張達(dá)娟, 張興華, 唐學(xué)璽, 畢相東,4*, 宋倫, 張樹(shù)林

(1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2. 中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院， 山東 青島 266003；3. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院， 遼寧 大連 116023；4. 南開(kāi)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300071)

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三角褐指藻與抑食金球藻的競(jìng)爭(zhēng)及化感作用研究

張達(dá)娟1, 張興華2, 唐學(xué)璽2, 畢相東1,4*, 宋倫3, 張樹(shù)林1

(1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2. 中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院， 山東 青島 266003；3. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院， 遼寧 大連 116023；4. 南開(kāi)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300071)

為探明三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)對(duì)抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)是否具有化感作用，本研究以三角褐指藻和抑食金球藻為實(shí)驗(yàn)材料，研究了抑食金球藻在單培養(yǎng)和共培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況及三角褐指藻培養(yǎng)濾液對(duì)其生長(zhǎng)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響。結(jié)果表明：三角褐指藻對(duì)抑食金球藻有明顯的化感抑制作用。在單培養(yǎng)體系中，抑食金球藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)可用邏輯斯諦增長(zhǎng)模型擬合，隨著起始密度的增加，環(huán)境容量(K)逐漸減小，而抑食金球藻的種群瞬間增長(zhǎng)率(r)、進(jìn)入拐點(diǎn)時(shí)間及穩(wěn)定期細(xì)胞密度均較為接近；當(dāng)三角褐指藻與抑食金球藻以不同起始密度比共同培養(yǎng)時(shí)，抑食金球藻的生長(zhǎng)均受到了顯著地抑制(P<0.05)，但其抑制作用并未與三角褐指藻的密度呈明顯的線(xiàn)性關(guān)系；濾液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10 mL和15 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的加入可對(duì)抑食金球藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)，對(duì)其葉綠素?zé)晒鈪?shù)沒(méi)有影響(P>0.05)，25 mL和35 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的加入可對(duì)抑食金球藻的生長(zhǎng)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)均產(chǎn)生顯著的抑制作用(P<0.05)，葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、ΦPSⅡ、alpha的值降低，Ik的值增加，PSⅡ受到損害。

三角褐指藻；抑食金球藻；褐潮；化感作用

1 引言

抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)隸屬于金藻門(mén)，是一種直徑約2 μm，具有單一葉綠體、線(xiàn)粒體、細(xì)胞核和胞外多糖的微微型藻類(lèi)，其大量增殖可形成褐潮(brown tide)。自1985年在美國(guó)東海岸首次暴發(fā)以來(lái)，逐漸在全球范圍內(nèi)擴(kuò)散，1997-1999年持續(xù)在南非的薩爾達(dá)尼亞海灣暴發(fā)。我國(guó)自2009年開(kāi)始連續(xù)5年在渤海灣秦皇島附近海域定期(5-8月)發(fā)生抑食金球藻褐潮[1]；2011年起，在山東威海海域亦有暴發(fā)[2]。目前，我國(guó)是繼美國(guó)和南非之后第三個(gè)發(fā)生抑食金球藻褐潮的國(guó)家。

抑食金球藻褐潮多發(fā)生在有機(jī)氮濃度較高的近岸河口或淺海海灣，這一海域恰是開(kāi)展貝類(lèi)和魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖的重點(diǎn)區(qū)域。褐潮暴發(fā)初期，由于抑食金球藻密度顯著升高，造成海水透明度急劇下降，海藻大量死亡，破壞貝類(lèi)的重要棲息環(huán)境和產(chǎn)卵地；雖然該藻不分泌毒素，但能產(chǎn)生一種類(lèi)似多巴胺的生物活性物質(zhì)[3—4]，抑制貝類(lèi)側(cè)纖毛的活動(dòng)，從而對(duì)海灣扇貝(Argopectenirradians)[5]、藍(lán)貝(Mytilusgalloprovincialis)、貽貝(Mytilusedulis)[6—7]、文蛤(Meretrixmeretirx)和美洲簾蛤(Mercenariamercenaria)[8—9]等濾食性貝類(lèi)的攝食、生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，甚至導(dǎo)致死亡。2010年秦皇島附近海域褐潮最大暴發(fā)面積為3 350 km2，造成直接經(jīng)濟(jì)損失2.05億元[1]。褐潮的危害在我國(guó)近岸海域不斷的擴(kuò)大，亟需建立有效的褐藻應(yīng)急處置技術(shù)，以期大幅度降低對(duì)近岸貝類(lèi)養(yǎng)殖的危害。研究人員嘗試采用黏土吸附藻細(xì)胞等物理方式[10]及H2O2抑殺藻細(xì)胞等化學(xué)方法進(jìn)行消除[11]，但終因耗費(fèi)高、生態(tài)安全性低等諸多局限，均未規(guī)?；貞?yīng)用于貝類(lèi)養(yǎng)殖海域的褐潮應(yīng)急處置中，因此，尋找一種高效、生態(tài)安全性高的新型控藻技術(shù)十分必要。

