李章春 ， 李 珀， 鄧超男， 羅 恒

(1黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，貴州 都勻 558000； 2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，貴州 貴陽 550004；3貴陽市第一人民醫(yī)院泌尿外科，貴州 貴陽 550003)

白皮杉醇抑制前列腺癌細(xì)胞株增殖、遷移與侵襲*

李章春1△， 李 珀2， 鄧超男2， 羅 恒3

(1黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，貴州 都勻 558000；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，貴州 貴陽 550004；3貴陽市第一人民醫(yī)院泌尿外科，貴州 貴陽 550003)

目的： 觀察白皮杉醇對前列腺癌細(xì)胞株DU145的細(xì)胞活力、遷移與侵襲能力的作用并初步討論其機制。方法: CCK-8法檢測不同濃度白皮杉醇(0、5、10、20、40和80 μmol/L)作用不同時間(12、24、36和48 h)對DU145細(xì)胞活力的影響；劃痕實驗與Transwell小室法分別檢測白皮杉醇對DU145細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響；Western blot法檢測p-JAK2與p-STAT3的蛋白水平。結(jié)果: CCK-8法結(jié)果顯示白皮杉醇呈濃度依賴性抑制DU145細(xì)胞的活力；給予白皮杉醇干預(yù)后，細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)顯著減少，p-JAK2與p-STAT3蛋白水平顯著下降。結(jié)論: 白皮杉醇呈濃度依賴性抑制前列腺癌細(xì)胞的生長，并具有抑制細(xì)胞遷移與侵襲的作用，其機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路有關(guān)。

白皮杉醇； 細(xì)胞活力； 細(xì)胞遷移； JAK2/STAT3信號通路

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是老年男性常見的一種惡性腫瘤，在全球各種癌癥的死亡率中位居第二[1]。我國的前列腺癌發(fā)病率低于西方發(fā)達(dá)國家，但隨著生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，老齡化人口的逐漸增多，前列腺癌的發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢，嚴(yán)重地影響我國老年男性健康[2]。前列腺癌的發(fā)病機制至今尚未清晰，大多數(shù)患者確診時已處于腫瘤中晚期，并出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[3]。

白皮杉醇(piceatannal，PIC)主要存在于葡萄、大黃和甘蔗中，不穩(wěn)定，易氧化[4]。研究表明其分子結(jié)構(gòu)中存在2個苯環(huán)和多個羥基，它們與白皮杉醇的抗氧化與清除氧自由基作用相關(guān)。多項研究發(fā)現(xiàn)白皮杉醇能夠抑制促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的酶，如環(huán)氧化酶、過氧化氫酶、細(xì)胞色素P450和核苷酸還原酶等，進(jìn)而干擾腫瘤細(xì)胞的生長，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用[5]。此外，白皮杉醇具有抗氧化作用，減緩過量活性氧和自由基對DNA的損傷，降低癌癥的發(fā)生率[6]。本文擬研究白皮杉醇對前列腺癌細(xì)胞株DU145的活力、遷移和侵襲能力的作用，并探討其初步的作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人前列腺癌DU145細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫；白皮杉醇購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；青霉素和鏈霉素購自華北制藥集團(tuán)公司；胰蛋白酶購自Sigma；CCK-8試劑購自武漢博士德生物工程有限公司；抗p-JAK2與p-STAT3抗體購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代 將DU145細(xì)胞加入含有10%胎牛血清，青霉素與鏈霉素各1×105U/L的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 更換培養(yǎng)基1次。實驗取對數(shù)生長期細(xì)胞。細(xì)胞傳代：待細(xì)胞融合至80%～90%，0.25%胰蛋白酶消化，吹打至細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用培養(yǎng)基重懸，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后換液。

2.2 CCK-8法檢測DU145細(xì)胞的活力 取在對數(shù)生長期的細(xì)胞懸液按每孔3×103個接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別加入白皮杉醇使最終濃度分別為0、5、10、20、40和80 μmol/L，分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36和48 h，棄去上清液，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，用酶聯(lián)儀于450 nm處測量吸光度(A)。

2.3 實驗分組 空白對照組(control)，不給藥處理；溶劑對照組(vehicle)，加入同等劑量的甲醇溶劑；藥物組(PIC組)，加入40 μmol/L的白皮杉醇；各組進(jìn)行相應(yīng)處理后繼續(xù)培養(yǎng)36 h，進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.4 劃痕實驗 收集各組細(xì)胞，以2×108/L接種于48孔板中，待細(xì)胞融合到80%～90%，用槍頭沿著與皿底垂直方向劃痕，PBS洗滌3次，加入無血清培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)胞遷移軌跡，記錄數(shù)據(jù)，計數(shù)。

