陳 進(jìn)，馮崇廉，聶釗源，鄧 煒，李偉杰

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院中醫(yī)科，廣州 510150）

疏肝消脂Ⅲ方膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠CYP2E1基因表達(dá)的影響

陳 進(jìn)，馮崇廉*，聶釗源，鄧 煒，李偉杰

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院中醫(yī)科，廣州 510150）

目的 探討疏肝消脂Ⅲ方膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠的防治作用及對(duì)肝組織細(xì)胞色素P4502E1mRNA表達(dá)的影響。方法 用高脂乳劑灌胃建立NAFLD大鼠模型，于灌胃第6周末形成脂肪肝后，給予疏肝消脂Ⅲ方膠囊和水飛薊賓膠囊4周，在光鏡下觀察各組肝臟病理變化，并通過熒光定量(qPCR)法測定大鼠肝組織CYP2E1的mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 與模型組相比，各藥物組肝臟病理變化改善；疏肝消脂Ⅲ方組CYP2E1的mRNA水平較模型組降低（P ＜0.05）。結(jié)論 疏肝消脂Ⅲ方膠囊能明顯改善高脂飲食大鼠脂肪肝病理學(xué)變化，抑制NAFLD氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)肝臟，作用機(jī)制可能與CYP2E1表達(dá)有關(guān)。

疏肝消脂Ⅲ方膠囊；非酒精性脂肪肝； 細(xì)胞色素P4502E1

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一種遺傳—環(huán)境—代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，其中氧化應(yīng)激對(duì)于NAFLD的發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵作用。NAFLD通常與代謝紊亂（如肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和血脂異常等）密切相關(guān)，目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)并沒有專門針對(duì)脂肪肝的藥物，對(duì)于NAFLD的治療僅限治療相關(guān)的代謝綜合征及預(yù)防致病因素，如適量運(yùn)動(dòng)、合理飲食、藥物（如胰島素增敏劑、調(diào)脂藥、保肝劑）等綜合治療[1-2]。疏肝消脂Ⅲ方膠囊是馮崇廉主任近20年應(yīng)用中藥治療脂肪肝的臨床經(jīng)驗(yàn)方，原方疏肝消脂湯在臨床上治療脂肪肝療效顯著[3]。疏肝消脂Ⅲ方膠囊由原方疏肝消脂湯及后來的疏肝消脂Ⅰ方、疏肝消脂Ⅱ方不斷改進(jìn)，經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝加工而成。周大林等[4]研究表明疏肝消脂膠囊可以顯著降低NAFLD大鼠肝組織細(xì)胞色素P450-2El（CYP2E1）。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（PCR）觀察疏肝消脂Ⅲ方膠囊對(duì)NAFLD大鼠肝組織的CYP2E1mRNA表達(dá)的影響，從抗氧化角度進(jìn)一步深入揭示疏肝消脂Ⅲ方膠囊治療NAFLD的部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 46只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2013-0002。

1.2 試劑與設(shè)備 高脂乳劑（主要組成：200 mL豬油、100 g膽固醇、10 g丙硫氧嘧啶、10 g蛋黃粉、20 g膽酸鈉、200 m L吐溫- 80、200 m L丙二醇、300 g果糖、蒸餾水等）由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制；Trizol試劑盒：Invitrogen Life Technologies公司產(chǎn)品；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)：Roche公司產(chǎn)品；PCR引物由Invitrogen Biotechnology Co.LTD公司合成；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Neofuge 15R：Heal Force公司產(chǎn)品；Step One Plus熒光定量PCR儀：ABI公司產(chǎn)品；MUVB-20凝膠分析系統(tǒng)：美國 Ultra-lum 公司產(chǎn)品。

1.3 藥物 疏肝消脂Ⅲ方膠囊，由牛黃田七散合四逆散組方加減而成，每粒膠囊含原生藥量約3.12 g。由廣州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院中醫(yī)科委托廣東新峰藥業(yè)協(xié)制。水飛薊賓膠囊，購于天津天士力圣特制藥有限公司，每粒含水飛薊賓35 mg。

