劉英琦　曹莫　任志鑫

[摘要]目的：探討微等離子體與點陣Er：YAG激光（2940nm）對兔耳增生性瘢痕的治療效果。方法：同種屬雌性新西蘭大耳白兔6只，于每只兔耳腹側(cè)面中段制作增生性瘢痕模型。28d后，將造模成功的瘢痕塊隨機分為3組，分別行微等離子體、點陣激光治療和空白對照，治療后27d取材，進行HE、Masson和天狼猩紅染色，觀察各組瘢痕組織中成纖維細(xì)胞數(shù)目、膠原分布特征及Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的構(gòu)成比。結(jié)果：兩個治療組瘢痕組織變軟變平且彈性增加，成纖維細(xì)胞數(shù)均較對照組減少，以Plasma組更為明顯；膠原纖維的形態(tài)及排列向正常皮膚中的形態(tài)及排列轉(zhuǎn)變，Ⅲ型膠原纖維的比例均增加，兩治療組間無顯著差異。結(jié)論：微等離子體與點陣Er：YAG激光（2940nm）治療兔耳增生性瘢痕均有效，且在抑制瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞增生方面，微等離子體具有更明顯的優(yōu)勢。

[關(guān)鍵詞]激光；瘢痕；成纖維細(xì)胞；膠原；兔；微等離子體

[中圖分類號]R619⁺.6 [文獻標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）03-0066-04

成纖維細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積是增生性瘢痕的病理學(xué)基礎(chǔ)。干預(yù)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)活動，改變細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分：Ⅰ、Ⅲ型膠原的排列形態(tài)，可治療增生性瘢痕。點陣Er：YAG激光（2 940nm）目前己在治療凹陷性瘢痕方面取得了良好療效。微等離子體射頻技術(shù)也已成功用于細(xì)小皺紋、妊娠及凹陷性瘢痕的治療，且已證實二者在刺激膠原蛋白再生及改善膠原纖維排列方面療效突出。因此，我們采用微等離子與點陣Er：YAG激光治療兔耳增生性瘢痕，通過觀察各組兔耳增生性瘢痕的病理組織切片中成纖維細(xì)胞數(shù)目、膠原纖維排布特征，以及Ⅰ、Ⅲ型膠原構(gòu)成比例的變化來探討其對增生性瘢痕的治療是否有效，并比較二者的療效。

1資料和方法

1.1實驗動物和設(shè)備：同種屬新西蘭大白兔6只，雌性，體重（2.5±0.20）kg，采購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2008-2-001。實驗設(shè)備：①Plasma微等離子射頻儀（Alma Lasers，Israel）；②點陣Er：WAG激光（2 940hm）：（Asclepion MCL30 Dermablate，German）；③偏光顯微鏡，（Olympus，Japan）；④實驗試劑：天狼猩紅（Sigma，America）。

1.2動物模型制作：參照李薈元等動物增生性瘢痕模型的制作方法，速眠新、氯胺酮以1：1的比例混合后按0.2ml/kg肌注，全麻。于每只兔耳腹側(cè)面中段，用圓形環(huán)鉆沿長軸避開血管，各做4個直徑為8mm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，并刮除軟骨膜，共形成48個圓形創(chuàng)面（圖1）。創(chuàng)面1周左右上皮化后，去除痂皮，造模術(shù)后28d左右達到增生高峰，瘢痕塊顏色發(fā)紅、質(zhì)硬、明顯突起于周圍皮膚，但未超出原術(shù)野范圍（圖2a-a，2b-b）。隨機切取部分瘢痕組織，HE染色可見過度增殖的成纖維細(xì)胞、微血管、膠原纖維，認(rèn)為造模成功。

1.3實驗過程：造模術(shù)后28d，共形成增生性瘢痕42處，隨機分為3組：①Plasma治療組：無套管治療頭，0.6ms，80w，1遍；②點陣Er：WAG激光（2 940hm）治療組：微孔點陣模式，光斑13mm×13mm，分9層打孔，能量密度162J-/em²。③空白對照組：不做治療。治療后創(chuàng)面表面外涂紅霉素眼膏，繼續(xù)分籠避光飼養(yǎng)，未見水皰、紫癜及血皰等，恢復(fù)過程中未見感染。

