性。Fager規(guī)定優(yōu)良產(chǎn)酶菌株的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)是短時、營養(yǎng)基質(zhì)低廉、菌株易分離、胞外酶、非致病菌、不產(chǎn)生毒素、遺傳性狀穩(wěn)定及對噬菌體不敏感等。目前，產(chǎn)脂肪酶菌株主要集中在根霉、曲霉、假絲酵母、青霉、毛霉、須霉及假單胞菌等。

脂肪酶的篩選方法著眼于快速、簡捷、準(zhǔn)確、選擇性強(qiáng)及易于自動化。20世紀(jì)80年代以來，我國研究者在脂肪酶產(chǎn)生菌的選育方面也做了較多的工作。王美英、陶文沂等采用類似的油脂同化平板，以油脂為唯一碳源，進(jìn)行同化試驗，分別篩選到較高活力的菌株。金其榮等以氫化油為唯一碳源，36℃培養(yǎng)，篩選到一株耐高溫的根霉菌。施巧琴利用脂肪酶作用脂肪后產(chǎn)生脂肪酸與維多利亞藍(lán)反應(yīng)呈藍(lán)綠色的透明圈平板法經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩得到產(chǎn)堿性脂肪酶的擴(kuò)展青霉。

近年來，隨著生物工程的發(fā)展，分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)在脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定、誘變和基因克隆等方面也取得了一些進(jìn)展。燕清麗等，董明奇等分別利用16srRNA技術(shù)對脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及鑒定進(jìn)行了相關(guān)研究。

4 微生物脂肪酶的固定化

固定化脂肪酶是指被限定于空間某一區(qū)域內(nèi)的脂肪酶，它有利于提高酶的穩(wěn)定性并可回收重復(fù)利用，便于連續(xù)化生產(chǎn)，因此被廣泛采用。

脂肪酶固定化方法有四大類：共價結(jié)合法、交聯(lián)法、吸附法（超濾膜吸附法）、包埋法。

4.1 共價結(jié)合法

共價結(jié)合法是指酶蛋白分子上功能基和固相支持物表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價鍵連接，結(jié)合力牢固，使用過程中不易發(fā)生酶的脫落，穩(wěn)定性能好。缺點(diǎn)是載體的活化或固定化操作比較復(fù)雜，反應(yīng)條件也比較強(qiáng)烈，所以往往需要嚴(yán)格控制條件才能獲得活力較高的固定化酶。共價結(jié)合法是固定化酶研究中最活躍的一類方法。

4.2 交聯(lián)法

交聯(lián)法的主要特色是用多功能試劑進(jìn)行酶蛋白分子之間的交聯(lián)，基本原理是酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵，得到三向的交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)。多功能試劑制備固定化酶方法可分為：①單獨(dú)與酶作用；②輔助蛋白質(zhì)與酶共存時，多功能團(tuán)試劑交聯(lián)；③酶吸附在載體表面上再經(jīng)受交聯(lián)；④多功能團(tuán)試劑與載體反應(yīng)得到有功能團(tuán)的載體，再連接酶。最常用的交聯(lián)試劑是戊二醛。這類方法的優(yōu)點(diǎn)是酶與載體結(jié)合牢固、不易脫、穩(wěn)定性較高、試劑價格低廉、固定化成本低；缺點(diǎn)是有的方法固定化操作較復(fù)雜，進(jìn)行化學(xué)修飾時，易造成酶失活，此類方法是固定化酶研究中最有潛力的方法。

4.3 吸附法

吸附法包括物理吸附和離子吸附，主要依靠蛋白質(zhì)和載體間的結(jié)合力聯(lián)結(jié)，作用力較弱，酶易脫落，但載體選擇范圍較廣，固定化操作過程簡單，吸附法是經(jīng)濟(jì)上最具吸引力的固定化方法。

4.4 包埋法

包埋法是一種酶物理包埋在高聚物內(nèi)，反應(yīng)條件溫和，很少改變酶結(jié)構(gòu)的固定化方法，適用于大多數(shù)酶、酶制劑及完整的微生物細(xì)胞，但只有小分子的底物和產(chǎn)物條件下適用。由于采用包埋法固定化酶，酶被完全地限制在微囊或凝膠內(nèi)，本身的性能根本不發(fā)生變化，因此，包埋法是固定化酶研究中最有前景的方法。

國內(nèi)外學(xué)者針對脂肪酶的固定化開展了一系列的研究，1983年，日本學(xué)者利用微孔膜生物反應(yīng)器連續(xù)法合成甘油酯；1986年，美國學(xué)者Taylor利用系列反應(yīng)器水解硬脂；1989年，HaraidssonG也是在BsTRs中以魚肝油DHA，EPA為底物吸附法同定脂肪酶進(jìn)行酯換；1993年，ward等人以谷物油、橄欖油、花生油中富集的ω-3PUFA為底物，在BsTRs中以離子交換法固定脂肪酶催化酯交換。最近有人報道了脂肪酶固定化的一種新方法，用溫和的氧化劑（高碘酸鈉）氧化CandidaRugesaLipaser的糖基部分及使其產(chǎn)生醛基，并結(jié)合到含有氨基的尼龍載體上，實現(xiàn)固定化。結(jié)果使該酶活力提高4倍以上，但固定化后穩(wěn)定性如何未做報道。

