諸葛飛 童華 高玲娟 王一荃 王祝鳴

COX-2基因在紫杉醇/卡鉑致卵巢癌細胞凋亡中的作用及機制研究

諸葛飛 童華 高玲娟 王一荃 王祝鳴

目的 探討環(huán)氧合酶-2(COX-2)在紫杉醇/卡鉑致卵巢癌細胞凋亡中的作用及機制。 方法 以卵巢癌CAOV-3細胞系,卵巢癌組織及其相應的癌旁正常組織為材料,采用實時熒光定量PCR和免疫印跡法分別檢測COX-2基因mRNA和蛋白質表達;流式細胞術檢測CAOV-3細胞的凋亡情況，同時采用透射電鏡觀察細胞的超微結構變化。 結果 COX-2基因在卵巢癌組織中的表達明顯高于其對應的癌旁正常組織(P<0.01);與紫杉醇/卡鉑組比較,轉染紫杉醇/卡鉑+pCMV-COX-2組卵巢癌細胞凋亡率明顯減少(P<0.01),且細胞超微結構未發(fā)生顯著改變。 結論 COX-2基因在紫杉醇/卡鉑治療卵巢癌中發(fā)揮重要作用,其有望成為卵巢癌治療的分子新靶標。

卵巢癌; 紫杉醇/卡鉑; COX-2

卵巢癌是嚴重威脅女性生殖系統(tǒng)健康的常見惡性腫瘤,來源于卵巢生發(fā)上皮的惡性腫瘤占卵巢惡性腫瘤的85%～90%[1]。卵巢上皮癌主要發(fā)生在老年女性,且5年生存率較低, 卵巢癌復發(fā)病人的生存期僅為1～2年[2]。目前卵巢癌治療的一線化學藥物主要是紫杉醇/卡鉑,化療藥物的耐藥性依然是個難題。研究顯示,環(huán)氧合酶-2(COX-2)在卵巢上皮癌細胞的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[3],本實驗將紫杉醇和卡鉑聯(lián)合作用于CAOV-3細胞,觀察其在致卵巢癌細胞凋亡的過程中,COX-2基因所起的功能及作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2007年1月至2012年12月間在南京市婦幼保健院行卵巢癌手術的病人標本30例,診斷明確。每個標本的癌組織及癌旁組織配對,標本取下后立即儲藏在-80 ℃的液氮中備用。按年齡是否≥60歲分為老年組和非老年組。其中老年組7例,年齡60～68歲,平均(65.8±3.9),非老年組23例,年齡35～59歲,平均(44.3±7.7)歲。

1.2 細胞培養(yǎng) 卵巢癌細胞株CAOV-3購自中國典型物種保藏中心。細胞在RPMI 1640 培養(yǎng)基中(包含10%胎牛血清、100 U/ml慶大霉素、100 μg/ml鏈霉素、10%非必需氨基酸)進行培養(yǎng)。卵巢癌細胞培養(yǎng)及實驗在37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱(Heraeus,德國)中進行。

1.3 CAOV-3卵巢癌細胞分組 以pCMV-COX-2質粒、pCMV空載質粒分別轉染CAOV-3卵巢癌細胞,取對數(shù)生長期的各組細胞,施加含卡鉑40 μg/ml和紫杉醇4 nmol/L的100 ml RPMI 1640 培養(yǎng)基,將卵巢癌細胞分別分組為:紫杉醇/卡鉑組,紫杉醇/卡鉑+pCMV-COX-2質粒組和紫杉醇/卡鉑+pCMV質粒組,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,觀察卵巢癌細胞的系列檢測指標。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR) 取卵巢癌及其相應的癌旁正常組織研磨成粉末,將粉末迅速轉移至EP管中,6000 r/min,離心15 min,棄上清。每50～100 mg組織,加入1 ml Trizol,移液器反復吹打裂解組織。反應體系配置如下:20 μl反應體系包含SYBR Green染料 10 μl,Taq聚合酶 2 μl,dNTPs 1 μl,上、下游引物 1 μl,樣品cDNA 5 μl。ABI Prime 7300定量PCR檢測儀(Biosystems),運行參數(shù)為50 ℃/2 min,95 ℃/5 min,95 ℃/20 s,60 ℃/2 min,35個循環(huán),單點熒光在60 ℃進行檢測。

1.5 免疫印跡 收取CAOV-3卵巢癌細胞,以每107個細胞加入1 ml細胞裂解液比例,加入細胞裂解液后,200 μl移液器反復吹打,至蛋白析出。取100 μg總蛋白上樣,電泳后,電轉移至PVDF膜,加入5 %脫脂奶粉稀釋的一抗,搖床上,37 ℃,4 h,以TBST充分洗滌,加入HRP結合的二抗,37 ℃,1 h,加入顯色液,避光反應5～10 min后,暗室中,曝光;以Bio-Rad凝膠成像分析儀,對印跡條帶進行灰度掃描,用以下公式進行計算:目的蛋白/內(nèi)參蛋白。

