張憲臣+李蓉+周艷萍+薄艷娜+王京力+胡儀光

摘 要 建立了QuEChERS超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）測(cè)定食用菌中7種熒光增白劑殘留量的檢測(cè)方法。樣品前處理采用QuEChERS方法， 食用菌樣品用水浸潤(rùn)后， 以甲酸和乙腈提取目標(biāo)物， C18填料、正丙基乙二胺（PSA）和MgSO4凈化， C18色譜柱分離， 乙腈和0.1%甲酸梯度洗脫， 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子模式掃描。在優(yōu)化條件下， 7種熒光增白劑在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 相關(guān)系數(shù)均大于0.991， 方法檢出限（S/N=3）在0.05～0.40 μg/kg之間， 定量低限（S/N≥10）在0.2～1.3 μg/kg之間， 方法的平均回收率在70.1%～109.2%之間。本方法具有操作簡(jiǎn)單快捷、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法； 熒光增白劑； 食用菌

1 引 言

熒光增白劑（Fluorescent whitening agents， FWAs）是一種熒光染料， 又稱為白色染料， 是一種能吸收不可見(jiàn)的紫外光（波長(zhǎng)300～400 nm）， 再激發(fā)出可見(jiàn)的藍(lán)色或藍(lán)紫色熒光（波長(zhǎng)420～480 nm）的復(fù)雜有機(jī)化合物[1]。食用菌中熒光增白劑的來(lái)源主要有兩方面： 人為添加和包裝材料污染。食用菌中常檢測(cè)到的熒光增白劑包括化學(xué)結(jié)構(gòu)屬香豆素類型熒光增白劑（如C.I. 140）、化學(xué)結(jié)構(gòu)屬吡唑啉類型熒光增白劑（如C.I. 135、C.I. 185、 C.I. 367、C.I. 393、 C.I. 184）和化學(xué)結(jié)構(gòu)屬三嗪氨基二苯乙烯型熒光增白劑（如C.I. 353）， 這些熒光增白劑在人體內(nèi)不易被分解， 其毒性累積在肝臟或其它重要器官， 成為潛在的致癌因素[2]。國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T 307982014食品用洗滌劑試驗(yàn)方法——熒光增白劑的測(cè)定中明確規(guī)定： 食品包裝用原紙、餐具洗滌劑、食品工具設(shè)備用洗滌劑與洗滌消毒劑中均不得檢出熒光性物質(zhì)， 但至今未見(jiàn)關(guān)于食用菌中熒光增白劑的測(cè)定的國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)， 僅有2009年四川省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 51/T9072009食用菌中熒光增白劑檢驗(yàn)規(guī)程的相關(guān)報(bào)道， 但是該標(biāo)準(zhǔn)采用紫外分光光度法進(jìn)行檢測(cè)， 僅能對(duì)食用菌中熒光增白劑進(jìn)行定性分析， 無(wú)法對(duì)熒光增白劑的種類和含量進(jìn)行測(cè)定， 且人為誤差大。

目前， 熒光增白劑的檢測(cè)方法主要有光譜法和色譜法。 光譜法包括白度法、熒光分光光度法和紫外分光光度法； 色譜法則包括高效液相色譜法（HPLC）[3]和高效液相色譜法質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLCMS/MS）[4～9]等。光譜法只能對(duì)熒光增白劑進(jìn)行半定量檢測(cè)， 且受人為因素和設(shè)備的影響較大； 對(duì)于組成復(fù)雜的樣品， 測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性難以保證， 不適用于監(jiān)督執(zhí)法部門的相關(guān)執(zhí)法檢測(cè)。液相色譜法只能依靠化合物的保留時(shí)間定性， 易受雜質(zhì)干擾。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法采用保留時(shí)間與特征離子對(duì)比例對(duì)已知目標(biāo)物進(jìn)行定性和定量分析， 準(zhǔn)確性和靈敏度優(yōu)勢(shì)明顯。目前， 對(duì)食品接觸材料中的熒光增白劑研究較多[10]， 尚未見(jiàn)關(guān)于食用菌中熒光增白劑檢測(cè)的報(bào)道。黃薇等[11]采用高效液相色譜法測(cè)定食用菌中10種熒光增白劑， 張建瑩等[12]采用超高效液相色譜法質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLCMS/MS）測(cè)定食用菌中3種熒光增白劑， 這些研究均采用固相萃取對(duì)樣品進(jìn)行前處理。QuEChERS（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe）是基于分散固相萃取發(fā)展起來(lái)的一種集萃取和凈化為一體的新型前處理方法， 能夠有效縮短前處理時(shí)間， 提高檢測(cè)效率， 已在農(nóng)藥殘留檢測(cè)、臨床醫(yī)學(xué)、獸藥及醫(yī)藥殘留等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[4～12] 。本研究利用QuEChERS前處理方法對(duì)食用菌中熒光增白劑進(jìn)行凈化處理， 平行定量濃縮儀濃縮提取液， 采用UPLCMS/MS進(jìn)行測(cè)定， 建立食用菌中7種常用的熒光增白劑的檢測(cè)方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

