母胎界面維生素D受體表達(dá)與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)相關(guān)及可能的機(jī)制

閆春芳，閆曉婷，惠凌云，王 麗，白 娥，于學(xué)文

(1.西安市第四醫(yī)院生殖中心，陜西 西安710004；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，陜西 西安710061)

母胎界面維生素D受體表達(dá)與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)相關(guān)及可能的機(jī)制

閆春芳1，閆曉婷2，惠凌云2，王 麗2，白 娥2，于學(xué)文2

(1.西安市第四醫(yī)院生殖中心，陜西 西安710004；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，陜西 西安710061)

目的 探討母胎界面維生素D受體(VDR)表達(dá)與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)及胎盤激素的關(guān)系。方法 2014年7月至2014年9月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收集復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者和正常早孕婦女絨毛和蛻膜組織，采用熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(FQ-PCR)檢測兩組絨毛組織和蛻膜組織中VDR及絨毛膜促性腺激素受體、雌激素受體和孕激素受體mRNA的含量，比較兩組表達(dá)的差異。結(jié)果 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組絨毛組織中VDR、絨毛膜促性腺激素受體、雌激素受體mRNA相對水平低于對照組(t值分別為4.86、6.16、2.39，均P<0.05)；絨毛膜促性腺激素受體和雌激素受體mRNA的表達(dá)水平與VDR表達(dá)水平明顯正相關(guān)(F=10.21，P=0.01；F=14.52，P=0.00)。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組蛻膜組織中VDR、絨毛膜促性腺激素受體、雌激素受體mRNA相對水平也低于對照組(t值分別為5.28、2.34、2.60，均P<0.05)。結(jié)論 母胎界面VDR mRNA表達(dá)水平與早期自然流產(chǎn)相關(guān)，絨毛組織絨毛膜促性腺激素受體和雌激素受體mRNA的表達(dá)水平與VDR表達(dá)水平有一定的相關(guān)性。但是VDR導(dǎo)致自然流產(chǎn)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)；維生素D受體；母胎界面；絨毛膜促性腺激素受體；雌激素受體

自然流產(chǎn)是妊娠早期常見的并發(fā)癥之一，其病因復(fù)雜，除遺傳、生殖道解剖、內(nèi)分泌、感染、創(chuàng)傷、免疫等明確原因外，仍有大約50%原因不明[1]，因此對其治療也存在一定局限性和有效性。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)維生素D作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，除具有經(jīng)典的鈣磷調(diào)節(jié)作用之外，其非經(jīng)典的免疫調(diào)節(jié)作用也越來越受到重視，如維生素D缺乏與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[2]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[3]等相關(guān)。隨著維生素 D受體(vitamin D receptor，VDR)在胎盤、子宮等女性生殖系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，維生素D對妊娠期胚胎植入、細(xì)胞因子的合成和感染等過程的免疫調(diào)節(jié)，以及維持成功妊娠的相關(guān)研究也越來越多。但對于早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent miscarriage，RM)患者中維生素D的改變?nèi)圆幻鞔_，因此本研究探討了母胎界面絨毛組織VDR轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)與RM及胎盤激素受體(包括絨毛膜促性腺激素受體、雌激素受體及孕激素受體)的相關(guān)性。

1材料和方法

1.1材料

2014年7月至2014年9月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收集早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)和同期早期正常妊娠要求行人工流產(chǎn)者的絨毛和蛻膜組織各8份，早期復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)樣本作為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組(RM)，早期正常妊娠要求行人工流產(chǎn)樣本作為對照組。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組平均孕周54.38±2.67天，對照組平均孕周51.50±2.98天，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.034，P=0.061)。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組均至少有2次早期自然流產(chǎn)史，無活產(chǎn)史；無甲狀腺功能異常及糖尿病等自身免疫性疾病，無高血壓等全身性慢性疾病；生殖系統(tǒng)的解剖結(jié)構(gòu)未見異常；自身免疫抗體檢測陰性及凝血相關(guān)檢查正常；夫婦雙方的染色體分析結(jié)果正常；無生殖道感染；弓形蟲、巨細(xì)胞病毒、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒IgM檢查結(jié)果陰性；葉酸代謝率及同型半胱氨酸檢測結(jié)果正常。對照組均至少有一次活產(chǎn)史，未發(fā)生過任何不良產(chǎn)史；本次孕期未出現(xiàn)過腹痛、陰道出血等先兆流產(chǎn)的癥狀。本研究的標(biāo)本采集均征得研究對象本人的同意，并獲得西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1絨毛和蛻膜組織標(biāo)本的收集