1.4觀察和測量：造模術(shù)后55d，觀察并記錄各組兔耳創(chuàng)面愈合、瘢痕增生情況及經(jīng)治療后瘢痕顏色、質(zhì)地、厚度變化。麻醉成功后，11號尖刀切取兔耳增生性瘢痕組織對應(yīng)的全層兔耳，即刻放入中性福爾馬林緩沖固定液中，并分組標(biāo)記。4℃固定2周后，以全層兔耳為斷面，縱向截取瘢痕標(biāo)本，梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。①HE染色：在400倍普通光學(xué)顯微鏡下觀察兔耳增生性瘢痕組織的特征性結(jié)構(gòu)；每張兔耳瘢痕組織切片中央及兩側(cè)各隨機選取2個不重疊視野，分別記錄鏡下目測到的成纖維細(xì)胞數(shù)目；②Masson染色：400倍普通光學(xué)顯微鏡下觀察兔耳增生性瘢痕組織中膠原纖維形狀，密度以及排列走向情況；③天狼猩紅染色：將空白切片置于1%飽和苦味酸天狼星紅溶液染色1h，流水沖洗5min。蘇木精復(fù)染2min，常規(guī)分化返藍，流水沖洗，常規(guī)脫水，透明，封片。在400倍偏振光顯微鏡下觀察，Ⅰ型膠原纖維為粗大明亮且不均勻的紅色或黃色纖維，顯示很強的雙折光性，排列密集無序；Ⅲ型膠原纖維為纖細(xì)的綠色纖維，顯示弱的雙折光性，呈疏網(wǎng)狀分布于Ⅰ型膠原纖維周圍，攝片，麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析：以綠色纖維代表Ⅲ型膠原纖維，分析出圖像中綠色纖維的陽性總面積；以黃色和紅色纖維代Ⅰ型膠原纖維，分析出圖像中紅色黃色纖維的陽性總面積。將Ⅲ型膠原纖維的陽性總面積除以Ⅰ型膠原纖維的陽性總面積，計算出Ⅲ型膠原纖維比例。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理：統(tǒng)計各實驗組兔耳增生性瘢痕組織中不同視野下單位面積內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)目，Ⅲ型膠原所占比例，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS13.0軟件進行完全隨機分組的方差分析，以P<0.05作為判斷差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果

2.1大體觀察：對照組：瘢痕組織色紅、質(zhì)硬，突起于皮膚表面，但未超出原手術(shù)范圍；Plasma治療組：治療后即刻可見瘢痕組織表面均勻分布的焦黃色點狀微孔、少量點狀滲血及淡黃色滲液。創(chuàng)面自行結(jié)痂，10d左右完全脫落。取材前可觀察到瘢痕顏色變淺、質(zhì)地更接近周圍正常皮膚（圖2a、2b）。點陣Er-YAG激光治療組：治療后即刻可見均勻分布的白色至微黃的針尖狀氣化孔，無明顯滲出。痂皮較薄，一周左右自行脫落。至取材前可見瘢痕組織體積縮小，顏色較對照組變淡，質(zhì)地平軟，彈性增加（圖2b-a）。

2.2病理染色結(jié)果

2.2.1 HE染色：對照組：成纖維細(xì)胞大量增生且排列無序，微血管增生明顯（圖3a），成纖維細(xì)胞數(shù)（77.14±9.304）個/視野；Plasma治療組：成纖維細(xì)胞增生受抑，數(shù)目減少（圖3b），（59.12±10.344）個/視野；點陣激光治療組：成纖維數(shù)目變少，排列有序（圖3c），（66.00±7.943）個/視野。經(jīng)統(tǒng)計，3組標(biāo)本鏡下單位面積成纖維細(xì)胞數(shù)目有統(tǒng)計學(xué)差異（P=48.324，P=0.000<0.01）；SNK法多重比較結(jié)果顯示，三組標(biāo)本中任意兩組之間總體均數(shù)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），微等離子組較點陣激光組成纖維細(xì)胞數(shù)減少更為明顯。

2.2.2 Masson染色結(jié)果：對照組膠原纖維大量增生，形狀粗大且排布紊亂，可見旋渦結(jié)構(gòu)（圖4a）。兩治療組膠原纖維變細(xì)長且較對照組排列疏散并趨于一致（圖4b、4c）。

2 2.3偏光顯微鏡觀察與圖象分析：對照組瘢痕組織中，膠原纖維分布密集且無序，黃色粗大的Ⅰ型膠原纖維呈叢束狀分布，排列無序，粗細(xì)不均，約占整個視野的59.2%，呈細(xì)絲狀綠色的Ⅲ型膠原纖維呈網(wǎng)疏狀分布于Ⅰ型膠原周圍，約占（40.8±4.13）%（圖5a）；微等離子組：膠原纖維排列較對照組有序，且方向趨于一致，Ⅲ型膠原比例增加，約占（45.9±3.07）%（圖5b）。點陣激光組，膠原纖維分布疏散，排布漸規(guī)則，Ⅲ型膠原比例較對照組亦明顯增加，約占（44.4±3.06）%（圖5c）。不同處理組的兔耳增生性瘢痕組織中Ⅲ型膠原所占比例有統(tǒng)計學(xué)差異（F=5.745，P=0.008）；SNK法多重比較結(jié)果顯示，除了微等離子組與點陣激光組之間總體均數(shù)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義外，其余任兩組總體均數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），可認(rèn)為微等離子與點陣激光均能使兔耳瘢痕組織中Ⅲ型膠原比例增加，但二者無明顯區(qū)別。