Ekspert Ultra LC100超高效液相色譜系統(tǒng)、AB5500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司）； BECHMAN Coulter Avanti J26XP超高速冷凍離心機(jī)； 平行定量濃縮儀、再循環(huán)冷卻系統(tǒng)B740、真空泵V700/701（瑞士BUCHI公司）； 渦旋振蕩器（德國(guó)IKA公司）； DTYB1200（電子天平， 福州華志科學(xué)儀器有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品： C.I. 162（純度≥94.0%）、C.I. 140（純度≥94.0%）、C.I. 135（純度≥95.0%）、C.I. 185（純度≥98.0%）、C.I. 367（純度≥98.0%）、C.I. 393（純度≥98.0%）和C.I. 184（純度≥98.0%）， 均購(gòu)自美國(guó)International Laboratory 公司； 甲醇、乙腈 、無(wú)水MgSO4（色譜純， 美國(guó)Fisher公司）； 丙基乙二胺（Primary secondary amine， PSA）、C18（分析純， 粒徑40～63 μm上海安譜公司）。實(shí)驗(yàn)用MilliQ超純水（美國(guó)Millipore公司）。鮮香菇、鮮平菇、鮮金針菇和干香菇由中山檢驗(yàn)檢疫局食品監(jiān)管科提供， 凍干松茸由中山援藏工作組提供。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg， 用三氯甲烷溶解并定容至50 mL， 制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液， 置于4℃保存。

準(zhǔn)確吸取適量的C.I. 162， C.I. 140， C.I. 135， C.I. 185， C.I. 367， C.I.393和C.I. 184儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中， 用乙腈定容至， 配成各熒光增白劑相應(yīng)濃度為320 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3 液相色譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱： Phenomenex Kinetex （100 mm×2.1 mm， 2.6 μm）； 柱溫： 40℃； 進(jìn)樣量： 10 μL； 流動(dòng)相： A為乙腈， B為0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序： 0～1.0 min， 10% A； 1.0～8.0 min， 10%～90% A； 8.0～15.5 min， 90% A； 15.5～16.0 min， 90%～10% A； 16.0～20.0 min， 10% A。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子（ESI）源； 離子源溫度： 550℃； 正離子掃描； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)； 霧化氣（Gas1）流量：55.0 L/h； 加熱輔助氣（Gas2）流量： 55.0 L/h； 氣簾氣（Curtain gas）流量： 30.0 L/h； 噴霧電壓（IS）： 5500 V； 其余質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表 1。

2.4 樣品預(yù)處理

稱取粉碎均勻試樣2.0 g（干制食用菌樣品稱樣量為1.0 g）， 加入10 mL水， 然后加入10 mL 2%甲酸乙腈溶液（2∶98， V/V）和2.0 g NaCl， 渦旋振蕩5 min， 在4℃ 15000 r/min離心10 min， 上層液轉(zhuǎn)移至已提前放入 50 mg C18、120 mg PSA、500 mg MgSO4的15 mL離心管中， 渦旋振蕩5 min， 在5℃以15000 r/min離心10 min， 上清液移至15 mL離心管中， 于50℃平衡定量濃縮儀中濃縮至干。 殘留物加1.0 mL乙腈渦旋溶解， 過(guò)0.2 μm濾膜， 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件優(yōu)化

選擇對(duì)弱極性較強(qiáng)化合物分離較好的3種色譜柱Phenomenex Kinetex C18（100 mm × 2.1 mm， 2.6 μm）、 RESTEK ultra AQ C18 （100 mm×2.1 mm， 3.0 μm）和Thermo Hypersil GOLD C18 （100 mm × 2.1 mm， 3.0 μm）對(duì)7種熒光增白劑進(jìn)行分離， 結(jié)果表明， ESTEK ultra AQ C18和Thermo Hypersil GOLD C18這兩款色譜柱無(wú)法保留C.I. 162， 且其它6種熒光增白劑保留時(shí)間不穩(wěn)定； Phenomenex Kinetex C18色譜柱對(duì)7種熒光增白劑有較好的保留， 穩(wěn)定性好， 因此選擇Phenomenex Kinetex C18進(jìn)行分析。 通過(guò)對(duì)3種色譜柱的比較， 發(fā)現(xiàn)色譜柱的粒徑對(duì)7種熒光增白劑的分離有較大影響， 粒徑越小， 分離效果越好。