微藻間的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制分為資源利用性競(jìng)爭(zhēng)、化感作用和接觸性競(jìng)爭(zhēng)，其中化感作用研究一直是微藻研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。研究表明，一些海洋藻類(lèi)在生長(zhǎng)過(guò)程中亦會(huì)不斷向周?chē)h(huán)境中釋放生物活性物質(zhì)，對(duì)其他海藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[12—13]，為通過(guò)生物手段控制抑食金球藻大量暴發(fā)提供了重要的理論基礎(chǔ)。此外，畢相東等[14]研發(fā)出一種餌料微藻濃縮液緩釋儀，使用篩選出的既能強(qiáng)烈抑制抑食金球藻生長(zhǎng)又能為養(yǎng)殖微環(huán)境中貝類(lèi)提供餌料的微藻，并將其濃縮液緩釋于貝類(lèi)養(yǎng)殖的微環(huán)境中，該技術(shù)將能夠有效降低褐潮對(duì)貝類(lèi)養(yǎng)殖的危害，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，具有廣闊的實(shí)用推廣前景。

鑒于上述理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，本研究將探討貝類(lèi)典型餌料微藻——三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)和抑食金球藻之間的相互作用，闡明三角褐指藻是否可以通過(guò)化感作用控制抑食金球藻的生長(zhǎng)、繁殖，從而篩選可高效控制抑食金球藻的化感餌料生物，為精確控制褐潮暴發(fā)提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)藻種

抑食金球藻(CCMP1984)由美國(guó)國(guó)家海洋浮游植物藻種中心(National Center for Marine Algae and Microbiota, NCMA，原為Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton, CCMP)提供，編號(hào)為1984。三角褐指藻來(lái)自中國(guó)海洋大學(xué)生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù)。

2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)用三角瓶經(jīng)HCl浸泡、反復(fù)沖洗后滅菌，備用。培養(yǎng)用海水取自青島市魯迅公園，經(jīng)沉淀、脫脂棉過(guò)濾、0.22 μm微孔濾膜抽濾后滅菌，備用。藻類(lèi)培養(yǎng)在250 mL培養(yǎng)瓶中進(jìn)行，培養(yǎng)液體積為100 mL，采用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行一次性培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如下：溫度(20±1)℃，光照60 μmol/(m2·s)，光暗周期12 h∶12 h，每天搖動(dòng)藻液3～4次，防止藻細(xì)胞附壁下沉。

2.3 藻細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法

采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)三角褐指藻和單培養(yǎng)條件下抑食金球藻的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

共培養(yǎng)體系中抑食金球藻的計(jì)數(shù)方法參考畢相東等[15]、宋林生等[16]的方法。培養(yǎng)中，每?jī)商烊? mL藻液，經(jīng)0.45 μm的纖維素濾膜過(guò)濾后，收集膜上的細(xì)胞提取DNA，然后將提取的DNA樣品進(jìn)行熒光定量PCR，獲得Ct值，將其代入已建立藻細(xì)胞對(duì)數(shù)值與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程y=-2.671x+42.134，r2=0.952，并換算出藻細(xì)胞數(shù)量。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，換算后計(jì)算抑食金球藻細(xì)胞的平均數(shù)量。

2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

2.5 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.5.1 抑食金球藻熒光定量PCR監(jiān)測(cè)技術(shù)的建立

(1) 藻細(xì)胞的收集及基因組DNA提取方法：待抑食金球藻細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定期后進(jìn)行稀釋?zhuān)棺罱K細(xì)胞密度分別為8，8×101、8×102、8×103、8×104、8×105、8×106cell/mL，收集的藻細(xì)胞作為基因組DNA提取介質(zhì)。藻細(xì)胞基因組DNA提取所用的試劑盒為T(mén)aKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0。提取流程按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

