諸 穎 孔華庭 張繼超 王麗華 胡 鈞 樊春海

（中國科學院上海應用物理研究所 物理生物學研究室 中國科學院微觀界面物理與探測重點實驗室上海同步輻射光源生物成像中心 嘉定園區(qū) 上海 201800）

基于催化聚合的同步輻射X射線成像標簽

諸 穎 孔華庭 張繼超 王麗華 胡 鈞 樊春海

（中國科學院上海應用物理研究所 物理生物學研究室 中國科學院微觀界面物理與探測重點實驗室上海同步輻射光源生物成像中心 嘉定園區(qū) 上海 201800）

同步輻射X射線顯微成像具有極高的空間分辨率、很好的穿透深度和優(yōu)秀的能量分辨，因而在納米分辨細胞成像領(lǐng)域具有巨大的應用潛力。然而，目前X射線顯微技術(shù)多用于細胞結(jié)構(gòu)成像，而和該技術(shù)相適合的特異性識別細胞內(nèi)重要生物靶標的分子探針仍較缺乏。本工作利用同步輻射X射線良好的能量分辨特點，經(jīng)體外化學催化反應成功制備了同步X射線可見的成像標簽，成像分辨率達到30 nm。研究結(jié)果為進一步制備X射線敏感的分子探針，實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物分子的特異性識別和成像打下了良好的基礎。

3,3'-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽，催化，聚合物，同步X射線，成像標簽

顯微成像技術(shù)是細胞生命科學發(fā)展的主要推動力之一?；谕絏射線的顯微技術(shù)在細胞成像領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢[1?5]。由于X射線的波長在0.1?10nm范圍內(nèi)，因此其天然就是一種超分辨顯微成像技術(shù)，分辨率理論上能夠達到數(shù)個納米。另外，與電子束相比，X射線對生物樣品的穿透力更強，因此不需要經(jīng)過切片等處理就能對完整細胞進行成像。更重要的是X射線顯微成像技術(shù)具有很好的能量分辨，能精確分辨很多元素的吸收譜。因此，結(jié)合X射線敏感的成像探針，能夠?qū)崿F(xiàn)對細胞內(nèi)生物分子的高分辨識別和成像。

在光學顯微成像中，熒光標簽常被用來標記生物分子。在X射線成像中，同樣可以利用X射線本身的特點來開發(fā)成像標簽，從而應用于制備生物探針，實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物分子的識別和成像。目前，研究人員已經(jīng)應用X射線對金屬納米顆粒的特征吸收，在納米顆粒上連接抗體從而對特定生物分子進行識別并成像[6?8]。但是，細胞內(nèi)含有大量競爭性生物分子，如何保證對感興趣生物分子的標記特異性是一大瓶頸。因此，現(xiàn)階段開發(fā)新型同步X射線可見的成像標簽，實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物分子的精確識別和定位具有十分重要的意義。

本工作建立并優(yōu)化了體外抗壞血酸過氧化物酶(Enhanced Ascorbate Peroxidase 2, APEX2)催化3,3'-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(3,3'-diaminobenzidine, DAB)分子聚合反應的體系，篩選了同步X射線成像能量，在30 nm分辨率下成功實現(xiàn)了對DAB聚合物的成像觀測（圖1）。研究結(jié)果為其進一步應用于納米分辨細胞成像領(lǐng)域打下了良好的基礎。

圖1 DAB經(jīng)催化反應聚合生成同步X射線可見的成像標簽示意圖Fig.1 Schematic showing of dense DAB reaction product as an X-ray imaging tag.

1 實驗材料

1.1 實驗試劑

BL21大腸桿菌感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司；氨芐霉素、異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)和10×磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Luria-Bertani Agar（LB培養(yǎng)基）粉末購自ThermoFisher Scientific上海公司；葡萄糖、NaCl、NaH2PO4?2H2O、MgCl2?6H2O、甘油購自國藥集團化學試劑有限公司（上海）；溶菌酶、2-巰基乙醇、咪唑、Non-Detergent Sulfobetaine-201 (NDSB-201)、30%過氧化氫和DAB購自Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司；Ni-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA)瓊脂糖柱購自德國QIAGEN公司；Cocktail蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche公司；30 kDa超濾管購自美國Millipore公司；氮化硅窗口購自上海昭沅儀器設備有限公司。

1.2 主要儀器

超純水儀系統(tǒng)(Advantage A10)：美國Millipore公司；恒溫搖床(TS211B)：上海天實驗儀器制造有限公司；低速離心機(L535R)：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；超聲破碎儀(Q700)：美國QSonica公司；高速離心機(CT15RE)：日本HITACHI公司；酶標儀(SynergyH1)：美國Biotek公司。

2 實驗方法

2.1 APEX2蛋白表達和純化

pTRC-APEX2質(zhì)粒由Alice Ting贈予(Addgene plasmid # 72558)，加入感受態(tài)細胞，冰上放置30min，42 °C熱激，加入LB培養(yǎng)基，37 °C、150r·min?1培養(yǎng)1 h，取適量菌液涂布于氨芐抗性的LB 瓊脂糖平板上，培養(yǎng)過夜。

