田海軍，李世偉，2

（1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；2.廈門利洋水產(chǎn)科技有限公司，福建 廈門 350200）

一例氣單胞菌引起池塘草魚(yú)死亡案例

田海軍1，李世偉1，2

（1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；2.廈門利洋水產(chǎn)科技有限公司，福建 廈門 350200）

草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）屬于鯉形目，草魚(yú)屬，俗稱鯇魚(yú)，因其生長(zhǎng)迅速、餌料來(lái)源廣泛，并且生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)量高，成為中國(guó)淡水養(yǎng)殖的四大家魚(yú)之一。草魚(yú)是我國(guó)特有魚(yú)類，但以其獨(dú)特的食性和覓食手段從而被當(dāng)作拓荒者帶到世界各地[1]。草魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中容易患上爛鰓、腸炎、赤皮、病毒性出血病等多種疾病[2-3]，細(xì)菌性病原致病的情況很嚴(yán)重。因此，通過(guò)對(duì)草魚(yú)細(xì)菌性疾病的病原菌分離與鑒定對(duì)草魚(yú)病害的防治具有較大意義[4]。

1 材料和方法

1.1 發(fā)病草魚(yú)

2017年3月份，廣東珠海一草魚(yú)養(yǎng)殖池塘開(kāi)始出現(xiàn)草魚(yú)死亡，池塘面積8×667m2，3臺(tái)葉輪式增氧機(jī)，水深1.8 m，池內(nèi)有7 500 kg魚(yú)，養(yǎng)殖前沒(méi)有清塘，從3月中期開(kāi)始，每天死亡十幾條，觀察發(fā)病草魚(yú)，魚(yú)體表發(fā)紅，尾鰭發(fā)白，鰓蓋、鰭條充血，剪開(kāi)肚子有腹水，肝臟發(fā)黑，腸空、發(fā)紅（如圖1）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

圖1 發(fā)病草魚(yú)

LB固體培養(yǎng)基、70%酒精、冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、顯微鏡、培養(yǎng)皿、燒杯、研缽、試管、接種環(huán)、酒精燈等。

1.3 病原菌的分離與純化培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，先用70%酒精對(duì)魚(yú)體表面消毒，然后分別取草魚(yú)的肝臟、腎臟、脾臟于無(wú)菌研缽中搗碎。分別加少量無(wú)菌水后分別劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。選取平板上的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，最終培養(yǎng)至3～5代后獲得形態(tài)一致的純菌落。選取單個(gè)菌落經(jīng)過(guò)涂片、HE染色、鏡檢，確認(rèn)為純培養(yǎng)物。選取一個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落，在LB固體培養(yǎng)基斜面上-80℃冰箱保存（通過(guò)抑制酶的活性來(lái)抑制細(xì)胞的生命活動(dòng)的方式延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間），備用。

1.4 分離菌落觀察

將純培養(yǎng)物接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄培養(yǎng)出的細(xì)菌菌落特征。將獲得的純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色。在載玻片上加1滴無(wú)菌水，用接種環(huán)挑取少許菌落與無(wú)菌水混合并進(jìn)行均勻涂布。經(jīng)自然干燥、火焰固定后，用草酸銨結(jié)晶紫染液染色1～2min，加水沖洗，再加革蘭碘液后1～2 min，加水沖洗，再加復(fù)紅酒精染液等50～60 s后加水沖洗。等待干燥后鏡檢。菌體被染成紫藍(lán)色為陽(yáng)性，被染成紅色則為陰性。

1.5 病原菌的鑒定

采用API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)，這同時(shí)能測(cè)定20項(xiàng)以上生化指標(biāo)，可用做快速鑒定細(xì)菌的長(zhǎng)形卡片（21 cm×4.5 cm，法國(guó)生產(chǎn)），上面排列著20個(gè)塑料管，管內(nèi)加有適量糖類等生化反應(yīng)的干粉（有標(biāo)簽標(biāo)明）以及反應(yīng)產(chǎn)物的顯色劑。每份產(chǎn)品都有薄膜覆蓋，這樣保證了無(wú)雜菌污染。

使用時(shí)，首先打開(kāi)內(nèi)部附有的一瓶無(wú)菌基本培養(yǎng)基（液體），用來(lái)稀釋待鑒定的純菌落。把配制成的濃度適中的細(xì)菌懸液用無(wú)菌滴管逐個(gè)以0.1 mL的量加入到每個(gè)小管中。在經(jīng)過(guò)24～28 h保溫后，觀看每個(gè)小管是否發(fā)生了顯色反應(yīng)。將結(jié)果記錄在相應(yīng)表格中，然后按照規(guī)定對(duì)結(jié)果進(jìn)行編碼、查檢索表，就可以獲得該菌種的鑒定結(jié)果。

1.6 藥敏實(shí)驗(yàn)

藥敏實(shí)驗(yàn)采用的是紙片法（購(gòu)自杭州某微生物試劑公司），選用在生產(chǎn)上常用的藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

首先進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，用無(wú)菌生理鹽水洗后吸取0.2 mL菌液在LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行均勻涂布。貼上藥敏紙片，設(shè)4個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組。放置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察有無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，同時(shí)記錄抑菌圈直徑，計(jì)算其平均值。然后再重復(fù)做1次實(shí)驗(yàn)，最后依據(jù)抑菌圈直徑比值照判斷標(biāo)準(zhǔn)得到藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2 病原菌分離分離與純化培養(yǎng)

1.7 臨床用藥

根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果和池塘情況使用藥物治療。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離與純化培養(yǎng)結(jié)果