(2) 特異性熒光探針定量PCR反應(yīng)引物、反應(yīng)體系和條件參考宋林生等[16]。

(3) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：將特異性熒光探針定量PCR反應(yīng)所得的Ct值與細(xì)胞的對(duì)數(shù)值通過(guò)線(xiàn)性回歸擬合形成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程。

2.5.2 抑食金球藻的單培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

接種處于指數(shù)增長(zhǎng)期的抑食金球藻，使其起始密度分別達(dá)到1×104cell/mL、2×104cell/mL和4×104cell/mL，每個(gè)密度組設(shè)3個(gè)平行，于藻種室培養(yǎng)，每天取出藻液按2.3中所述方法對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.5.3 三角褐指藻和抑食金球藻的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

以單種培養(yǎng)作為對(duì)照，以不同起始密度的三角褐指藻(以P表示)和抑食金球藻(以A表示)進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，起始密度比分別為1∶4、1∶1和4∶1(表1)，每組設(shè)置3個(gè)平行。按照2.3中所描述的方法對(duì)兩種藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀(guān)察藻細(xì)胞密度的變化。

表1 三角褐指藻與抑食金球藻共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5.4 三角褐指藻培養(yǎng)濾液對(duì)抑食金球藻生長(zhǎng)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期、起始密度為5×104cell/mL的三角褐指藻進(jìn)行培養(yǎng)，使其達(dá)到最大環(huán)境容量；溶液經(jīng)0.22 μm的醋酸纖維素濾膜抽濾，該溶液即為三角褐指藻的培養(yǎng)液濾液，將培養(yǎng)液濾液和滅菌海水均加富至f/2培養(yǎng)基，按不同比例配制抑食金球藻培養(yǎng)液(表2)。以組①為空白對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行，均接入10 mL處于指數(shù)增長(zhǎng)期的抑食金球藻，最后的實(shí)驗(yàn)總體積均為150 mL。自接種之后起，每天同一時(shí)間取出藻液，按2.3中所述方法對(duì)抑食金球藻藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，按2.4中所描述的方法進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。

表2 三角褐指藻培養(yǎng)濾液對(duì)抑食金球藻生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.6 數(shù)據(jù)分析

2.6.1 種群瞬時(shí)增長(zhǎng)率、環(huán)境容量和生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)入拐點(diǎn)時(shí)間的計(jì)算

利用Logistic方程對(duì)微藻種群的增長(zhǎng)進(jìn)行擬合，并根據(jù)其積分形式N=K/(1+e(a-rt))用統(tǒng)計(jì)軟件SigmaPlot 12.5進(jìn)行非線(xiàn)性回歸分析，計(jì)算環(huán)境容量(K)和種群瞬時(shí)增長(zhǎng)率(r)，式中a表示曲線(xiàn)對(duì)原點(diǎn)的相對(duì)位置，其值取決于N0，N0=K/(1+ea)，t表示時(shí)間。根據(jù)公式Tp=a/r計(jì)算藻類(lèi)生長(zhǎng)曲線(xiàn)到達(dá)拐點(diǎn)的時(shí)間。

2.6.2 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010作圖。采用SPSS 17.0進(jìn)行單因子方差分析和多重比較。P<0.05被認(rèn)為是在α=0.05水平上差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 單培養(yǎng)體系中抑食金球藻的生長(zhǎng)情況

單種培養(yǎng)條件下不同起始密度抑食金球藻的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，不同起始密度抑食金球藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)均呈現(xiàn)出典型的Logistic“S”型增長(zhǎng)模式，隨著起始密度的增加，抑食金球藻種群K值顯著降低(P=0.003<0.01)，進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期和靜止期的時(shí)間亦逐漸縮短，而種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率(r)、進(jìn)入拐點(diǎn)時(shí)間(TP)及穩(wěn)定期細(xì)胞密度均較為接近。當(dāng)初始接種密度為1×104cell/mL時(shí)，種群生長(zhǎng)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間為第7天，環(huán)境容納量(K)為(5 128.989±82.762)×104cell/mL，種群內(nèi)稟增長(zhǎng)(r)為0.673(±0.057)，進(jìn)入靜止期的時(shí)間為第14.933天，生長(zhǎng)回歸方程為[N=5 128.989/(1+e(10.049-0.673 t))，×104cell/mL]。當(dāng)初始接種密度為2×104cell/mL時(shí)，種群生長(zhǎng)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間為第6天，K值為(4 667.290±147.175)×104cell/mL，r值為0.754(±0.103)，進(jìn)入靜止期的時(shí)間為第15.188天，生長(zhǎng)回歸方程為[N=4 667.290/(1+e(11.453-0.754 t))，×104cell/mL]。當(dāng)初始接種密度為4×104cell/mL時(shí)，種群生長(zhǎng)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間為第5天，K值為(4 643.836±104.583)×104cell/mL，r值為0.543(±0.044)，進(jìn)入靜止期的時(shí)間為第15.368天，生長(zhǎng)回歸方程為[N=4 643.836/(1+e(7.817-0.543 t))，×104cell/mL]。