挑取單克隆，接種到1 mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，37 °C、220 r·min?1培養(yǎng)過夜。將1 mL菌液接種到500 mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，37 °C、 220 r·min?1培養(yǎng)約5 h，待菌液光密度(Optical Density, OD)值達到0.6時加IPTG至濃度為420μmol·L?1，加入1 mmol·L?15-氨基乙酰丙酸，18 °C、220 r·min?1誘導培養(yǎng)16 h。離心收集菌體并超聲裂解。使用Ni-NTA瓊脂糖親和柱純化并洗脫APEX2蛋白。APEX2蛋白的純化步驟參照文獻[9]。

2.2 體外催化DAB分子聚合反應體系的建立

室溫條件下，將DAB水溶液和H2O2分別加到pH 7.4的 PBS緩沖液中，DAB終濃度為0.4mg·mL?1，H2O2終濃度為10 mmol·L?1，混勻。加入APEX2蛋白，使最終濃度分別為50 nmol·L?1和100 nmol·L?1，加入96孔板，在酶標儀595 nm波長下，每分鐘讀取吸光值，根據(jù)得到的曲線篩選該催化反應的最佳反應時間和APEX2濃度。

2.3 同步X射線成像

使用上述最佳反應條件在EP (Eppendorf)管中催化DAB分子聚合。DAB聚合物的X射線成像實驗在上海光源BL08U1軟X射線譜學顯微線站進行，實驗方法為軟X射線掃描透射成像。如圖2所示，X射線經(jīng)波蕩器引出，經(jīng)過平面光柵單色器單色化后由波帶片聚焦到樣品上，然后由快速正比計數(shù)探測器(Photomultiplier Tube, PMT)探測透射光子。光子能量范圍為250?2000 eV，空間分辨率為30 nm。DAB聚合物懸液滴在氮化硅窗上，干燥后放置在真空樣品室中，選取X射線入射能量為525eV。移動運動電機，完成DAB樣品的尋找、對焦，然后進行軟X射線成像，成像步長為30 nm× 30nm，停留時間為2 ms，成像分辨率為30nm。

3 實驗結(jié)果

3.1 APEX2蛋白表達與純化

pTRC99A-APEX2原核表達質(zhì)粒在大腸桿菌中表達，收集細菌細胞提取蛋白并純化后，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE)結(jié)果顯示在分子量30 kDa的位置有一條清晰的條帶（圖3），表明該質(zhì)粒成功表達了APEX2蛋白且純度較高，可用于進一步實驗研究。

3.2 體外催化DAB分子聚合反應體系的建立

進一步，我們研究了PBS緩沖液中APEX2催化DAB分子聚合的濃度和時間依賴效應。結(jié)果顯示，加入50 nmol·L?1APEX2時，H2O2-DAB混合反應體系的光吸收值緩慢增加，而加入100 nmol·L?1APEX2時，該反應體系的光吸收值迅速增加，15min即達到平臺期，且光吸收值是前者的數(shù)倍，說明體系中加入100 nmol·L?1APEX2更有利于迅速得到大量的DAB聚合物（圖4）。因此，接下來的體外催化實驗中，選擇100 nmol·L?1APEX2和H2O2-DAB混合溶液反應15min作為最佳反應條件。

圖3 純化的APEX2蛋白的SDS-PAGE圖泳道1：蛋白marker，泳道2：APEX2Fig.3 SDS-PAGE of purified APEX2. Lane 1: Protein marker, Lane 2: APEX2

圖4 APEX2催化DAB分子聚合的時間和濃度效應Fig.4 Time- and dose-dependent effects of APEX2 on catalyzing the H2O2-dependent polymerization of DAB.

3.3 同步X射線成像

使用上述最佳反應條件在EP管中催化DAB分子聚合。反應過程中，可見無色透明溶液逐漸變得渾濁，最后聚合生成肉眼可見的顆粒（圖5(a)）。在上海光源08U1A線站[4]對聚合物進行成像觀測，我們嘗試了284 eV、525 eV和710 eV等多個能量，發(fā)現(xiàn)525 eV能量下對聚合物能進行很好的成像（圖5(b)），空間分辨率達到30 nm（圖5(c)），說明該聚合物具有良好的X射線吸收特性，可以作為同步X射線成像標簽用于進一步的分子探針設計及細胞成像研究。