5 微生物脂肪酶在飼料中的應(yīng)用

脂肪在畜禽體內(nèi)的作用主要是氧化供能，它含有的能量是碳水化合物的2.25倍，可滿足動物體對較高能量濃度的要求。脂肪是脂溶性維生素和某些激素的溶劑，促進(jìn)對這些物質(zhì)的吸收和利用，同時為畜禽提供必需的不飽和脂肪酸，保證畜禽的健康生長；添加脂肪還可減少飼料加工過程中的粉塵，改善飼料外觀，在高溫條件下，還有利于提高能量攝入量，降低畜禽的體熱增耗，減緩熱應(yīng)激；此外，添加脂肪可有效地提高飼料的適口性。因此，在豬、雞和奶牛飼料中添加脂肪是比較普遍的做法。

脂肪酶是脂肪代謝最基本的酶，若缺乏將會影響畜禽機(jī)體健康。單胃動物自身能夠分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等內(nèi)源性酶，但是，幼畜、幼禽由于消化機(jī)能尚未發(fā)育健全，內(nèi)源性消化酶分泌量不足，限制了其對飼料的利用，所以在幼畜、幼禽日糧中添加外源性的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，能補(bǔ)充體內(nèi)內(nèi)源酶的不足，提高動物的生產(chǎn)性能。

5.1 脂肪酶在禽飼料中的應(yīng)用

家禽出殼時胰腺脂肪酶活性很低，隨著日齡增長，其活性逐漸升高。Freeman報道，肉雞出殼時對動物脂肪的消化率很低，1～8周齡期間逐漸升高。剛出殼時胰腺脂肪酶分泌不足可能是限制禽類脂肪消化率的重要原因之一。Knarreborg等研究了雞體外和體內(nèi)胰脂肪酶活性與非共軛膽汁酸，以及腸道pH值間的相互關(guān)系，結(jié)果表明，非共軛膽汁酸能明顯地抑制脂肪酶的活性，而且具有pH值依賴性。

5.2 脂肪酶在豬飼料中的應(yīng)用

仔豬斷奶后，食物由母乳轉(zhuǎn)變?yōu)橐灾参餅橹鞯娘暳希到y(tǒng)不能及時適應(yīng)，加之仔豬斷奶后內(nèi)源消化酶分泌量普遍下降，需要2～3周才能逐漸恢復(fù)，所以，仔豬在早期斷奶后常出現(xiàn)下痢、生長遲緩、飼料轉(zhuǎn)化率下降、精神萎靡和抗病力降低等現(xiàn)象，稱為“仔豬早期斷奶綜合征”。添加外源脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶等消化酶被認(rèn)為是緩解仔豬斷奶營養(yǎng)應(yīng)激的有效手段，國內(nèi)外已有較多的相關(guān)試驗報道。

Dierick等用4種中鏈脂肪（C6：0～C12：0）和6種脂肪酶，在模擬胃環(huán)境（37℃，pH值3～6，3 h）下的組合水解試驗表明，適量添加脂肪酶能部分釋放中鏈脂肪酸，這些中鏈脂肪酸對一些消化道要害微生物的生長具有顯著的抑制作用，起到類似抗生素的作用。由此推測，脂肪和脂肪酶的合理組合可能起到降低仔豬飼料中抗生素使用量的作用。

6 小結(jié)

添加脂肪酶有利于補(bǔ)充特殊生理階段動物內(nèi)源消化酶的不足，提高飼料脂肪的消化，緩解營養(yǎng)應(yīng)激，促進(jìn)動物生長，但飼料中添加脂肪酶也會加快脂肪水解速度，降低飼料的貯藏穩(wěn)定性。而已實現(xiàn)商品化生產(chǎn)的脂肪酶多是微生物脂肪，它們的pH值穩(wěn)定性多在中性偏堿范圍內(nèi)，對酸的耐受力較差，而添加于飼料中的脂肪酶必須經(jīng)過胃腸道的酸性條件來到達(dá)內(nèi)源酶的水解作用位點(diǎn)，并且還要在作用位點(diǎn)的pH值范圍內(nèi)保持較高的活性，所以絕大多數(shù)實現(xiàn)商品化生產(chǎn)的脂肪酶在飼料中的應(yīng)用還需要進(jìn)行更深層次的研究，從而來推動脂肪酶在飼料工業(yè)中的應(yīng)用。