李昭君

【中圖分類號】R373 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）05-0-01

1.前言

在當(dāng)今時代，對基因突變進行治療，必須依靠基因編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是繼ZFN和TALEN技術(shù)之后迅速發(fā)展起來的第3代基因組編輯技術(shù)。該系統(tǒng)的核心由Cas9蛋白以及單鏈引導(dǎo)RNA（sgRNA）組成。CRISPR/Cas系統(tǒng)要發(fā)揮功能必須滿足兩個條件：一個是SgRNA與靶點DNA序列按照堿基互補原則配對；另一個是在與SgRNA配對的靶序列3'端必須緊跟PAM序列。CRISPR/Cas系統(tǒng)靶向新的靶點只需要合成新的SgRNA，操作簡便，效率高，在基因編輯領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。

2.實驗?zāi)康?/p>

單純孢疹病毒（HSV）的感染十分普遍，分為HSV-1和HSV-2，其中HSV-1是一種嗜神經(jīng)病毒，主要引起生殖器以外的皮膚，粘膜和器官包括腦的感染。而HSV-1是一種DNA病毒，因此可以利用CRISPR Cas9嘗試解決，從病毒的復(fù)制出發(fā)，剪切病毒DNA復(fù)制過程中的重要位點，可以達到抑制病毒復(fù)制的目的，這也為后來利用CRISPRCas9治療其他更復(fù)雜危害性更大的病毒性疾病提供參考。

3.實驗原理

3.1 CRISPRCAS/9原理

CRISPR/Cas9依賴于crRNA或sgRNA上的20個堿基的向?qū)蛄信c目的DNA，以及PAM（NGG）序列決定切割位點的特異性。sgRNA的設(shè)計和選擇是Crispr-Cas9技術(shù)的精髓，也是實驗是否成功的關(guān)鍵一步。sgRNA決定了Cas9的靶向性和特異性[3]。對于目前廣泛應(yīng)用的土壤農(nóng)桿菌系統(tǒng)來說：sgRNA序列的3‘端必須是NGG序列（例如：5′GTCACCTCCAATGACTAGGGNGG-3′），Cas9會在PAM序列5‘端大約3bp處對DNA序列進行切割。

3.2 sgRNA設(shè)計

3.2.1 設(shè)計原則

（1）對于sgRNA的長度，一般應(yīng)為20nt左右；

（2）對于sgRNA序列的堿基組成，可選3'末端含GG的sgRNA，同時sgRNA種子序列盡量避免以4個以上的T結(jié)尾，GC%含量最佳為40%～60%；

（3）sgRNA的種子序列與脫靶位點的匹配數(shù)盡可能低。

另外SgRNA的活性與CRISPR系統(tǒng)的突變效率直接相關(guān)，所以在著手進行基因編輯前，設(shè)計并找到有活性的靶點至關(guān)重要，通常在設(shè)計特異性靶點后，需要進行體外細胞活性篩選，篩選出有效的靶點用于后續(xù)實驗。

3.2.2 靶序列的選擇

根據(jù)提供的物種、基因名稱或者基因ID在NCBI中進行查找，找到該基因CDS區(qū)[4]，分析相應(yīng)的基因組結(jié)構(gòu)，明確CDS的外顯子部分。按照基因本身的性質(zhì)，選擇候選的待敲除位點，確定待敲除位點。對于蛋白編碼基因，如果該蛋白具重要結(jié)構(gòu)功能域，可考慮將基因敲除位點設(shè)計在編碼該結(jié)構(gòu)域的外顯子；如果不能確定基因產(chǎn)物性質(zhì)，可選擇將待敲除位點放在起始密碼子ATG后的外顯子上。確定待敲除位點后，選擇23-至250bp的外顯子序列輸入到在線免費設(shè)計sgRNA的軟件Input框中，然后進行設(shè)計運算，軟件會自動輸出sgRNA序列。

4.實驗步驟

4.1 CDS區(qū)域的選擇

HSV-1基因組為152kb的線性雙鏈DNA，在宿主細胞核內(nèi)以級聯(lián)反應(yīng)的方式表達病毒蛋白。根據(jù)基因表達時序的不同，HSV-1基因可分為立即早期基因（IE）、早期基因（E）、和晚期基因。立即早期基因轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)在病毒的DNA復(fù)制之前，立即早期基因轉(zhuǎn)錄后，激活隨后的早期基因和晚期基因，引起病毒的復(fù)制及感染。

其中，ICP27蛋白就屬于立即早期基因編碼的蛋白之一[5]，在HSV-1生命周期的IE期產(chǎn)生，主要調(diào)節(jié)病毒和宿主細胞mRNA的合成與成熟，敲除ICP27可阻斷HSV-1病毒的復(fù)制，是HSV-1復(fù)制必需的高保守蛋白，而且與其他孢疹病毒的基因產(chǎn)物存在較高的同源性。因此我們決定將Crispr的靶序列定位在編碼ICP27蛋白的編碼區(qū)（CDS區(qū)域）。

我們通過NCBI網(wǎng)站查找ICP27的編碼區(qū)

（1）首先通過查找HSV-1之后查找ICP27蛋白

（2）在出現(xiàn)的搜索結(jié)果中選擇HSV-1的ICP27蛋白，然后查看該結(jié)果

（3）在出現(xiàn)的HSV-1的ICP27蛋白的信息中選擇CDS，單擊，然后點擊右下角的FASTA，最終得到ICP27蛋白的CDS區(qū)的堿基序列，根據(jù)ICP27蛋白的CDS區(qū)的堿基序列設(shè)計sgRNA。

4.2 目標(biāo)序列選取

運行http：//crispr.mit.edu/網(wǎng)址，將編碼ICP27蛋白的CDS序列分段輸入到在線免費設(shè)計sgRNA的軟件Input框中，然后進行設(shè)計運算，軟件會按照分數(shù)由高到低自動輸出目標(biāo)序列，從中選取分數(shù)最高，脫靶最少的目標(biāo)序列進行設(shè)計。通過比較分析，選出了一條得分最高99分，脫靶最少為4的最佳目標(biāo)序列，即GATACTCGACGCCGCTCGCCCGG

4.3 合成sgRNA序列，構(gòu)建表達載體

4.3.1 表達載體的構(gòu)建

我們的標(biāo)記基因?qū)⑦x用EGFP（增強綠色熒光蛋白），選擇基因選用Puro（嘌呤霉素），以此來構(gòu)建載體，將合成的sgRNA序列導(dǎo)入到質(zhì)粒中，進而導(dǎo)入到細胞中，進行驗證。

5.結(jié)語

CRISPR-Cas9設(shè)計簡單、應(yīng)用靈活、操作簡便，在敲除細胞表面受體和切割病毒基因組、抑制病毒復(fù)制中有顯著效果。因此下一步我們將驗證我們所設(shè)計的SgRNA是否有效?？梢哉f，在未來臨床應(yīng)用以及基因治療中還有很長的一段路要走，比如提高Cas9編輯的準(zhǔn)確性，避免脫靶現(xiàn)象出現(xiàn)等等。研究人員需要不斷優(yōu)化系統(tǒng)，降低脫靶效應(yīng)，提高Cas9基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等。CRISPR-Cas9作為新的基因編輯技術(shù)，在慢性病毒感染或潛伏病毒感染疾病中具有巨大的潛在科學(xué)研究和臨床治療意義。