收集刮宮后絨毛和蛻膜組織，用高壓滅菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)反復(fù)漂洗，洗至無明顯血液殘留，吸干水分，將絨毛和蛻膜組織分裝在凍存管中，液氮速凍5～10min，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。

1.2.2熒光實(shí)時(shí)定量PCR

將絨毛和蛻膜組織各50mg，經(jīng)漂洗、剪碎后，加入500μL裂解液反復(fù)吹打，之后4℃，12 000rpm離心5 min，吸取上清液到1.5mL EP管中；加入等體積的70%乙醇混勻，將混合液全部轉(zhuǎn)入到RNA Spin Column中，12 000rpm離心1 min，棄濾液；先后將500μL和600μL的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，12 000 rpm離心30s，棄濾液；將RNA Spin Column安置于1.5mL的RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央處加入70μL的RNase Free dH2O，室溫靜置5min，4℃，12 000rpm×2 min離心，洗脫RNA，即為所得RNA。利用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按試劑盒說明書進(jìn)行(cDNA逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連反應(yīng)試劑盒，TaKaRa公司)。以制備的cDNA為擴(kuò)增模板進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR(fluorescence real-time quantitative PCR, FQ-PCR)反應(yīng)，總反應(yīng)體系25μL，39個(gè)循環(huán)(熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，TaKaRa公司)。反應(yīng)完成后，吸取混勻后的PCR產(chǎn)物5μL加入凝膠孔中，電壓90V，電泳30min，之后將凝膠放置在凝膠圖像處理系統(tǒng)中，觀察PCR產(chǎn)物片段大小。按照公式F=2-△△CT，計(jì)算樣本中目的基因 mRNA 的相對表達(dá)量。

根據(jù)GenBank上所查 mRNA序列，設(shè)計(jì)了VDR、絨毛膜促性腺激素受體(human chorionic gonadotropin receptor，hCGR)、雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)引物，引物序列見表1。

表1 FQ-PCR引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1絨毛組織VDR及胎盤激素受體的表達(dá)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組絨毛組織VDR、hCGR及ER表達(dá)明顯低于對照組(t值分別為4.86、6.16、2.39，均P<0.05)，而PR兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 復(fù)發(fā)流產(chǎn)組與對照組絨毛組織VDR及胎盤激素

指標(biāo)對照組復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組tPVDR1.08±0.490.24±0.174.860.00hCGR2.77±1.000.49±0.316.160.00ER1.36±0.970.48±0.382.390.04PR1.25±0.750.87±0.990.860.40

2.2蛻膜組織VDR及胎盤激素受體的表達(dá)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組蛻膜組織VDR、hCGR及ER表達(dá)也明顯低于對照組(t值分別為5.28、2.34、2.60，均P<0.05)，而PR兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.3絨毛和蛻膜組織VDR表達(dá)和胎盤激素受體表達(dá)的相關(guān)性檢驗(yàn)

絨毛組織hCGR及ER的表達(dá)水平明顯與VDR的表達(dá)相關(guān)(r=0.65，P=0.01；r=0.71，P=0.00)，而PR的表達(dá)與VDR無相關(guān)性。進(jìn)一步回歸分析顯示hCGR及ER的表達(dá)與VDR的表達(dá)呈正相關(guān)(F=10.21，P=0.01；F=14.52，P=0.00)。蛻膜組織hCGR、ER及PR的表達(dá)水平均與VDR的表達(dá)無明顯相關(guān)。

指標(biāo)對照組復(fù)發(fā)流產(chǎn)組tPVDR0.96±0.320.33±0.125.280.00hCGR1.53±0.760.58±0.862.340.04ER1.85±1.070.78±0.492.600.02PR0.97±0.820.65±0.361.010.34

3討論

3.1復(fù)發(fā)流產(chǎn)患者母胎界面VDR表達(dá)明顯降低

本研究通過對母胎界面絨毛和蛻膜組織中VDR在早期RM患者和正常早孕婦女中基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測比較，結(jié)果顯示孕早期RM患者母胎界面絨毛和蛻膜組織中VDR的基因表達(dá)水平均低于正常早孕對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。近期我們研究也顯示RM患者母胎界面VDR的蛋白表達(dá)水平也明顯低于正常早孕婦女[4]。表明VDR在人類胎盤絨毛和蛻膜組織中的表達(dá)對于維持母胎界面免疫平衡及妊娠的建立和維持具有重要的意義。以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VDR基因敲除小鼠的生育能力和產(chǎn)仔數(shù)量降低[5]。在人類的研究也顯示子宮內(nèi)膜表現(xiàn)了VDR介導(dǎo)的復(fù)雜的細(xì)胞調(diào)控，在維生素D的作用下，著床期子宮內(nèi)膜的容受性發(fā)生改變，其表達(dá)異常能夠?qū)е伦訉m內(nèi)膜的病理改變，干擾著床?？傊?，母胎界面VDR表達(dá)降低可能與RM的發(fā)生相關(guān)。