4 討論和結(jié)語

新的顯微成像技術(shù)和與之相適合的分子探針對于更好地理解細胞生命過程具有十分重要的意義。在過去的幾十年中，熒光顯微技術(shù)的出現(xiàn)結(jié)合熒光標記技術(shù)實現(xiàn)了對細胞內(nèi)各種生物大分子的示蹤，給探究細胞的各種生命活動提供了革命性的手段。但是，亞細胞結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)各種生物大分子大多處于10?100 nm尺度，由于阿貝(Ernst Abbe)光學衍射極限的存在(200?300 nm)，傳統(tǒng)的熒光顯微技術(shù)很難對100 nm以下的細胞超微結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)重要生物分子進行成像觀測[10]。免疫電鏡技術(shù)可在極高的空間分辨率(<10 nm)下對感興趣的生物分子進行成像，但是由于電子的穿透深度較差(100?150 nm)，實驗中需要對樣品進行復雜的切片等預處理，常導致結(jié)構(gòu)信息的損失[11]。20世紀90年代發(fā)展的超分辨熒光成像技術(shù)，通過減小激光焦點的尺寸（以受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)(Stimulated Emission Depletion Microscopy, STED)為代表）或單分子定位和位置重構(gòu)（以隨機光學重建顯微技術(shù)(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM)為代表）的方法突破光學衍射極限，實現(xiàn)了對細胞樣品的納米分辨成像。但是超分辨成像技術(shù)仍普遍存在成像速度慢、難以實現(xiàn)對多種生物分子同時標記等問題[12?13]。

圖5 DAB聚合物的同步X射線成像(a) EP管中DAB分子聚合過程成像，左：反應前，中：反應中，右：反應后，(b) 同步輻射X射線對DAB聚合物的成像，(c) 同步輻射X射線對標準靶的成像Fig.5 Synchrotron-based X-ray imaging of DAB polymer. (a) Generation of dense DAB product, Left: before the reaction, Middle: in progress, Right: after the reaction, (b) X-ray imaging of DAB polymer, (c) X-ray imaging of test star pattern sample

基于同步輻射的X射線成像技術(shù)是納米分辨細胞成像領(lǐng)域的“第三條道路”。該技術(shù)不需要經(jīng)過復雜的樣品預處理，以納米級空間分辨率對完整細胞進行成像。但是，目前X射線顯微技術(shù)多用于對細胞超微結(jié)構(gòu)的高分辨成像[14?15]，和該技術(shù)相適合的能夠?qū)毎麅?nèi)生物分子進行特異性識別的分子探針仍較缺乏。本工作應用X射線具有良好的能量分辨的特點，經(jīng)體外化學催化反應成功制備了同步X射線可見的成像標簽。相關(guān)研究結(jié)果為進一步制備X射線敏感的分子探針，實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物分子的特異性識別和成像打下了良好的基礎。

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Catalytic polymerization-based X-ray imaging tags

ZHU Ying KONG Huating ZHANG Jichao WANG Lihua HU Jun FAN Chunhai
(Division of Physical Biology & Bioimaging Center, Shanghai Synchrotron Radiation Facility, Key Laboratory of Interfacial Physics and Technology, Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences, Jiading Campus, Shanghai 201800, China)

Background: With short wavelengths, long penetration depth and excellent energy resolution of X-rays, synchrotron-based X-ray microscopy (XRM) has demonstrated its great potential for nanoscale cellular imaging. However, despite of the high-quality sub-cellular morphological details provided by XRM, it lacks appropriate molecular probes capable of localizing cellular targets. Purpose: This study aims to perform the preparation of X-ray imaging tags. Methods: In vitro chemical catalytic reaction was introduced to get the X-ray imaging tags. Results: By exploiting the excellent energy resolution of X-rays, synchrotron-based X-ray imaging tags were prepared with the imaging resolution of 30 nm when observed by soft X-ray microscopy at Shanghai synchrotron radiation facility (SSRF). Conclusion: The results indicate high potential to design X-ray sensitive molecular probes for cell imaging.

3,3'-diaminobenzidine (DAB), Catalysis, Polymer, Synchrotron-based X-ray, Imaging tag

ZHU Ying, female, born in 1981, graduated from Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences with a doctoral degree in 2008, professor, focusing on synchrotron-based X-ray microscopy

FAN Chunhai, E-mail: fchh@sinap.ac.cn

date: 2017-04-13, accepted date: 2017-04-21

TL99，O63

10.11889/j.0253-3219.2017.hjs.40.060103

中國科學院重大科技基礎設施開放研究項目、國家重點研發(fā)計劃(No.2016YFA0400902)、國家自然科學基金(No.11675251、No.21390414)、中國科學院青年創(chuàng)新促進會(No.2016236)、上海市青年科技英才揚帆計劃(No.17YF1423600)資助

諸穎，女，1981年出生，2008年于中國科學院上海應用物理研究所獲博士學位，研究員，研究方向為同步X射線顯微成像

諸穎、孔華庭、張繼超為本文共同第一作者

樊春海，E-mail: fchh@sinap.ac.cn

2017-04-13，

2017-04-21

Supported by Open Large Infrastructure Research of Chinese Academy of Sciences, National Key Research and Development Program

(No.2016YFA0400902), National Natural Science Foundation of China (No.11675251, No.21390414), the Youth Innovation Promotion Association of

Chinese Academy of Sciences (No.2016236), the Shanghai Sailing Program (No.17YF1423600)

ZHU Ying, KONG Huating, ZHANG Jichao contributed equally to this work.