以邏輯斯諦方程進(jìn)行擬合，各參數(shù)的估計(jì)值以及生長(zhǎng)曲線(xiàn)達(dá)到拐點(diǎn)的時(shí)間見(jiàn)表3。

表3 不同起始密度下抑食金球藻的生長(zhǎng)參數(shù)

圖1 不同起始密度下抑食金球藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1 The growth curve of A. anophageferens under differential initial densities

3.2 共培養(yǎng)體系中三角褐指藻和抑食金球藻的生長(zhǎng)及種群增長(zhǎng)特點(diǎn)

3.2.1 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果

在共培養(yǎng)體系中，抑食金球藻計(jì)數(shù)時(shí)的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)平滑，擴(kuò)增效果較好(圖2)。根據(jù)藻細(xì)胞DNA模板PCR擴(kuò)增后所得的Ct值與藻細(xì)胞數(shù)目對(duì)數(shù)值的相關(guān)系數(shù)(r2)為0.952，擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=-2.671x+42.134，可適用于本實(shí)驗(yàn)中抑食金球藻細(xì)胞數(shù)目的定量分析。

圖2 PCR檢測(cè)出熒光定量樣品ΔRn和循環(huán)數(shù)的擴(kuò)增曲線(xiàn)Fig.2 Amplification of standards from qPCR run on ABI7500 of ΔRn versus the number of cycles

圖3 不同初始接種密度比條件下三角褐指藻和抑食金球藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.3 The growth curve of P. tricornutum and A. anophageferens in the different initial densities proportion

3.2.2 共培養(yǎng)體系中三角褐指藻和抑食金球藻的生長(zhǎng)

不同初始接種密度條件下三角褐指藻和抑食金球藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。在共培養(yǎng)體系中，三角褐指藻的細(xì)胞密度均于培養(yǎng)的第16天達(dá)到最大，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(處理①、②和③的P=0.979、0.504和0.406)。抑食金球藻的生長(zhǎng)受到三角褐指藻的顯著性抑制，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的指數(shù)性增長(zhǎng)，最高細(xì)胞密度出現(xiàn)在培養(yǎng)的第16～18天，不過(guò)顯著低于對(duì)照組(處理①、②和③的P=0.01、0.00和0.009)。此外，抑食金球藻的細(xì)胞密度不受接種比例的影響(P=0.935)。

3.2.2 共培養(yǎng)體系中三角褐指藻和抑食金球藻種群增長(zhǎng)特點(diǎn)

不同接種密度條件下，共培養(yǎng)體系中三角褐指藻的環(huán)境容納量K值均出現(xiàn)顯著(P=0.000)下降，比對(duì)照組分別下降了17.40%、27.10%和21.30%，但仍然處于較高的水平(圖4)；共培養(yǎng)體系中抑食金球藻的環(huán)境容納量K值極顯著的低于對(duì)照組(P=0.000)。不同接種比例對(duì)抑食金球藻環(huán)境容納量的影響程度幾乎一致，并沒(méi)有隨著三角褐指藻接種比例的增加產(chǎn)生顯著變化(P>0.05)(圖5)。

圖4 不同初始接種密度條件下三角褐指藻的環(huán)境容納量Fig.4 The carrying capabilities of P. tricornutum at three different initial densities ratios

圖5 不同初始接種密度條件下抑食金球藻的環(huán)境容納量Fig.5 The carrying capabilities of A. anophagefferens at three different initial densities ratios