1.4 模型的建立及分組 46只SD大鼠正常喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成正常組10只和非酒精性脂肪肝組36只。非酒精性脂肪肝組36只再隨機(jī)分模型組,水飛薊賓膠囊對(duì)照組及疏肝消脂Ⅲ方膠囊觀察組,每組各12只。正常組（n=10）普通飼料喂養(yǎng)；非酒精性脂肪肝組按1 m L/100 g 體質(zhì)量灌服高脂乳劑。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水進(jìn)食，分籠飼養(yǎng)于（20±2）℃、明暗各12 h的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。在6周時(shí)，將高脂乳劑灌胃的3組實(shí)驗(yàn)大鼠各抽取2只（共6只）處死行肝組織病理學(xué)觀察，病理切片顯示大部分肝細(xì)胞腫脹，形態(tài)排列不規(guī)則，胞漿內(nèi)充滿大小不等的脂滴，表明NAFLD模型建立成功。實(shí)驗(yàn)第7周起開始對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠灌胃給藥。正常組和模型組按1 m L/100 g 體質(zhì)量生理鹽水灌胃，1次/d；治療組予疏肝消脂Ⅲ方膠囊溶液灌胃，1次/d。大鼠灌胃藥量按照1 mL/100 g 體質(zhì)量折算。

1.5 標(biāo)本采集 藥物治療4周后（即實(shí)驗(yàn)第10周末），觀察大鼠精神狀態(tài)、皮毛光澤度、活動(dòng)情況，稱取體質(zhì)量，然后采取頸椎脫臼法處死大鼠，迅速剖腹，觀察肝臟外形、色澤、質(zhì)地，稱取全肝濕重并記錄，取相同部位肝組織，按常規(guī)制備肝勻漿、肝組織石蠟切片標(biāo)本，肝組織于-80 ℃冰箱保存，用于qPCR檢測。

1.6 病理學(xué)檢測 取大小相等、部位相同的肝右葉組織放入4%甲醛中固定，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察各大鼠肝臟脂肪病變及炎癥表現(xiàn)。

1.7 Q-PCR檢測大鼠肝組織CYP2E1的mRNA表達(dá)水平 1）總RNA提取 按Trizol試劑盒常規(guī)一步法提取肝臟總RNA。2）反轉(zhuǎn)錄取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液和1 μL oligo(dT)15；用無核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12 μL；再放于PCR儀上70 ℃保溫5 m in后迅速置冰上冷卻；依次加入4 μL 5×buffer，2 μL10 mmol/L dNTPs，1 μL RNA inhibitor和1 μL 反轉(zhuǎn)錄酶，用槍抽吸混勻；于PCR儀上42 ℃保溫60 m in，結(jié)束后80 ℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。3）定量PCR首先取出0.2 m L PCR管，配制反應(yīng)體系：12.5 μL 2× qPCR M ix、2.0 μL 7.5 μmol/L基因引物、2.5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、8.0 μL ddH 20，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管；重復(fù)上一操作，將目標(biāo)基因引物換成內(nèi)參基因引物；將上述反應(yīng)體系于95 ℃預(yù)變性10 m in，然后按下述條件循環(huán)40次，變性95 ℃ 30 s、退火60 ℃ 1 m in、延伸72 ℃5 min；溶解曲線75～90 ℃，每20 s升溫1 ℃。實(shí)驗(yàn)中熒光本底信號(hào)和閾值均采用儀器中設(shè)置的默認(rèn)數(shù)值，由每次PCR反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)自動(dòng)生成，每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值（即基線熒光信號(hào)的10倍）時(shí)所處的循環(huán)數(shù)定義為Ct值；待測基因每個(gè)模板做3個(gè)復(fù)孔，分別測得取平均值，△CT=CT目的基因-Ctcyp2e1，△△CT=△CT實(shí)驗(yàn)-△CT對(duì)照，目的基因的相對(duì)表達(dá)水平用2-△△CT計(jì)算得出。引物序列見表1。