2.5 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力 將4 ℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel，使終濃度為1 g/L，于小室底部中央垂直加入100 μL稀釋后的Matrigel，37 ℃溫育使成膠狀。將處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108/L，于Transwell小室的上室中加入100 μL細(xì)胞懸液，下室中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS洗2次，10%甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min，于倒置顯微鏡下觀察計數(shù)。

2.6 Western blot實驗 收集各組細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解，提取總蛋白后采用BCA法定量，調(diào)整蛋白濃度。取適量裂解產(chǎn)物，上樣后進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，加入5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，孵育相應(yīng) I 抗[p-JAK2(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)、JAK2(1∶4 000)、STAT3(1∶4 000)和GAPDH(1∶4 000)]，4 ℃孵育過夜，洗膜后，室溫孵育相應(yīng) II 抗1 h，洗膜，使用化學(xué)發(fā)光法試劑盒對PVDF膜進(jìn)行曝光顯影，成像掃描分析系統(tǒng)測定目的和內(nèi)參照條帶的吸光度。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組定量數(shù)據(jù)兩兩比較，符合方差齊性要求,各組間均數(shù)比較時采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 白皮杉醇對DU145細(xì)胞活力的影響

結(jié)果顯示，給予藥物干預(yù)的細(xì)胞存活率顯著下降，并隨時間延長而存活率降低，至36 h降到最低值，36 h與48 h的相對存活率無顯著差異。如圖1所示，36 h時20 μmol/L與40 μmol/L白皮杉醇對細(xì)胞的活力抑制率分別是(56.36±3.2)%與(44.54±3.2)%，為了得到較好的實驗結(jié)果，我們選取40 μmol/L白皮杉醇培養(yǎng)細(xì)胞36 h進(jìn)行后續(xù)實驗。

Figure 1.The effect on the survival rate of DU145 cells by piceatannol. Mean±SD.n=6.

圖1 白皮杉醇對DU145細(xì)胞相對存活率的影響

2 白皮杉醇對DU145細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示給予藥物干預(yù)的DU145細(xì)胞的遷移能力顯著低于空白對照組(P<0.05)，空白對照組與溶劑組間無顯著差異，見圖2。

Figure 2.The effect of piceatannol on the migration of DU145 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 白皮杉醇對DU145細(xì)胞遷移能力的影響

3 白皮杉醇對DU145細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，藥物組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，空白對照組和溶劑組侵襲的細(xì)胞數(shù)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 3.The effect of piceatannol on the invasion of DU145 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 白皮杉醇對DU145細(xì)胞侵襲能力的影響

4 白皮杉醇對p-JAK2與p-STAT3蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示藥物組細(xì)胞中的p-JAK2與p-STAT3蛋白水平顯著低于空白對照組(P<0.05)，空白對照組和溶劑組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。t-JAK2、t-STAT3的蛋白變化水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 4.The effect of piceatannol on the protein expression of p-JAK2 and p-STAT3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 白皮杉醇對p-JAK2與p-STAT3蛋白表達(dá)水平的影響

討 論

白皮杉醇是白藜蘆醇的羥基化類似物，二者具有相似的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗癌和清除自由基等[7]。研究發(fā)現(xiàn)白皮杉醇可以抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成，誘導(dǎo)細(xì)胞周期中G1期縮短，降低CDK2和CDK4的含量，并在24 h內(nèi)抑制CDK2和CDK4的活性[8]。我們研究發(fā)現(xiàn)白皮杉醇抑制前列腺癌細(xì)胞的存活率，與藥物濃度和時間具有依賴性。此外，實驗表明白皮杉醇具有抑制前列腺癌細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)的作用，提示白皮杉醇可能對前列腺癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲具有抑制作用。

STAT家族是體內(nèi)一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，對多種信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)具有非常關(guān)鍵的作用，其中STAT3與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)STAT3的異常表達(dá)與活化，具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)干擾STAT3表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞株SW1990體外侵襲力和動物體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力均減弱[10]。JAK家族蛋白包括JAK1、JAK2、JAK3及酪氨酸激酶2四個結(jié)構(gòu)功能相似的蛋白。通常，STAT3以非磷酸化的形式存在于胞漿中，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，STAT3磷酸化后被激活，進(jìn)入細(xì)胞核，通過與靶基因相應(yīng)的堿基對序列結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[11-12]。已有報道指出姜黃素的結(jié)構(gòu)類似物通過抑制JAK2/STAT3信號通路，進(jìn)而促進(jìn)了人腎癌細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的凋亡[13]；另外通過抑制JAK2/STAT3信號通路，抑制乳腺癌細(xì)胞周期并抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[14]。我們實驗發(fā)現(xiàn)給予白皮杉醇干預(yù)后，JAK2與STAT3的磷酸化水平均顯著下降，提示白皮杉醇可能通過抑制JAK2與STAT3的磷酸化，從而抑制相應(yīng)癌基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制前列腺細(xì)胞的活力、遷移與侵襲。

[1] Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer, statitics[J]. CA Cancer J Clin, 2007, 57(6):43-66.