如圖6所示，共培養(yǎng)時(shí)，處理①中三角褐指藻種群的內(nèi)稟增長(zhǎng)率與單獨(dú)培養(yǎng)體系中三角褐指藻的內(nèi)稟增長(zhǎng)率之間無(wú)顯著差異(P=0.534)，當(dāng)三角褐指藻的接種密度提高后，其內(nèi)稟增長(zhǎng)率均顯著高于單獨(dú)培養(yǎng)體系，說(shuō)明兩種藻的共培養(yǎng)可能對(duì)三角褐指藻的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。抑食金球藻的種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率均受到共培養(yǎng)的顯著影響(處理①、②和③的P均為0.000)，這種共培養(yǎng)模式可以有效地抑制抑食金球藻種群的增長(zhǎng)(圖7)。不同接種比例對(duì)抑食金球藻種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率有一定的影響，當(dāng)三角褐指藻和抑食金球藻接種密度為1∶1時(shí)，抑食金球藻的種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率顯著高于其他兩種接種密度。

圖6 不同初始接種密度條件下三角褐指藻種群的內(nèi)稟增長(zhǎng)率Fig.6 The intrinsic growth rates of P. tricornutum and at three different initial densities ratios

圖7 不同初始接種密度條件下抑食金球藻種群的內(nèi)稟增長(zhǎng)率Fig.7 The intrinsic growth rates of A. anophagefferens at three different initial densities ratios

與對(duì)照相比，共培養(yǎng)體系中三角褐指藻生長(zhǎng)曲線(xiàn)到達(dá)拐點(diǎn)的時(shí)間變化不大，受到共培養(yǎng)的影響較小；抑食金球藻生長(zhǎng)曲線(xiàn)達(dá)到拐點(diǎn)的時(shí)間明顯提前，在3個(gè)處理組中均提前5 d左右(表4)，由此可知，共培養(yǎng)對(duì)抑食金球藻生長(zhǎng)的影響較大，提前進(jìn)入負(fù)加速生長(zhǎng)過(guò)程。

表4 不同培養(yǎng)體系中三角褐指藻和抑食金球藻生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)入拐點(diǎn)的時(shí)間(TP)(單位：d)

圖8 三角褐指藻培養(yǎng)濾液對(duì)抑食金球藻的生長(zhǎng)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.9 Effect of P. tricornutum culture medium filtrate on growth and fluorescence parameters of A. anophageferens

3.3 三角褐指藻培養(yǎng)濾液對(duì)抑食金球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

加入不同量的三角褐指藻培養(yǎng)濾液后對(duì)抑食金球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖8a。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，除了加入5 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的處理②組以外，其他各組對(duì)抑食金球藻的生長(zhǎng)均產(chǎn)生了不同程度的抑制作用。加入10 mL、15 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的處理③、④組抑食金球藻的細(xì)胞生長(zhǎng)速率低于對(duì)照，受到三角褐指藻培養(yǎng)濾液的抑制作用，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)細(xì)胞密度與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05)，處理③、④組間無(wú)顯著性差異(P=0.192)；分別加入25 mL、35 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的處理⑤、⑥組細(xì)胞密度并未增加，而是逐漸減少至較低水平(<10×104cell/mL)，抑食金球藻的生長(zhǎng)受到了強(qiáng)烈的抑制，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)細(xì)胞密度與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)，⑤、⑥組間無(wú)顯著性差異(P=0.933)。

三角褐指藻培養(yǎng)濾液對(duì)抑食金球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響見(jiàn)圖8b～g。單因素方差分析結(jié)果顯示：在1～7 d內(nèi)，加入5 mL、10 mL、15 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的②、③、④組各葉綠素?zé)晒鈪?shù)的值與對(duì)照組①相比基本無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明小于等于15 mL三角褐指藻濾液的加入并沒(méi)有對(duì)抑食金球藻PSⅡ造成不利影響。加入25 mL、35 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的處理⑤、⑥組各葉綠素?zé)晒鈪?shù)的值卻發(fā)生了較大程度的變化。第2天時(shí)，三角褐指藻培養(yǎng)濾液對(duì)抑食金球藻的影響凸顯出來(lái)，⑤、⑥組的Fv/Fm、ΦPSⅡ、alpha、NPQ的值下降劇烈，幾乎檢測(cè)不到熒光信號(hào)，與對(duì)照差異顯著(P<0.05)；rETRmax的值也出現(xiàn)了一定程度的下降，⑥組Ik的值大幅上升。第3～7天，⑤、⑥組的各葉綠素?zé)晒鈪?shù)的值逐漸向正常水平恢復(fù)，但培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，F(xiàn)v/Fm、ΦPSⅡ、alpha、NPQ仍顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，⑥組Ik的值仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