1.6 流式細胞儀 將細胞數(shù)調(diào)整為(1～5)×106/ml,1200 r/min,10 min,棄上清。4 ℃,PBS洗滌卵巢癌細胞,用結合緩沖液250 μl重新懸浮細胞。取100 μl的細胞懸液,加入5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)和10 μl 的碘化丙啶(PI)溶液,避光孵育30 min。加入結合緩沖液400 μl,于1 h內(nèi)流式細胞儀進行分析檢測。流式細胞儀激發(fā)光波長用488 nm,用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光,另一波長>560 nm的濾器檢測PI。

1.7 透射電鏡 將培養(yǎng)的卵巢癌細胞株CAOV-3,采用胰酶消化后制成懸液于離心管內(nèi),以2000 r/min,離心15 min,使卵巢癌細胞壓縮成團(以1-1.5 mm大小為宜),以2.5 %戊二醛及1 %鋨酸進行雙固定,15 min后,Epon 812進行包埋處理,超薄切片,在JEM-1010透射電鏡下,觀察細胞的超微結構。

2 結果

2.1 COX-2基因在卵巢癌和癌旁正常組織中的表達 RF-PCR結果顯示,卵巢癌組織中COX-2 mRNA的表達顯著高于其相應的癌旁正常組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。老年組COX-2 mRNA在卵巢癌組織中的表達亦顯著高于非老年組(P<0.05)。見表1。

表1 COX-2 mRNA在卵巢癌組織及癌旁組織中的表達

注:與癌旁正常組織比較,**P<0.01;與非老年組比較,△P<0.05

2.2 紫杉醇/卡鉑作用下COX-2蛋白的表達 紫杉醇/卡鉑作用于體外培養(yǎng)的卵巢癌CAOV-3細胞株,分別于24 h,48 h,72 h后,采用免疫印跡檢測COX-2蛋白的表達,結果顯示,紫杉醇/卡鉑作用下,COX-2蛋白的表達量逐漸減少,呈現(xiàn)出顯著的時間依賴性。

注：與0 h比較，**P<0.01,***P<0.001圖1 COX-2 蛋白的表達

2.3 卵巢癌CAOV-3細胞株凋亡檢測 利用流式細胞技術,評估不同質粒轉染卵巢癌CAOV-3細胞株,紫杉醇/卡鉑對細胞凋亡的影響。CAOV-3細胞凋亡百分比為Q1-UR(右上象限數(shù)值)與Q1-LR(右下象限數(shù)值)之和,數(shù)據(jù)表明,與紫杉醇/卡鉑組比較,紫杉醇/卡鉑+pCMV-COX-2質粒組CAOV-3細胞凋亡數(shù)量顯著減少,2組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);而紫杉醇/卡鉑+pCMV質粒組與紫杉醇/卡鉑組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05),見圖2。

2.4 卵巢癌CAOV-3細胞株凋亡形態(tài) 透射電鏡下觀察卵巢癌細胞的超微結構,紫杉醇/卡鉑+pCMV-COX-2質粒組,卵巢癌細胞形態(tài)基本正常;而紫杉醇/卡鉑組與紫杉醇/卡鉑+pCMV質粒組顯示,細胞形態(tài)出現(xiàn)顯著改變:細胞核邊緣化,細胞質體積相對增大,核凝縮并發(fā)生斷裂,細胞表面微絨毛明顯減少,細胞核內(nèi)染色質聚集且邊緣化,呈現(xiàn)大量空泡,細胞器部分變性,凋亡小體形成，見圖3。

3 討論

卵巢癌病人化學藥物治療的失敗,與腫瘤細胞的藥物耐藥性密切相關。卵巢癌的一線化療藥物紫杉醇/卡鉑的耐藥機制尚在研究中。紫杉醇和卡鉑誘導細胞凋亡的機制不同,根據(jù)藥物作用機制,卡鉑屬于細胞非周期性的化療藥:鉑-細胞DNA交聯(lián)形成絡合物,影響細胞DNA復制;紫杉醇屬于細胞周期特異性化療藥物,其分子通過與細胞內(nèi)各種微管蛋白的結合,影響細胞有絲分裂過程。因此,能抑制細胞凋亡的因素,也誘導了腫瘤細胞的藥物耐藥性。越來越多的實驗顯示,COX-2有促進腫瘤細胞增殖活性的作用,其抑制細胞凋亡的作用日益受到重視。

注:與紫杉醇/卡鉑組比較,**P<0.01;1：紫杉醇/卡鉑組;2:紫杉醇/卡鉑+pCMV-COX-2質粒組; 3:紫杉醇/卡鉑+pCMV質粒組。圖2 CAOV-3細胞的凋亡檢測

