孫文采

DOI：10.16660/j.cnki.1674-098X.2017.11.244

摘 要：基因組靶向修飾效率低是目前基因治療的難題之一。近年來(lái)基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，為克服這一難題提供了新的途徑。鋅指核酸酶（ZFNs）、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）或規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas9）技術(shù)可以對(duì)DNA進(jìn)行雙鏈切割，通過(guò)細(xì)胞的同源重組修復(fù)機(jī)制，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)靶基因進(jìn)行高效的定點(diǎn)修飾。該文主要針對(duì)這三種基因修飾工具，分別對(duì)其作用原理，在動(dòng)物細(xì)胞基因定點(diǎn)修飾中的應(yīng)用及其局限性進(jìn)行綜述，以期為構(gòu)建動(dòng)物疾病模型，治療遺傳疾病提供新思路。

關(guān)鍵詞：基因定點(diǎn)修飾 基因治療 ZFNs TALENs CRISPR/Cas9

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2017）04（b）-0244-02

基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)是指利用基因工程的方法對(duì)基因組進(jìn)行靶向改造的技術(shù)?；蚪M定點(diǎn)修飾技術(shù)為畜牧基因的改良、基因功能的研究以及遺傳性疾病治療提供了有力的工具，因此該技術(shù)對(duì)于構(gòu)建動(dòng)物疾病模型，治療遺傳疾病都具有重要的意義。基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了一個(gè)漫長(zhǎng)過(guò)程。起初，科學(xué)家們通過(guò)同源重組的方法進(jìn)行基因組修飾，但是自然條件下發(fā)生同源重組的幾率非常低，只有10-6 [1]。為了提高基因組定點(diǎn)修飾的效率，科學(xué)家們建立了Cre/loxP[2]、PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)[3]，PhiC31整合酶系統(tǒng)[4]等方法。Cre/loxP可以進(jìn)行條件性基因敲除或者敲入，目前主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的制備，但是首先要在基因組中插入loxP序列，如何提高loxP插入的效率仍然是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和PhiC31整合酶系統(tǒng)都可以實(shí)現(xiàn)外源基因的特異性整合，但是PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)會(huì)破壞細(xì)胞的內(nèi)源基因，而PhiC31整合酶系統(tǒng)不能進(jìn)行定點(diǎn)整合。近年來(lái)興起的基因修飾技術(shù)如鋅指核酸酶（ZFNs）、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）或規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas9）技術(shù)，克服了先前基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)的缺陷，可以對(duì)DNA進(jìn)行雙鏈切割，通過(guò)細(xì)胞的同源重組修復(fù)機(jī)制，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)靶基因進(jìn)行高度特異和高效的定點(diǎn)修飾，為動(dòng)物細(xì)胞基因組的定點(diǎn)修飾提供了新的途徑。該文就這三種基因修飾方法的作用原理、在動(dòng)物基因組定點(diǎn)修飾中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并分別剖析了其應(yīng)用局限性，展望了這三大基因組修飾系統(tǒng)的應(yīng)用前景，以期為構(gòu)建動(dòng)物疾病模型，治療遺傳疾病提供新思路。

1 鋅指核酸酶（ZFNs）

1.1 ZFNs的作用原理

鋅指核酸酶單體主要包括兩部分：位于C末端的核酸酶結(jié)構(gòu)域FokI和位于N端的特異性識(shí)別DNA的鋅指蛋白 （zinc fnger protein， ZFP）。ZFP通常由3～6個(gè)鋅指組成折疊形成ββα的二級(jí)結(jié)構(gòu)，每個(gè)鋅指能夠識(shí)別基因組中3bp長(zhǎng)的DNA序列，因此單個(gè)ZFN可以識(shí)別9～18個(gè)堿基。當(dāng)兩個(gè)鋅指核酸酶單體分別與基因組中的特定序列結(jié)合且兩個(gè)鋅指核酸酶單體的分子間距在6～8bp時(shí)，F(xiàn)okI會(huì)形成二聚體發(fā)揮DNA切割活性。將DNA雙鏈切斷形成雙鏈斷裂切口。細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)DNA修復(fù)機(jī)制，主要包括非同源重組末端連接修復(fù)和DNA同源重組修復(fù)。前者會(huì)造成靶位點(diǎn)附近小片段的隨機(jī)插入或者缺失引起基因敲除；后者可以實(shí)現(xiàn)基因的敲入或者敲除。