4 討論

海洋中一種或幾種浮游植物大量繁殖，占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)時(shí)，往往會(huì)暴發(fā)赤潮災(zāi)害。迄今為止，赤潮是人類(lèi)社會(huì)面臨的最為嚴(yán)重的海洋生態(tài)災(zāi)害和社會(huì)經(jīng)濟(jì)問(wèn)題之一。很多學(xué)者從外界環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)鹽、關(guān)鍵物理海洋過(guò)程等角度探討了赤潮暴發(fā)機(jī)制，研究日趨完善。然而在復(fù)雜的自然條件下，一些非赤潮種類(lèi)可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)鹽競(jìng)爭(zhēng)來(lái)抑制赤潮的暴發(fā)，這種競(jìng)爭(zhēng)對(duì)浮游植物種群數(shù)量的消長(zhǎng)、群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定以及演替均有重要的作用[17—21]。不同種群之間的競(jìng)爭(zhēng)不僅受營(yíng)養(yǎng)鹽的限制，種間的化感作用對(duì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果也有重要影響，基于該理論，現(xiàn)已開(kāi)展了大量大型藻類(lèi)與赤潮種類(lèi)[22]、有益種類(lèi)與赤潮種類(lèi)以及赤潮種類(lèi)間的化感作用的研究工作[23—26]。為了研究三角褐指藻和抑食金球藻之間的競(jìng)爭(zhēng)作用，本研究進(jìn)行了三角褐指藻與抑食金球藻的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)以及濾液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

4.1 共培養(yǎng)對(duì)兩種藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響

通過(guò)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)可以看出，共培養(yǎng)并未對(duì)三角褐指藻的生長(zhǎng)及細(xì)胞密度產(chǎn)生影響，卻顯著抑制了抑食金球藻的生長(zhǎng)，其環(huán)境容納量、瞬時(shí)增長(zhǎng)率均顯著下降，生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)入拐點(diǎn)時(shí)間明顯提前，抑食金球藻種群衰落的較快。將三角褐指藻和塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtarmarense)共培養(yǎng)后，二者的生長(zhǎng)均受到一定程度的抑制作用，不過(guò)對(duì)三角褐指藻的影響尤為嚴(yán)重，共培養(yǎng)造成其線(xiàn)粒體、葉綠體受到嚴(yán)重?fù)p壞，并在分子水平上抑制能量代謝、TCA循環(huán)以及碳固定等基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平[27]，培養(yǎng)后期，塔瑪亞歷山大藻的生長(zhǎng)開(kāi)始出現(xiàn)輕微下降，可能與三角褐指藻在細(xì)胞裂解時(shí)釋放的生物活性物質(zhì)有關(guān)。張珍萍[28]指出，三角褐指藻濾出液可以有效的抑制東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)的生長(zhǎng)，隨著其濾出液濃度的升高，對(duì)東海原甲藻細(xì)胞密度的抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，在第10天的細(xì)胞凈增率減小了99%。另外，瑪氏骨條藻(Skeletonemamarinoi)具有產(chǎn)生多不飽和醛(PUA)及其他氧化酯類(lèi)等生物活性物質(zhì)的能力，這些物質(zhì)能誘導(dǎo)藻類(lèi)的微管蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，從而抑制共培養(yǎng)種類(lèi)的生長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)中，共培養(yǎng)對(duì)三角褐指藻也產(chǎn)生了一定的影響，但影響相對(duì)較小，其競(jìng)爭(zhēng)力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于抑食金球藻，在競(jìng)爭(zhēng)中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。由此可見(jiàn)，藻類(lèi)的競(jìng)爭(zhēng)力不僅受與之共培養(yǎng)種類(lèi)的影響，而且與受試藻類(lèi)對(duì)化感物質(zhì)的耐受力有密切關(guān)系。

通常，化感物質(zhì)的作用程度與共培養(yǎng)的兩種藻類(lèi)的密度有關(guān)，受試藻類(lèi)的密度越高，化感作用的程度越低，在低于能夠產(chǎn)生抑制作用的臨界濃度時(shí)，化感物質(zhì)對(duì)受試藻類(lèi)不會(huì)表現(xiàn)出抑制作用。本研究中，抑食金球藻受三角褐指藻的抑制作用并未隨接種密度的變化而發(fā)生顯著的變化，說(shuō)明，三角褐指藻和抑食金球藻在最低密度比(1∶4)時(shí)，三角褐指藻分泌的化感物質(zhì)的有效濃度遠(yuǎn)在臨界濃度之上，至于其化感物質(zhì)主要成分、臨界濃度等還需進(jìn)一步的研究。

4.2 三角褐指藻培養(yǎng)濾液對(duì)抑食金球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