3討論

增生性瘢痕形成的實質(zhì)是成纖維細(xì)胞的過度增殖，膠原蛋白的過度合成大大超過其分解代謝的速度，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積。作為細(xì)胞外間質(zhì)的主要成分，Ⅰ、Ⅲ型膠原起著最為重要的支撐作用。Ⅰ型膠原是早期創(chuàng)面瘢痕愈合的基礎(chǔ)，占據(jù)著整個瘢痕組織，抗張力性很強，決定了組織僵硬度。Ⅲ型膠原是正常皮膚組織中網(wǎng)狀纖維的主要組成成分，較前者伸展性和柔軟度好，決定組織的彈性。

瘢痕增生的早期即可觀察到組織內(nèi)膠原含量、比例及結(jié)構(gòu)的改變，臨床針對膠原的治療可明顯改善瘢痕質(zhì)地，因此通過干預(yù)膠原增生及排布情況來控制瘢痕增生的方法是科學(xué)可行的。

近年來激光醫(yī)學(xué)及射頻技術(shù)以其安全性高、創(chuàng)傷小的優(yōu)勢成為治療病理性瘢痕的新技術(shù)。本實驗將微等離子體與點陣Er：YAG激光（2940nm）可影響組織膠原的發(fā)生與發(fā)展這一特性運用于增生性瘢痕的早期干預(yù)，即在早期就開始誘導(dǎo)其膠原的含量及形態(tài)向正常組織轉(zhuǎn)化，以進一步改善預(yù)后，探討療效是否確切并進行對比，為臨床射頻技術(shù)和點陣激光治療增生性瘢痕提供理論依據(jù)。

微等離子是一項臨床治療瘢痕的新技術(shù)，它對成熟凹陷性瘢痕的療效已得到肯定，其單極射頻治療頭在即將接觸皮膚時利用射頻能量將空氣中氮氣分子，迅速解離成高能量的第四態(tài)物質(zhì)發(fā)射出來，即等離子體，引起表皮至真皮淺層的點狀微剝并形成陣列樣排列的“熱修正區(qū)”，促使膠原新生及重排，以填平皮膚表面的細(xì)紋及凹陷。微等離子作用于皮膚后不會引起表皮的完全氣化，而是形成點狀痂皮，直到皮膚組織完全修復(fù)才脫落，減少了創(chuàng)面感染、色素沉著的發(fā)生率。陸雯麗等發(fā)現(xiàn)經(jīng)微等離子治療后患處水腫程度較輕，結(jié)痂時間及紅斑期較短，大大減少患者的停工時間，大量臨床實驗均證明了微等離子體射頻技術(shù)對各類原因?qū)е碌鸟：鄣挠行裕侵委燅：鄣囊豁棸踩爷熜Ю硐氲募夹g(shù)。

點陣激光首先在治療萎縮性瘢痕方面取得了良好的療效，其原理為點陣式光熱作用：組織中水分子吸收能量后，產(chǎn)生矩陣狀排列的微熱損傷區(qū)，使周圍組織發(fā)生創(chuàng)傷愈合反應(yīng)來刺激真皮膠原再生、重構(gòu)，使治療區(qū)瘢痕更接近正常組織。點陣激光能精準(zhǔn)地汽化所到層次以上的皮膚，凝固層較薄，皮膚更快修復(fù)，術(shù)中痛感較微針等其他治療方法輕微，術(shù)后炎癥反應(yīng)輕、色素沉著發(fā)生率低，故更能被大眾所接受。但目前尚缺少治療增生性瘢痕方面的詳細(xì)報道。

本實驗證實，這兩種治療方法與對照組比較，均能提高兔耳增生性瘢痕中Ⅲ型膠原比例，改善膠原排列，并抑制成纖維細(xì)胞增生。兩種治療方法對比，微等離子治療后的兔耳增生性瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)減少較點陣組更為明顯，在提高Ⅲ型膠原比例方面兩治療組無明顯區(qū)別，這一結(jié)果為臨床Plasma治療增生性瘢痕提供了基礎(chǔ)理論證據(jù)。