表1 大鼠CYP2E1、GAPDH引物合成基因序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (x±s) 表示，多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較運(yùn)用單因素方差分析(ANOVA)。方差齊者的兩兩比較采用LSD法，方差不齊者則采用Dunnet’s T3檢驗(yàn)。P ＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟病理學(xué)變化 光鏡下HE染色顯示，正常對(duì)照組大鼠肝組織無脂滴和炎癥細(xì)胞浸潤，而模型組及各藥物組所有動(dòng)物肝組織均出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞體積變大，胞漿內(nèi)可見脂滴空泡，小葉內(nèi)可見炎癥細(xì)胞浸潤，模型組脂肪肝程度最重，各藥物組脂肪肝程度較模型組明顯減輕。

2.2 大鼠肝組織勻漿CYP2E1的mRNA的表達(dá) 見表2。

表2 大鼠肝組織勻漿CYP2E1的mRNA的表達(dá)

表2 大鼠肝組織勻漿CYP2E1的mRNA的表達(dá)

注：與正常組比較，# P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

組 別劑量/(mg/kg)CYP2E1的相對(duì)值正常對(duì)照組 －1.00±0.18模型組 －2.68±0.26#水飛薊賓組44.1 1.55±0.22#△Ⅲ方膠囊組315 1.39±0.29#△

3 討論

NAFLD是一種最常見的肝臟疾病，近年我國代謝綜合征、肥胖人數(shù)逐漸增多，NAFLD發(fā)病率也明顯升高[5-6]。目前認(rèn)為脂肪肝的危害不僅僅是肝硬化的發(fā)生，同時(shí)也增加心腦血管事件發(fā)生的比例[7]。因此，NAFLD越來越受到廣泛重視。對(duì)于NAFLD的確切發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，近年提出腸道微生態(tài)失衡可能與NASH的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[8]，但是醫(yī)學(xué)界廣泛接受的非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制是Day等[9]提出的“二次打擊”學(xué)說。在NAFLD的“二次打擊學(xué)說”中，“首次打擊”是胰島素抵抗影響脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酸儲(chǔ)積；“第二次打擊”則是在胰島素抵抗的基礎(chǔ)上，肝細(xì)胞中大量游離脂肪酸的聚集使線粒體內(nèi)β氧化反應(yīng)率增加，并引起CYP2E1的水平升高，導(dǎo)致活性氧的增加，這一系列氧化應(yīng)激的改變即為NAFLD發(fā)病的“第二次打擊”[10]。而細(xì)胞色素氧化酶P450-2El亞型(CYP2E1)是參與氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化過程中的關(guān)鍵酶[11]。細(xì)胞色素P450酶是微粒體混合功能氧化酶系中最重要的一族氧化酶，主要存在于肝細(xì)胞微粒體中，是參與藥物代謝與失活以及身體其他外來物質(zhì)代謝作用重要的酶，其中CYP2El作為細(xì)胞色素P450超家族(CYP450)重要成員之一，參與乙醇、四氯化碳、丙酮、苯等藥物、毒素、前致癌物質(zhì)代謝活化及不飽和脂肪酸氧化，在非酒精性脂肪肝的發(fā)病中起到重要作用[12-13]。CYP2E1主要分布在肝臟，約占肝臟CYP總量的7%，在一些肝外組織(如腦、肺、胃、腸、心臟等)也有高表達(dá)[14]。研究[11]表明，CYP2E1的表達(dá)與非酒精性脂肪肝的易感因素：肥胖、2型糖尿病及高脂血癥等密切相關(guān)。在非酒精性脂肪肝中CYP2E1蛋白被自然地誘導(dǎo)，隨著脂肪肝程度的加重，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損害，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加劇，CYP2El表達(dá)明顯增高[15]。CYP2E1的高表達(dá)使線粒體、微粒體氧化反應(yīng)異常增強(qiáng)，發(fā)生生物膜脂質(zhì)過氧化，并減弱抗氧化系統(tǒng)的保護(hù)作用，引起肝細(xì)胞損害[16]。CYP2E1與肝毒性物質(zhì)如脂多糖、花生四烯酸等有協(xié)同肝毒性作用，促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡、壞死[17]。本實(shí)驗(yàn)研究提示模型組大鼠較空白對(duì)照組存在明顯的脂肪肝變性、壞死，且CYP2E1mRNA表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），說明CYP2E1活性增強(qiáng)在非酒精性脂肪肝發(fā)病中起作用。