化感物質(zhì)可對(duì)植物的光合作用產(chǎn)生影響，并主要通過(guò)降低藻類(lèi)的葉綠素a和藻膽蛋白含量、破壞PSⅡ等方面對(duì)藻類(lèi)的光合作用產(chǎn)生影響，使其無(wú)法通過(guò)正常的光合作用獲得物質(zhì)和能量，從而進(jìn)一步殺死藻細(xì)胞，使藻類(lèi)細(xì)胞數(shù)量顯著減少，生長(zhǎng)受到抑制[29]。腸滸苔(Enteromorphaintestinalis)水相提取物可以抑制赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)和海洋原甲藻(Prorocenrummicans)的生長(zhǎng)；K?rner和Nicklisch[20]研究發(fā)現(xiàn)穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)分泌的化感物質(zhì)能抑制多種藍(lán)細(xì)菌、綠藻和硅藻的PSⅡ和生長(zhǎng)；金魚(yú)藻(Ceratophyllumdemersum)分泌的化感物質(zhì)能抑制藻類(lèi)和藍(lán)細(xì)菌的PSⅡ及生長(zhǎng)。大多數(shù)植物化感物質(zhì)會(huì)對(duì)PSⅡ產(chǎn)生影響，主要表現(xiàn)在影響質(zhì)體醌QA再氧化速率和初級(jí)光能捕獲，使光合系統(tǒng)Ⅱ活性中心失活，使單元結(jié)構(gòu)從系統(tǒng)中分離[30]。

Fv/Fm是PSⅡ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，反映PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)換效率，一般比較穩(wěn)定，但在脅迫條件下該參數(shù)明顯下降。本研究中，當(dāng)三角褐指藻濾液加入量小于25 mL時(shí)，抑食金球藻Fv/Fm與對(duì)照并無(wú)差異；當(dāng)其濾液加入量大于等于25 mL，在培養(yǎng)的第2天開(kāi)始，其Fv/Fm均出現(xiàn)顯著下降，直至培養(yǎng)結(jié)束，兩處理組Fv/Fm的值也沒(méi)有恢復(fù)到正常水平，這期間細(xì)胞密度也沒(méi)有出現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)而是逐漸降低，這說(shuō)明PSⅡ已受到損害并且不可恢復(fù)，導(dǎo)致藻細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行正常的光合作用，進(jìn)而抑制抑食金球藻的生長(zhǎng)，直至死亡。

加入25 mL以上的三角褐指藻培養(yǎng)濾液的組別，接種后第2天抑食金球藻實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量ΦPSⅡ出現(xiàn)顯著下降，它反映了PSⅡ反應(yīng)中心在有部分關(guān)閉情況下實(shí)際原初光能捕獲效率，ΦPSⅡ的降低說(shuō)明三角褐指藻濾液阻止抑食金球藻細(xì)胞同化力(NADPH, ATP)的形成，影響藻類(lèi)對(duì)碳的固定與同化，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)?？焖俟馇€(xiàn)的初始斜率Alpha，反映了植物對(duì)光能的捕獲能力，Alpha的降低表明三角褐指藻濾液可以抑制抑食金球藻細(xì)胞對(duì)光能的利用效率，同時(shí)，三角褐指藻濾液也可降低抑食金球藻的光保護(hù)能力，非光化學(xué)淬滅NPQ的降低就很好地說(shuō)明了這一點(diǎn)。最小飽和光強(qiáng)Ik代表的是植物對(duì)強(qiáng)光的耐受能力，Ik的升高，與植物對(duì)強(qiáng)光的耐受能力有關(guān)，⑥組Ik的上升說(shuō)明35 mL三角褐指藻藻濾液的加入可以在一定程度上增強(qiáng)抑食金球藻細(xì)胞對(duì)強(qiáng)光的耐受能力。

加入三角褐指藻培養(yǎng)濾液可以有效的影響抑食金球藻的細(xì)胞密度及PSⅡ的相應(yīng)葉綠素?zé)晒鈪?shù)，表明三角褐指藻對(duì)抑食金球藻的抑制作用是通過(guò)分泌活性物質(zhì)來(lái)完成的，在后續(xù)的研究中應(yīng)搞清其抑制作用的臨界濃度，化感物質(zhì)的主要成分，化感作用的應(yīng)用方面還需要進(jìn)行更多的現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)。