1:紫杉醇/卡鉑組;2:紫杉醇/卡鉑+pCMV-COX-2質粒組; 3:紫杉醇/卡鉑+pCMV質粒組圖3 CAOV-3細胞的超微結構 (×5000)

COX-2是前列腺素合成中的限速酶,在子宮內(nèi)膜癌及卵巢上皮癌中均有表達[4],其基因位于1號染色體q25.5-25.3,COX-2是一種誘導型酶,在正常生理狀態(tài)下不容易檢測出[5]。COX-2在病理狀態(tài)下,是如何被激發(fā)過度表達,通過何種途徑影響細胞對化療藥物的耐藥機制尚不清楚。結合COX-2屬于膜蛋白的特性,有報道,COX-2通過多種信號通路增加癌細胞的活性和侵襲性,如:PI3-k/Akt[6],E-鈣粘連蛋白等[7]。有研究顯示,COX-2的過度表達可以抵抗吉西他濱對乳腺癌細胞231/GEM的化療作用[8],可以抑制紫杉醇對胃癌細胞株BGC-823的凋亡[9]。本文數(shù)據(jù)顯示,卵巢癌組織中的COX-2基因的表達高于癌旁組織,紫杉醇/卡鉑誘導CAOV-3細胞凋亡的同時,COX-2蛋白含量減少也呈藥物作用時間依賴性;當COX-2基因過度表達時,紫杉醇/卡鉑+pCMV-COX-2組的細胞凋亡數(shù)量明顯少于其他2組,細胞凋亡形態(tài)也變化不大,而其他2組(紫杉醇/卡鉑組和紫杉醇/卡鉑-pCMV質粒組)的細胞呈凋亡改變?？梢?紫杉醇/卡鉑可以減少COX-2基因的表達;而過度表達的COX-2基因,可逆轉由卡鉑和紫杉醇誘導的CAOV-3細胞凋亡。據(jù)此推測,在紫杉醇/卡鉑治療卵巢癌發(fā)生耐藥時,COX-2基因也起了重要作用。本文實驗提示,老年卵巢癌病人的COX-2基因含量高于非老年病人,提示老年癌病人的化療效果欠佳可能與此有關。

如何降低COX-2基因的過度表達,也是目前研究的熱點。實驗顯示,塞來昔布(COX-2選擇性抑制劑)對順鉑作用的卵巢癌細胞SKOV-3有增敏作用[10];對接受順鉑治療的移植卵巢癌細胞的小鼠,美洛昔康(COX-2選擇性抑制劑)有抑制其卵巢癌組織增殖的作用[11]。因藥物的心血管不良反應,COX-2的作用機制還在研究中。降低COX-2基因的表達,可以減少卵巢上皮癌復發(fā)、耐藥的機會,為臨床指出新的治療方向,COX-2基因有望成為卵巢上皮癌治療的分子新靶標。

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Role of cyclooxygenase-2 gene in the apoptosis of ovarian cancer cell induced by paclitaxel/carboplatin

ZHUGEFei.

DepartmentofGynaecologyandObstetrics,NanjingBenqMedicalCenterAffliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210019,China;TONGHua,GAOLing-juan.ObstetricsandGynecologyHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210004,China;WANGYi-quan.LongHuaHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai20032,China;WANGZhu-ming.KeyLaboratoryofAntibodyTechnology,MinistryofHealth,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

Objective To investigate the role of cyclooxygenase-2 (COX-2) in the apoptosis of ovarian cancer cells induced by paclitaxel/carboplatin. Methods In ovarian cancer cell line CAOV-3, ovarian cancer tissue, and the corresponding adjacent normal tissue, the expression of COX-2 mRNA gene and protein was explored by Real-time PCR and Western blot, meanwhile, CAOV-3 apoptosis was detected by flow cytometry. Its ultra-microstructure changes were observed by transmission electron microscope. Results The expression of COX-2 mRNA gene was significantly higher in ovarian cancer tissue than that in adjacent normal tissue (P< 0.01). Compared with paclitaxel/carboplatin group, the apoptosis rate of ovarian cancer cells was obviously reduced(P< 0.01). And the morphological changes of apoptosis were not significant in paclitaxel/carboplatin+pCMV-COX-2 group. Conclusions Cox-2 plays an important role in ovarian cancer cell apoptosis induced by paclitaxel/carboplatin, and may be a new therapy molecular target.

ovarian cancer; paclitaxel/carboplatin; cyclooxygenase-2

南京市科技發(fā)展項目(201402023)

210019江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學附屬南京明基醫(yī)院婦產(chǎn)科(諸葛飛)；210004江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院(童華，高玲娟)；200032上海市，上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院(王一荃)；210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室(王祝鳴)

童華，Email：thua8@163.com

R 737.31

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.06.006

2017-02-14)