[2] 吳階平, 顧方六, 郭應(yīng)祿, 等. 吳階平泌尿外科學(xué)[M]. 濟(jì)南： 山東科學(xué)技術(shù)出版社, 2005：965-980.

[3] Edlind MP, Hsieh AC. PI3K-AKT-mTOR signaling in prostate cancer progression and androgen deprivation therapy resistance[J]. Asian J Androl, 2014, 16(3):378-386.

[4] Son Y, Lee JH, Cheong YK, et al. Piceatannol, a natural hydroxylated analog of resveratrol, promotes nitric oxide release through phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase in human endothelial cells[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2015, 19(16):3125-3132.

[5] 劉芝蘭, 曾春嬌, 吳梅青, 等. 白藜蘆醇與白皮杉醇及赤松素研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報, 2013, 3(8):1043-1049.

[6] Seyed MA, Jantan I, Bukhari SN, et al. A comprehensive review on the chemotherapeutic potential of piceatannol for cancer treatment, with mechanistic insights[J]. J Agric Food Chem, 2016, 64(4):725-737.

[7] 李曉霞, 晏日安, 段翰英. 白皮杉醇的合成及抗氧化活性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2011, 37(4):78-81.

[8] Lee YM, Lim DY, Cho HJ, et al. Piceatannol, a natural stilbene from grapes, induces G1cell cycle arrest in androgen-insensitive DU145 human prostate cancer cells via the inhibition of CDK activity[J]. Cancer Lett, 2009, 285(2):166-173.

[9] 孫 瑩, 于 浩, 張 靈, 等. STAT3-siRNA對胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖與凋亡的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(2):393-395.

[10]Qiu Z, Huang C, Sun J, et al. RNA interference-mediated signal transducers and activators of transcription 3 gene silencing inhibits invasion and metastasis of human pancreatic cancer cells[J]. Cancer Sci, 2007, 98(7):1099-1106.

[11]Kim DJ, Chan KS, Sano S, et al. Signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3) in epithelial carcinogenesis[J]. Mol Carcinog, 2007, 46(8):725-731.

[12]Frank DA. STAT3 as a central mediator of neoplastic cellular transformation[J]. Cancer Lett, 2007, 251(2):199-210.

[13]Shen XJ, Wang HB, Ma XQ, et al. β, β-Dimethylac-rylshikonin induces mitochondria dependent apoptosis through ERK pathway in human gastric cancer SGC-7901 cells[J]. PLoS One, 2012, 7(7):e41773.

[14]Su JC, Lin KL, Chien CM, et al. Concomitant inactivation of the epidermal growth factor receptor, phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and Janus tyrosine kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 signalling pathways in cardiotoxin III-treated A549 cells[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010, 37(8):833-840.

(責(zé)任編輯： 林白霜, 羅 森)

Piceatannol inhibits prostate cancer cell proliferation, migration and invasion

LI Zhang-chun1， LI Po2， DENG Chao-nan2， LUO Heng3

(1SchoolofBasicMedicalSciences,QiannanMedicalCollegeforNationalities,Duyun558000,China;2DepartmentofPathology,TheAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China;3DepartmentofUrinarySurgery,GuiyangFirstPeople’sHospital,Guiyang550003,China.E-mail:medlizhangchun@163.com)

AIM: To investigate the effect of piceatannol on the viability, and the abilities of migration and invasion in the prostate cancer cells.METHODS: DU145 cells were treated with piceatannol at different doses (0, 5, 10, 20, 40 and 80 μmol/L) for different time (12, 24, 36 and 48 h) as indicated. The cell viability was assessed by CCK-8 assay. The migration and invasion abilities of the cells were analyzed by wound healing assay and Transwell assay, respectively. The protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 were detected by Western blot.RESULTS: Piceatannol dose-dependently decreased the cell viability. After treatment with piceatannol, the abilities of migration and invasion of the cells were significantly inhibited. Moreover, treatment with piceatannol resulted in marked decreases in the protein levels of p-JAK2 and p-STAT3. CONCLUSION: Piceatannol inhibits the viability, migration and invasion of the prostate cancer cells via regulating the JAK2/STAT3 signaling pathway.

Piceatannol; Cell viability; Cell migration; JAK2/STAT3 signaling pathway

1000- 4718(2017)06- 1130- 04

2016- 11- 16

2017- 02- 22

貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金項目(No. gzwkj2010-1-068)

R730.23； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.028

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0854-8308020; E-mail： medlizhangchun@163.com