馮崇廉教授認(rèn)為：肝臟異常堆積的脂肪為黃白有形之物，類似于中醫(yī)痰凝，痰阻氣機(jī)，氣機(jī)不利；肝郁氣滯，氣滯則血瘀，痰瘀互為因果。認(rèn)為肝郁氣滯、痰瘀互結(jié)乃脂肪肝病機(jī)的關(guān)鍵所在[18]。疏肝消脂Ⅲ方膠囊根據(jù)“肝主疏泄”理論，針對(duì)肝郁氣滯、痰瘀互結(jié)的病機(jī)關(guān)鍵，以疏肝解郁，祛瘀化痰為主要治則。疏肝消脂Ⅲ號(hào)方主要以四逆散合牛黃田七散加味而成，方中以四逆散加郁金、素馨花疏肝行氣解郁，丹參、山楂活血祛瘀消脂；澤瀉、萆薢利濕去濁；溪黃草利濕退黃；荷葉升清降濁；白花蛇舌草清熱涼肝解毒，而牛黃、三七對(duì)降解肝內(nèi)血脂堆積有良好療效；諸藥合伍共奏疏肝利氣，清脂降脂，降解肝內(nèi)脂肪堆積之功。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果筆者觀察到，與模型組相比，疏肝消脂Ⅲ方膠囊能夠明顯改善脂肪肝大鼠肝臟病理表現(xiàn)，且能抑制cyp2e1基因的表達(dá)；與水飛薊賓膠囊藥物組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷，以疏肝解郁，祛瘀化痰為主要治則能夠切中非酒精性脂肪肝的病機(jī)關(guān)鍵，疏肝消脂Ⅲ方膠囊對(duì)NAFLD大鼠具有防治作用，其療效與水飛薊賓膠囊相當(dāng)，其作用機(jī)制之一是抑制肝細(xì)胞中CYP2E1基因的表達(dá),從而減輕氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。本研究為臨床預(yù)防和治療NAFLD 提供了新的思路。

[1]施軍平, 范建高. 2009年非酒精性脂肪性肝病臨床研究進(jìn)展回顧[J]. 實(shí)用肝臟病雜志, 2010, 13(1): 1-3, 15.

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組. 非酒精性脂肪性肝病診療指南[J]. 藥品評(píng)價(jià), 2007, 4(2): 77-79.

[3]伍月紅, 馮崇廉. 自擬疏肝消脂湯治療脂肪肝的臨床療效分析[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2005, 14(12): 1601-1602.

[4]周大林, 馮崇廉. 疏肝消脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝組織細(xì)胞色素P450-2El的影響[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 4(29): 417-420.

[5]楊蕊旭, 范建高. 非酒精性脂肪性肝病的流行現(xiàn)狀[J]. 臨床內(nèi)科雜志, 2007, 32(5): 293-296.

[6]范建高. 第二講非酒精性脂肪肝的臨床流行病學(xué)研究[J].中華消化雜志, 2002, 22(2): 106-107.

[7]周琦, 范建高. 非酒精性脂肪性肝病與冠心病的關(guān)系及相關(guān)研究進(jìn)展[J]. 中國動(dòng)脈硬化雜志, 2008, 16(8): 669-672.

[8]楊林輝, 蔡俊, 陳東風(fēng). 非酒精性脂肪性肝炎患者腸道菌群的變化及意義[J]. 臨床肝膽病雜志, 2012, 28(2): 124-126.