在不同流動(dòng)相色譜條件下3種色譜柱均難以基線分離C.I. 367和C.I. 393， 只能進(jìn)行質(zhì)譜分離。

比較了乙酸銨溶液和甲酸溶液緩沖溶液對(duì)7種熒光增白劑的質(zhì)譜響應(yīng)和色譜分離的影響， 結(jié)果表明， 使用乙腈0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相， 7種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)顯著增加， 色譜峰峰形尖銳， 對(duì)稱性好， 所以本研究選擇乙腈0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相（圖1）。

3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化通過(guò)在流動(dòng)注射模式下對(duì)1.0 μg/mL的7種熒光增白劑單獨(dú)進(jìn)樣完成。在正離子模式下， ESI中7種熒光增白劑的靈敏度明顯高于APCI。采用一級(jí)質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行母離子全掃描， 分析得到[M+H]+分子離子峰； 再采用二級(jí)質(zhì)譜， 以分子離子為母離子， 優(yōu)化CE、DP、EP、CXP等參數(shù)， 對(duì)目標(biāo)化合物的子離子進(jìn)行全掃描， 選擇信噪比比較高的兩個(gè)子離子， 與分子離子組成定性和定量離子對(duì)。由于C.I.367和C.I.393結(jié)構(gòu)相似， 色譜條件難以分離， 通過(guò)優(yōu)化質(zhì)譜條件， C.I.367的母離子為m/z 363、定量離子為m/z 270； C.I.393的母離子為m/z 415、定量離子為m/z 321， 兩種熒光增白劑通過(guò)質(zhì)譜可以很好地進(jìn)行定性與定量分析。7種熒光增白劑分子結(jié)構(gòu)中都含有苯基集團(tuán)， 分子結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定， 因此， 優(yōu)化過(guò)程中所需的碰撞能量較大。

3.3 QuEChERS處理?xiàng)l件優(yōu)化

3.3.1 萃取溶劑的優(yōu)化 選擇陰性鮮香菇為實(shí)驗(yàn)材料， 添加3.0 μg/kg 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液， 每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，采用外標(biāo)法對(duì)萃取溶劑進(jìn)行優(yōu)化。萃取溶劑選取了QuEChERS方法中常用的5種試劑： 乙腈、2%甲酸乙腈溶液（2∶98， V/V）、0.5%氨水乙腈溶液（0.5∶99.5， V/V）、乙酸乙酯、丙酮。

結(jié)果（見(jiàn)圖2）表明， 用乙酸乙酯和丙酮提取時(shí)， 7種熒光增白劑的回收率低于50%， 達(dá)不到檢測(cè)要求； 用0.5%氨水乙腈溶液提取時(shí)， C.I. 393和C.I. 184的回收率達(dá)不到檢測(cè)要求； 用乙腈、酸化乙腈提取時(shí)， 回收率均可滿足檢測(cè)方法的要求， 但是乙腈提取時(shí)C.I.184峰形較差， 基質(zhì)影響大； 加入2%甲酸后， 減少了基質(zhì)對(duì)各種熒光增白劑組分干擾。因此， 本研究選擇2%甲酸乙腈溶液作為提取劑。

3.3.2 吸附條件的優(yōu)化 目前常用的吸附劑主要有 C18、PSA 和 GCB（石墨化炭黑）。本研究選擇陰性鮮香菇為實(shí)驗(yàn)材料， 添加3.0 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液， 每個(gè)樣品平行測(cè)定3次， 采用外標(biāo)法對(duì)吸附劑進(jìn)行優(yōu)化（圖3）。結(jié)果表明， C18用量在20～90 mg范圍內(nèi)， 7種熒光增白劑的回收率在35%～104%之間， C18用量為50 mg時(shí)7種熒光增白劑回收率達(dá)到最高（95%～104%）； PSA用量在40～200 mg范圍內(nèi)， 7種熒光增白劑的回收率為25%～102%， 用量為120 mg時(shí)7種熒光增白劑回收率達(dá)到最高（94%～102%）； MgSO4用量在200～900 mg范圍內(nèi)， 7種熒光增白劑的回收率在36%～106%之間， 在500 mg時(shí)， 7種熒光增白劑回收率達(dá)到最高（94%～106%）。 本研究最終選擇50 mg C18， 120 mg PSA和500 mg MgSO4為最佳吸附條件。