1.2 ZFNs在動(dòng)物細(xì)胞基因定點(diǎn)修飾中的應(yīng)用及其局限性

目前，鋅指核酸酶已經(jīng)在人類(lèi)胚胎干細(xì)胞、果蠅、斑馬魚(yú)、大鼠、小鼠模式動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)了基因組的定點(diǎn)修飾。同時(shí)，鋅指核酸酶在遺傳疾病治療中也發(fā)揮了重要作用。2005年，美國(guó)的Sangamo公司利用鋅指核酸酶對(duì)免疫缺陷相關(guān)基因Il2Rγ進(jìn)行了定點(diǎn)修復(fù)。Sangamo公司利用鋅指核酸酶實(shí)現(xiàn)了CCR5基因的定點(diǎn)修飾，從而提高T淋巴細(xì)胞對(duì)HIV病毒的抵抗力。2011年，Soldner等利用鋅指核酸酶對(duì)α-synuclein的點(diǎn)突變位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)修飾，從而對(duì)帕金森疾病進(jìn)行疾病治療。同年，Yusa利用鋅指核酸酶造成DNA雙鏈斷裂然后利用同源重組的方法將α1-抗胰蛋白酶導(dǎo)入到細(xì)胞中在小鼠中實(shí)現(xiàn)了α1-抗胰蛋白酶缺陷引起的肝病的基因治療。2014年，Genovese等利用鋅指核酸酶在造血干細(xì)胞中插入Il2RG基因的cDNA，在免疫缺陷小鼠中重建造血系統(tǒng)。鋅指核酸酶在基因治療中發(fā)揮了重要作用，但是該技術(shù)本身仍然存在局限性，比如構(gòu)建難，周期長(zhǎng)，價(jià)格昂貴以及脫靶會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性。這些局限性限制了鋅指核酸酶在基因治療中的廣泛應(yīng)用。

2 類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）

2.1 TALENs的作用原理

TALENs的構(gòu)造類(lèi)似于ZFN，主要是由DNA結(jié)合域和分子剪刀“Fok I”組成。不同的是：TALENs的DNA結(jié)合域是一段很長(zhǎng)的重復(fù)氨基酸序列，是由1.5～33.5個(gè)TALE單元組成。每個(gè)TALE單元包括33～35個(gè)氨基酸組成，不同的TALE單元之間只有12，13位的氨基酸是不同的，其決定DNA堿基的識(shí)別點(diǎn)。目前為止，只有五種TALEN單元，其余DNA的對(duì)應(yīng)關(guān)系分別為：氨基酸HD特異識(shí)別堿基C、氨基酸NI特異識(shí)別堿基A、氨基酸NN特異識(shí)別堿基G或A、氨基酸NG特異識(shí)別堿基T、氨基酸NK可以識(shí)別堿基A、T、C、G中的任一種。因此，TALE單元與DNA堿基之間有更好地對(duì)應(yīng)關(guān)系。每個(gè)TALEN單體識(shí)別的靶序列長(zhǎng)度一般在14～20個(gè)堿基，因此相比于ZFN，TALENs識(shí)別靶點(diǎn)的特異性更強(qiáng)，脫靶率更低。TALENs的工作原理類(lèi)似于ZFNs，當(dāng)FokI 形成二聚體時(shí)切開(kāi)DNA雙鏈，F(xiàn)okI的切割位點(diǎn)位于兩個(gè)TALEN單體識(shí)別的靶標(biāo)序列之間，此間隔一般在15～30 bp之間。DNA雙鏈斷裂后，細(xì)胞啟動(dòng)修復(fù)體制，利用同源重組或者非同源重組末端連接修復(fù)進(jìn)行基因修飾。

2.2 TALENs在動(dòng)物細(xì)胞基因定點(diǎn)修飾中的應(yīng)用及其局限性

目前為止，TALENs不僅在果蠅、蛔蟲(chóng)、斑馬魚(yú)、青蛙、大鼠和豬等模式動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)了基因組的定點(diǎn)編輯，而且在斑馬魚(yú)和人的基因組中實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)插入。2012年，Sun利用TALENs和同源片段對(duì)缺陷型β珠蛋白基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾，使其恢復(fù)到正常序列，進(jìn)而治療鐮刀型紅細(xì)胞病。2013年，Wang等利用TALENs對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞基因組進(jìn)行修飾，獲得了Sry和Uty的突變的基因修飾小鼠。2014年，Liu等利用TALENs技術(shù)在猴的身上成功實(shí)現(xiàn)了Rett綜合征和孤獨(dú)癥相關(guān)的基因Mecp2的突變。2014年，Park等利用TALENs技術(shù)在hiPSC中成功將含有F8基因的140 kb染色體片段倒置。2015年，Menger等在特異性識(shí)別巨細(xì)胞病毒的T細(xì)胞中利用TALEN敲除糖皮質(zhì)激素受體的基因，提高了造血干細(xì)胞移植的存活率。TALENs技術(shù)相比于ZFNs有一定的優(yōu)勢(shì)，但是其本身仍然存在一些問(wèn)題尚未解決，比如：TALENs重復(fù)序列在什么長(zhǎng)度下活性最高，識(shí)別特異性最好；TALENs的脫靶率和細(xì)胞毒性雖然比ZFNs小但是仍未得到徹底解決。