[9]DAY CP, JAMES OF. Steatohepatitis: a tale of two “hits”[J]. Gastroenterology, 1998, 114(4): 842-845.

[10]董姝, 劉平, 孫明瑜. 非酒精性脂肪肝發(fā)病機(jī)制——“二次打擊”學(xué)說研究進(jìn)展[J]. 臨床肝膽病雜志, 2012, 28(7): 551-555.

[11]WU CW, YU J. Molecular basis for a functional role of cytochrome P450 2E1 in non-alcoholic steatohepatitis[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2010, 25(6): 1019-1020.

[12]GONZALEZ FJ. CYP2E1[J]. D rug M etabolism and Disposition, 2006, 35(1): 1-8.

[13]F.PETER GUENGERICH, DONG HYUN K IM, MASA HIKO IWASAKI. Role of human cytochrome P-450 IIE1 in the oxidation of many low molecular weight Cancer suspects[J]. Chem Res Toxicol, 1991, 2(4): 168-179.

[14]INGELM AN-SUNDBERG M H. Em ano l-inducib le cytochrome P450 2E 1:genetic polymorphism regulation,and possible ro1e in the etiology of alcohol-induced liver disease[J]. A lcohol, 1993, 6(10): 447-452.

[15]史洪濤, 陳東風(fēng), 李陶, 等. 非酒精性脂肪肝大鼠肝細(xì)胞色素P450-2E1基因及表達(dá)變化的意義[J]. 中華肝臟病雜志, 2005, 13(2): 154-155.

[16]曾民德. 脂肪性肝病的氧應(yīng)激及其治療對(duì)策[J]. 國外醫(yī)學(xué)（消化系疾病分冊(cè)）, 2005, 25(5): 263-266.

[17]TANAKA E, TERADA M, M ISAWA S. CYTOCHROME P450 2E1: its clinical and toxicological role[J]. J Clin Pharm Ther, 2000, 25(3): 165-175.

[18]王志平, 馮崇廉. 疏肝消脂Ⅲ號(hào)方對(duì)大鼠酒精性脂肪肝模型的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志, 2009, 17(3): 160-163.

Effect ofS hugan Xiaozhi decoction IIIcapsule on the CYP2E1 in the rat w ith non-alcoholic fatty liver disease

CHEN Jin, FENG Chonglian*, NIE Zhaoyuan, DENG Wei, LI Weijie
(The Third A ffi liated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, China)

Objective To study the therapeutic effects of Shugan Xiaozhi decoction III capsule on the expression of hepatic cytochrome P4502E1mRNA in the rats w ith non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).Methods The animal model of non-alcoholic fatty liver disease w ith high fat emulsion, and rats were treated w ith Shugan Xiaozhi decoction III capsule or Silibinin capsules for four weeks after fatty liver in rats was developed by irrigation at 6th week. To observe the pathological changes in the liver of each group under the light m icroscope, and the rat liver CYP2E1 mRNA expression were determ ined by fl uorescence quantitative PCR (qPCR) method.Results Comparing w ithmodel group, the levels of the pathological changes in the liver were decreased in all medicine groups. The mRNA expressions of CYP2E1 in Shugan Xiaozhi decoction III capsule group were lower than those in model group (P<0.05). Conclusion Shugan Xiaozhi Decoction III capsule can signifi cantly improve pathology, oxidative stress reaction and protect the liver, which may related w ith the expression of CYP2E1 in NAFLD.

Shugan Xiaozhi decoction III capsule; nonalcoholic fatty liver; cytochrome P4502E1

R285.5

A

2095-6258（2017）03-0351-04

2016-05-18）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.03.003

廣州市“十二五”重點(diǎn)中醫(yī)肝病?？疲ㄋ胄l(wèi)中[2013] 6號(hào)）；廣州市中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（穗衛(wèi)中[2014] 3號(hào)；20142A011005）。

陳 進(jìn)（1990 -），女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)內(nèi)科學(xué)方向研究。

*通信作者：馮崇廉，男，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，電話-18928916692, 電子信箱-fengchonlian@126.com