5 結(jié)論

三角褐指藻和抑食金球藻的共培養(yǎng)可以有效的抑制抑食金球藻的生長(zhǎng)，且與接種比例無(wú)關(guān)，抑食金球藻種群的環(huán)境容納量和內(nèi)稟增長(zhǎng)率均受到一定的影響；當(dāng)抑食金球藻的培養(yǎng)基中包含低濃度(10 mL、15 mL)的三角褐指藻培養(yǎng)濾液時(shí)，抑食金球藻的生長(zhǎng)被顯著的抑制，但對(duì)其葉綠素?zé)晒鈪?shù)沒(méi)有影響；當(dāng)其培養(yǎng)基中包含較高濃度(25 mL、35 mL)三角褐指藻培養(yǎng)濾液時(shí)，抑食金球藻PSⅡ系統(tǒng)受到不可恢復(fù)的損害，藻細(xì)胞逐漸死亡。因此，三角褐指藻通過(guò)釋放生物活性物質(zhì)對(duì)抑食金球藻產(chǎn)生化感抑制作用，其化感物質(zhì)成分、濃度及在實(shí)際中的應(yīng)用需要進(jìn)一步研究。

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Study on the competition and allelopathy betweenPhaeodactylumtricornutumandAureococcusanophagefferens

Zhang Dajuan1, Zhang Xinghua2, Tang Xuexi2, Bi Xiangdong1,4, Song Lun3, Zhang Shulin1

(1.DepartmentofFisheriesSciences,TianjinAgriculturalUniversity,KeyLabortaryofAqua-ecologyandAquacultureofTianjin,Tianjin300384,China; 2.CollegeofMarineLifeScience,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China; 2.LiaoningOceanandFisheriesScienceResearchInstitute,Dalian116023,China;CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)

To clarify whetherPhaeodactylumtricornutumhad allelopathy effect onAureococcusanophagefferens, we studied the interaction betweenP.tricornutumandA.anophagefferensand the impacts ofP.tricornutumculture media filtrate onA.anophagefferensgrowth and on chlorophyll fluorescence under laboratory conditions. The results show that,P.tricornutumhas allelopathy effect onA.anophagefferens. In the mono-culture, the proliferation ofA.anophagefferensfollowed the Logistic model, and its initial cell density affected significantly the environmental-carrying capacity (K) of algal populations; andKvalues decreased gradually with the increase of initial cell densities.In the co-culture, the growth ofA.anophagefferenswas inhibited significantly (P<0.05) byP.tricornutumof different algal initial cell densities, but the inhibitory effect changed indistinctively with the increase ofP.tricornutumproportion. In the filtrate cultivation experiment ofA.anophagefferens, we found that:P.tricornutumfiltrate at 10 mL or 15 mL could remarkably inhibite the growth ofA.anophagefferens(P<0.05) with no effect on its chlorophyll fluorescence;P.tricornutumfiltrate at 25 mL and 35 mL could cause PSⅡ irreversible damage (Fv/Fm, ΦPSⅡ, alpha, NPQ values reduced) and death ofA.anophagefferens.

Phaeodactylumtricornutum;Aureococcusanophagefferens; brown tide; allelopathy

10.3969/j.issn.0253-4193.2017.06.009

2016-09-26；

2016-12-05。

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31300393)；中國(guó)海洋發(fā)展研究會(huì)重點(diǎn)項(xiàng)目(CAMAZDA201605)；遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014020182)；天津市科技支撐重點(diǎn)項(xiàng)目(15ZCZDNC00230)；中國(guó)博士后科學(xué)基金特別資助(2015T80212)；天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(TJAE201501)。

張達(dá)娟(1981—)，女，天津市人，博士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事浮游生物生理生態(tài)學(xué)研究。E-mail：dajuanzhang@163.com

*通信作者：畢相東(1980—)，男，遼寧省大連市人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事水域生態(tài)學(xué)研究。E-mail：yl801123@aliyun.com

Q948.8

A

0253-4193(2017)06-0084-11

張達(dá)娟，張興華，唐學(xué)璽，等. 三角褐指藻與抑食金球藻的競(jìng)爭(zhēng)及化感作用研究[J].海洋學(xué)報(bào)，2017，39(6)：84—94,

Zhang Dajuan, Zhang Xinghua, Tang Xuexi, et al. Study on the competition and allelopathy betweenPhaeodactylumtricornutumandAureococcusanophagefferens[J]. Haiyang Xuebao，2017，39(6)：84—94, doi:10.3969/j.issn.0253-4193.2017.06.009