3 規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas9）

3.1 CRISPR/Cas9的作用原理

CRISPR/Cas9的結(jié)構(gòu)主要包括三部分：trans-activating crRNA（tracrRNA）、DNA內(nèi)切酶Cas9蛋白編碼基因和CRISPR RNAs（crRNA）基因座。CRISPR主要由25～50 bp的同向重復(fù)序列（repeat）和26～72 bp的間隔序列（spacer）構(gòu)成，其中重復(fù)序列被間隔序列間隔。CRISPR/Cas9的作用機(jī)制為：外源DNA作為短的回文重復(fù)序列整合在CRISPR基因組中，在RNaseIII催化作用下加工成熟，和tracrRNA通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，共同指導(dǎo)Cas9蛋白在與crRNA引導(dǎo)序列互補(bǔ)的位點(diǎn)進(jìn)行DNA雙鏈切割，造成雙鏈斷裂。細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)DNA相應(yīng)的修復(fù)模式。與ZFN和TALEN等相比，CRISPR/Cas9具有打靶效率高、操作簡(jiǎn)單、成本低、適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。

3.2 CRISPR/Cas9在動(dòng)物細(xì)胞基因定點(diǎn)修飾中的應(yīng)用及其局限性

目前，CRISPR/Cas9已經(jīng)在多種細(xì)胞和模式動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)了基因組修飾。2013年，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人類(lèi)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因組的靶向修飾。隨后，Wang 和Yang等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)多基因的同時(shí)修飾，獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。2014年，Xie等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功的矯正了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞基因組中人β血紅蛋白基因的突變，為β地中海貧血病的基因治療提供了一種有效的策略。同年，F(xiàn)eng等利用CRISPR/Cas9定點(diǎn)敲除與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因CDK11，成功抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。2014年，Yin等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小鼠中成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)突變基因FAH的糾正修復(fù)，為遺傳酪氨酸血癥的基因治療提供了有效方法。2015年，Yang等利用CRISPR-Cas9技術(shù)在豬基因組中將包括豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERV）的病毒在內(nèi)的62個(gè)重復(fù)的基因失活，促進(jìn)了異種器官移植的進(jìn)一步發(fā)展。CRISPR-Cas9基因組修飾技術(shù)對(duì)基因治療的發(fā)展具有重要意義，但是其本身仍然存在一些問(wèn)題沒(méi)有解決。比如：CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)真核生物是否存在細(xì)胞毒性？CRISPR/Cas9未來(lái)如何在整體水平進(jìn)行應(yīng)用？

4 展望

基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用均有重大意義。ZFN、TALEN、CRISPR等新興的基因編輯技術(shù)使基因敲除和插入技術(shù)變得更為簡(jiǎn)便快捷，這對(duì)研究基因功能和實(shí)現(xiàn)基因治療非常重要。目前，許多模式動(dòng)物的單基因疾病模型尚未建立，利用這些新興技術(shù)在模式動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行基因敲除或者定點(diǎn)修飾，對(duì)于研究該基因的功能和某些疾病的致病機(jī)理具有重要意義；另一方面，基因治療是根治遺傳性疾病的最直接的辦法，但是由于同源重組效率低下，基因組修飾技術(shù)不夠完善，阻礙了這一治療方法的廣泛應(yīng)用。近年新興的這三大基因組修飾系統(tǒng)都大大提高了基因編輯的效率，為人類(lèi)疾病的治療帶來(lái)嶄新的機(jī)遇。在今后的發(fā)展中，如果能夠針對(duì)這些基因編輯工具引起的免疫反應(yīng)和脫靶效應(yīng)建立安全、有效的檢測(cè)手段；減弱細(xì)胞毒性；優(yōu)化基因?qū)胂到y(tǒng)，一定能夠極大地促進(jìn)基因治療的廣泛應(yīng)用。雖然這些基因修飾技術(shù)仍然存在許多問(wèn)題，但是相關(guān)研究的最新進(jìn)展表明該技術(shù)的應(yīng)用將漸趨成熟，發(fā)展也更全面。利用這些技術(shù)開(kāi)展的基因治療將會(huì)對(duì)腫瘤及人類(lèi)遺傳性疾病的治療帶來(lái)重大影響。

參考文獻(xiàn)

[1] Cathomen T， Joung JK. Zinc-finger nucleases： the next generation emerges. Molecular therapy[J].The journal of the American Society of Gene Therapy， 2008（16）：1200-1207.

[2] Du ZW， Hu BY， Ayala M， Sauer B， Zhang SC. Cre recombination-mediated cassette exchange for building versatile transgenic human embryonic stem cells lines[J]. Stem Cells，2009（27）：1032-1041.

[3] Chen YT， Furushima K， Hou PS， Ku AT， Deng JM， Jang CW， et al. PiggyBac transposon-mediated， reversible gene transfer in human embryonic stem cells[J]. Stem cells and development，2010（19）：763-771.

[4] Monetti C，Nishino K，Biechele S， Zhang P，Baba T，Woltjen K，et al. PhiC31 integrase facilitates genetic approaches combining multiple recombinases[J].Methods，2011（53）：380-385.