陳得勝,林炎水

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 關(guān)節(jié)外科(成都 610500)

·論著·

富血小板血漿誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合軟骨支架治療兔激素性股骨頭壞死*

陳得勝,林炎水△

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 關(guān)節(jié)外科(成都 610500)

目的 觀察自體富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合同種骨軟骨支架治療早期兔激素性股骨頭壞死的療效，探索早期股骨頭壞死治療的新方法。方法 采用含有抗凝劑的真空采血管從實(shí)驗(yàn)兔的耳中央動(dòng)脈采取動(dòng)脈血5 mL，再通過(guò)離心方法獲取PRP，用16號(hào)骨髓穿刺針從實(shí)驗(yàn)兔自體股骨髓腔抽取骨髓5 mL，把抽取的骨髓進(jìn)行密度梯度離心，獲取兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)。對(duì)已獲取PRP和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行激素性股骨頭壞死造模，取同種股骨髁部骨軟骨制作軟骨支架，最后以制備的軟骨支架為載體，將經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植到軟骨支架上，形成細(xì)胞-支架復(fù)合物，用16號(hào)骨髓穿刺針對(duì)壞死的股骨頭進(jìn)行髓芯減壓術(shù)，術(shù)中將細(xì)胞-支架復(fù)合物植入壞死的股骨頭下。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為4組，每組20只，A組為空白對(duì)照；B組僅進(jìn)行髓芯減壓；C組髓芯減壓后植入經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞；D組髓芯減壓后植入細(xì)胞-支架復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)后在第2、4、8周各組分別處死6、6、8只，每只實(shí)驗(yàn)兔的股骨頭行大體標(biāo)本及組織學(xué)檢查。結(jié)果 D組治療效果最顯著，通過(guò)空骨陷窩計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)D組與其他各組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)PRP的誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化；軟骨支架材料為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化提供良好的空間結(jié)構(gòu)，有利于其向成骨細(xì)胞分化；PRP和軟骨支架材料聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)早期兔激素性股骨頭壞死的修復(fù)。

富血小板血漿；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；軟骨支架；激素性股骨頭壞死

股骨頭缺血性壞死是常見的骨科疾病，常會(huì)降低患者生活質(zhì)量，給家庭經(jīng)濟(jì)帶來(lái)負(fù)擔(dān)，其常見的病因有創(chuàng)傷、酒精和激素等，該病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。其病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前已知的和股骨頭壞死相關(guān)的病因有70多種[2]。已經(jīng)證實(shí)激素是引起股骨頭壞死的一大發(fā)病因素，激素會(huì)引起骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的活性降低，因此激素性骨頭壞死是與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的一類疾病，國(guó)內(nèi)外早已有應(yīng)用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療兔激素性股骨頭壞死的研究，主要集中在BMSCs對(duì)激素性股骨頭壞死的早期干預(yù)和成骨方面的修復(fù)，希望能有效逆轉(zhuǎn)該病的進(jìn)程，從而達(dá)到早期治療的目的。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可向多種細(xì)胞分化，經(jīng)過(guò)某些細(xì)胞因子的誘導(dǎo)能夠向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。但國(guó)內(nèi)外在BMSCs誘導(dǎo)和分化方面主要是使用外源性細(xì)胞因子或是基因轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行，但此方法價(jià)格昂貴、存在異源性問(wèn)題，且在使用過(guò)程中極易損失。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取自體富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)，并應(yīng)用PRP誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化。PRP是血小板濃縮物，其血小板含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)未經(jīng)處理的血液，血小板內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)因子豐富，如血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等。血小板濃縮物內(nèi)的生長(zhǎng)因子濃度較正常血小板內(nèi)更豐富，能夠促進(jìn)BMSCs的增殖和成骨分化的能力[3-4]。作為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)和分化的誘導(dǎo)劑，自體PRP與外源性細(xì)胞因子的作用機(jī)制不同，有自身的優(yōu)勢(shì)，如不存在異源性、獲取方便、價(jià)格低廉等。本研究將經(jīng)過(guò)PRP誘導(dǎo)過(guò)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與兔源性軟骨支架結(jié)合，形成細(xì)胞-支架復(fù)合物，通過(guò)髓芯減壓把細(xì)胞-支架復(fù)合物植入壞死的股骨頭以觀察該治療方案的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供2～3月齡新西蘭雄性大白兔120只，體質(zhì)量1.9～2.3 kg。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與材料 戊巴比妥鈉(上海哈靈化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)上海)；注射器、真空采血管 (洪達(dá)醫(yī)用耗材有限公司，中國(guó)重慶)；骨髓穿刺包(永寧醫(yī)療器械有限公司，中國(guó)揚(yáng)州)；胎牛血清(Hyclone公司，美國(guó))；Percoll細(xì)胞分離液(密度為1.077/mg)(Hyclone公司，美國(guó))；DMEM+F12培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))；胰蛋白酶消化液(Sigma公司，美國(guó))；肝素鈉(江蘇萬(wàn)邦制藥，中國(guó))。