在LB固體培養(yǎng)基上形成菌落為其菌落形態(tài)：圓形、圓滑、濕潤(rùn)邊緣整齊、微凸、半透明、灰白色至淡黃色中等大小的菌落，易挑?。ㄒ?jiàn)圖2）。

2.2 分離菌菌鏡檢結(jié)果

革蘭染色陰性，短桿菌，懸滴標(biāo)本觀察動(dòng)力，運(yùn)動(dòng)活潑（見(jiàn)圖3）。

2.3 分離菌生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分離菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、圖4。

2.5 臨床治療結(jié)果

用藥：第1天，陰雨天，死亡15條左右，上午10：00，“鰓皮腸利康”（1包）拌兩包料。第2天，陰雨天，死亡6條，17：00，“鰓皮腸利康”（1包）拌1包料。第3天，陰天，死亡6、7條，10：00喂“鰓皮腸利康”（1包）拌2包料。之后，草魚(yú)死亡量明顯減少，病情基本得到控制。

圖3 分離菌革蘭染色

圖4 藥敏試驗(yàn)

表1 細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

根據(jù)分離菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生化特性等實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定該分離病原菌為氣單胞菌[5]。氣單胞菌廣泛分布于自然界中，能從表層和地下來(lái)源的飲用水中分離出該菌，氣單胞菌屬已經(jīng)被國(guó)際上列為腸道致病菌之一，是危害草魚(yú)的主要病原菌之一[6]，感染后可發(fā)生胃腸炎、外傷感染和敗血癥并具有高病死率[7]。實(shí)驗(yàn)從草魚(yú)的肝脾腎等組織中分離出了氣單胞菌，為臨床治療提供了理論依據(jù)。但由于時(shí)間等多種條件限制，不能做回歸實(shí)驗(yàn)。

由藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知病原菌對(duì)“鰓皮腸利康”、“鰓膚康”、“出敗康”、“氟多力”高度敏感。臨床上選用高敏藥物“鰓皮腸利康”（主要成分：諾氟沙星）進(jìn)行的治療，根據(jù)“鰓皮腸利康”特性采用了拌料口服的方式。諾氟沙星（Norfloxacin）化學(xué)名為1-乙基-6-氟-1，4-二氫-4-氧代-7-（1-哌嗪基）-3-喹啉羧酸，作用原理：通過(guò)作用于細(xì)菌DNA螺旋酶的A亞單位，抑制DNA的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，是氟喹諾酮類抗菌藥，對(duì)需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高。鹽酸小柴堿是小檗堿（Berberine）的鹽酸鹽（俗稱鹽酸黃連素），小檗堿分子式[C20H18NO4]+，是一種異喹啉生物堿，又稱黃連素，存在于小檗科等4科10屬的許多植物中，抗菌譜廣，體外對(duì)多種革蘭陽(yáng)性及陰性菌均具抑菌作用，臨床主要用于腸道感染及菌痢等。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

具體治療：因前期沒(méi)有清塘，草魚(yú)出現(xiàn)死亡后用了絮凝的凈水產(chǎn)品，使塘底滋生了更多的有害細(xì)菌。后來(lái)又用了很多殺蟲(chóng)的藥物，破壞了水體的生態(tài)平衡，加上一直陰雨天氣，池塘自凈能力差，溶氧一直不高，建議首先控制好死亡量，然后改善好池塘環(huán)境，最后再根治魚(yú)病。在注意增氧的前提下連續(xù)3 d每天1包“鰓皮腸利康”拌料投喂，草魚(yú)食欲恢復(fù)，死亡數(shù)量明顯減少。

氣單胞菌致病是由多種致病因子協(xié)同作用的結(jié)果，指導(dǎo)臨床用藥時(shí)為防止濫用抗生素而引起的病原菌抗藥性問(wèn)題，對(duì)分離的病原菌用藥敏實(shí)驗(yàn)測(cè)定后再合理選用藥物治療才能達(dá)到最好的效果。該菌以往被認(rèn)為是低毒力條件性病原菌，但近年該菌引起感染性疾病的報(bào)道日益增多，并對(duì)多種抗生素產(chǎn)生不同程度的耐藥性，需要加以重視，注意衛(wèi)生等各方面管理。臨床上，早發(fā)現(xiàn)，早治療，防止多種病原交叉感染，提高機(jī)體抵抗力，科學(xué)養(yǎng)殖。

[1]潘迎捷.水產(chǎn)辭典[M].上海：上海辭書(shū)出版社，2007：284-353.

[2]楊秀榮，曾燕玲，魏志琴.網(wǎng)箱養(yǎng)殖患病草魚(yú)細(xì)菌分離鑒定與回復(fù)感染研究 [J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，37（6）：83-86.

[3]權(quán)可艷，徐麗娟.恩諾沙星控制草魚(yú)維氏氣單胞菌的用藥方案[J].淡水漁業(yè)，2013，43（2）：48-53.

[4]隗黎麗，王自蕊，楊竹青.草魚(yú)2株氣單胞菌的分離與鑒定[J].水產(chǎn)科學(xué)，2013，32（6）：348-352.

[5]楊正時(shí).氣單胞菌屬分類學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病雜志，1990，6（14）：9.

[6]韓先樸，李偉，徐伯亥.斑點(diǎn)氣單胞菌對(duì)草魚(yú)的毒力[J].水生生物學(xué)報(bào)，1987，11（3）：284-286.

[7]樊俊杰.氣單胞菌腹瀉 [J].中華流行病學(xué)雜志，1989，10（5）：306-309.

2016-11-03）

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.05.018