3.3.3 離心條件和濃縮條件的優(yōu)化 QuEChERS前處理方法中多采用無(wú)水MgSO4替代無(wú)水Na2SO4作為脫水劑， 因?yàn)闊o(wú)水MgSO4具有更強(qiáng)的脫水效果、更細(xì)的顆粒， 但其在吸水過(guò)程中放熱劇烈， 在渦旋過(guò)程中產(chǎn)生的熱氣會(huì)將離心管的蓋沖開(kāi)， 影響7種熒光增白劑的回收率。 本實(shí)驗(yàn)采用低溫高速離心分離提取液， 再加入無(wú)水MgSO4等， 此時(shí)放熱比較溫和， 不會(huì)出現(xiàn)很多的熱氣， 而放出的熱量剛好將提取液的溫度提高到37℃左右， 這個(gè)溫度既不會(huì)導(dǎo)致7種熒光增白劑分解， 還可以減少食用菌基質(zhì)干擾， 提高提取效率。為了提高7種熒光增白劑的檢出限量， 本研究選擇平行樣品定量濃縮儀減壓濃縮樣品提取液， 并對(duì)濃縮的條件進(jìn)行優(yōu)化， 確定濃縮溫度為40℃； 冷凝溫度為

2℃； 真空度采用梯度下降的方式（30.0 kPa 6 min， 10.0 kPa 6 min， 4.0 kPa濃縮至干）。本方法可以同時(shí)濃縮處理24份樣品提取液， 完全濃縮至干僅需0.5 h， 有效降低了檢測(cè)成本， 提高了檢測(cè)質(zhì)量和效率。

3.3.4 鹽濃度的影響 在提取過(guò)程中， 向樣品溶液中加入無(wú)機(jī)鹽， 既可以改變待測(cè)組分的提取效率， 又可以使兩相間的分層更加明顯[4]。在其它實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下， 選擇陰性鮮香菇為實(shí)驗(yàn)材料， 添加3.0 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液， 每個(gè)樣品平行測(cè)定3次， 采用外標(biāo)法對(duì)NaCl的添加量（0.0～4.0 g）進(jìn)行優(yōu)化（圖3）。結(jié)果表明， 加入2.0 g NaCl時(shí)， 7種熒光增白劑的回收率最高， 增加NaCl的添加量， 回收率反而下降， 這是因?yàn)檫m量的NaCl能增加溶液的離子強(qiáng)度， 加大目標(biāo)物從水相到萃取劑的傳質(zhì)效率， 但NaCl濃度過(guò)大會(huì)導(dǎo)致萃取效率降低。因此， 本實(shí)驗(yàn)選擇在樣品中加入2.0 g NaCl。

3.4 方法學(xué)驗(yàn)證

3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限 準(zhǔn)確量取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備工作液， 用乙腈溶液稀， 配制混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液。結(jié)果表明， 各種化合物在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好， 相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.9900， 以3倍和10倍信噪比分別計(jì)算檢出限（LOD）和定量限（LOQ）（以鮮食用菌計(jì)）， 結(jié)果見(jiàn)表2。

3.4.2 方法準(zhǔn)確度和精密度 在陰性食用菌樣品（包括鮮平菇、干香菇和凍干松茸）中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)， 并進(jìn)行精密度驗(yàn)證。 在鮮平菇樣品中添加1.5、 3.0和15 μg/kg濃度水平標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行6次平行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)， 平均回收率在70.1%～109.2%之間， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.2%～7.0%之間（見(jiàn)表3）； 在干香菇樣品中添加3.0、 6.0和30 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行濃度水平6次平行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)， 平均回收率在74.2%～107.5%之間， RSD在3.2%～7.2%之間（表4）； 在凍干松茸樣品中添加3.0、 6.0和30 μg/kg濃度水平標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行6次平行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)， 平均回收率在76.4%～108.5%之間， RSD在2.5%～6.5%之間（見(jiàn)表5）。

3.5 實(shí)際樣品分析

利用本方法檢測(cè)14批實(shí)際樣品（包括3批鮮香菇樣品、5批鮮平菇樣品、4批干香菇樣品和2批凍干松茸樣品）， 在1批鮮香菇樣品中檢出熒光增白劑C.I. 393， 檢出量為16.7 μg/kg。

本研究結(jié)果表明， 建立的食用菌中7種熒光增白劑的 UPLCMS/MS的檢測(cè)方法靈敏、快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、省時(shí)、穩(wěn)定， 實(shí)用性強(qiáng)， 方法學(xué)結(jié)果滿足GB/T 274042008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》的技術(shù)要求， 適用于食品實(shí)驗(yàn)室大批量檢測(cè)食用菌樣品。

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