3.2母胎界面VDR表達(dá)降低與RM發(fā)生的可能機(jī)制

雖然RM患者母胎界面VDR表達(dá)明顯降低，但其降低導(dǎo)致自然流產(chǎn)的機(jī)制還不清楚。除有研究認(rèn)為1,25(OH)2D3通過VDR影響細(xì)胞因子的代謝而調(diào)節(jié)妊娠期的免疫反應(yīng)，1,25(OH)2D3可降低1型輔助性T細(xì)胞(T helper 1，Th1)細(xì)胞因子的分泌，增加Th2細(xì)胞因子的分泌，有利于Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡，維持正常妊娠[6]。另外Barrear于2007年研究認(rèn)為1,25(OH)2D3與胎盤激素的分泌有關(guān)，1,25(OH)2D3能調(diào)節(jié)雌激素、孕激素和絨毛膜促性腺激素的分泌，而這些激素的存在與妊娠的維持密切相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)母胎界面絨毛和蛻膜組織hCGR和ER表達(dá)在復(fù)發(fā)流產(chǎn)患者中降低，而且其在絨毛組織中的表達(dá)水平與VDR的表達(dá)水平明顯呈正相關(guān)，說明其可能是VDR調(diào)節(jié)途徑的靶基因。本課題組之前的研究也發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)流產(chǎn)患者血清維生素D含量明顯低于正常早孕婦女，而且復(fù)發(fā)流產(chǎn)患者維生素D低下的發(fā)生率明顯高于正常早孕婦女[7]，因此通過改善維生素D水平，也許可以改善這些激素的分泌，從而改善妊娠結(jié)局，這還需要進(jìn)一步前瞻性研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)母胎界面VDR表達(dá)降低與復(fù)發(fā)性早期自然流產(chǎn)相關(guān)，而且VDR的表達(dá)水平影響了hCGR、ER的表達(dá)水平，改善維生素D的水平也許可以改善妊娠結(jié)局。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：李春芳]

Relationship between vitamin D receptor expression on fetal-maternal interface and recurrent miscarriage and possible mechanism

YAN Chun-fang1, YAN Xiao-ting2, HUI Ling-yun2, WANG Li2, BAI E2, YU Xue-wen2

(1.ReproductiveCenter,Xi’anFourthHospital,ShaanxiXi’an710004,China;2.FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To explore the relationship between vitamin D receptor (VDR) expression on fetal-maternal interface and recurrent miscarriage (RM) and placental hormone. Methods Villous and decidual tissue samples from patients with RM and those at normal early pregnancy were collected outpatient department of obstetrics and gynecology in the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University from July to September in 2014. VDR, human chorionic gonadotropin receptor (HCGR), estrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) mRNA levels in two groups were detected by fluorescence real-time quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) and expression difference was compared. Results Women with RM had a significantly lower expression of VDR, HCGR and ER mRNA in villous tissues compared to normal pregnant women (tvalue was 4.86, 6.16 and 2.39, respectively,allP<0.05). HCGR and ER mRNA levels were positively correlated with VDR level in villous tissue (F=10.21,P=0.01;F=14.52,P=0.00). In decidual tissues, VDR, HCGR and ER mRNA in RM women were also lower than those in normal pregnant women (tvalue was 5.28, 2.34 and 2.60,respectively, allP<0.05). Conclusion VDR mRNA level on fetal-maternal interface is associated with early spontaneous abortion. HCGR and ER mRNA levels are positively correlated with VDR level in villous tissue. But further study is needed to investigate the mechanism of VDR causing spontaneous abortion.

recurrent miscarriage (RM); vitamin D receptor (VDR); fetal-maternal interface; human chorionic gonadotropin receptor (HCGR); estrogen receptor (ER)

2017-02-13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81270697)

閆春芳(1964-)，女，主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事生殖醫(yī)學(xué)的研究。

于學(xué)文，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.00.010

R714

A

1673-5293(2017)05-0519-03