1.1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用器械及材料 聚維酮碘、酒精，手術(shù)器械經(jīng)高溫消毒后使用。

1.2 方法

1.2.1 PRP的制備[5]和保存 先麻醉處理實(shí)驗(yàn)兔(用質(zhì)量比為3%的戊巴比妥鈉做麻醉劑，給量為1 mL/kg，通過(guò)兔耳緣靜脈推注)，麻醉生效后用真空采血管從兔耳中央動(dòng)脈抽取血液5 mL。按照Petrungaro法，分2次離心，第1次離心力為1 500×g，離心時(shí)長(zhǎng)間6 min，離心后可見離心管內(nèi)血液分為3層，上層液體的顏色較透明，為血小板血漿層，中間有一較薄的過(guò)渡層，為血小板血漿和紅細(xì)胞的交界處，下層液體為紅色，是紅細(xì)胞細(xì)胞沉淀物，用吸管吸取上清液面下至紅細(xì)胞與血小板血漿的過(guò)渡層液面稍下1 mm的全部液體，移置另一離心管內(nèi)，液體配平后離心，離心力為1 000×g，再次離心6 min，此時(shí)管內(nèi)液體僅為兩層，上層液體顏色較下層液體顏色稍淺，血小板含量較少，為貧血小板血漿，下層液體顏色較上層液體顏色稍深，血小板含量較豐富，為血小板濃縮物。吸取上層上清液丟棄，剩余部分液體為1 mL即為PRP，再與含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基99 mL混勻，即得到含PRP濃度為1%的細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞有成骨誘導(dǎo)作用，冰凍保存含PRP培養(yǎng)基備用[6]。

1.2.2 兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的獲取及原代培養(yǎng)[7]先麻醉處理實(shí)驗(yàn)兔(用質(zhì)量比為3%的戊巴比妥鈉做麻醉劑，給量為1 mL/kg，經(jīng)兔耳緣靜脈推注)，待麻醉生效后在實(shí)驗(yàn)兔膝關(guān)節(jié)前側(cè)常規(guī)備皮、消毒，以股骨髁部為進(jìn)針點(diǎn)，用16號(hào)骨髓穿刺針刺入股骨髓腔，用10 mL注射器(已用抗凝劑預(yù)濕)抽取骨髓約10 mL。用準(zhǔn)備好的50 mL玻璃離心管裝載抽取的骨髓(注意沿管壁緩慢注入)，在離心管內(nèi)加入等量體積含有10%胎牛血清的改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modifiedEagle medium，DMEM)，充分混勻液體。再將混勻后的液體移置備有等體積、密度為1．073 g/mL的Percoll細(xì)胞分離液的離心管中，配平液體，離心機(jī)離心，離心速度2 500 r/min、離心半徑8 cm、離心時(shí)長(zhǎng)30 min，離心后管內(nèi)液體分層明顯，共5層，其中第2層云霧狀液體即為富含骨髓基質(zhì)干細(xì)胞層，吸取第2層白色云霧狀的液體置入20 mL離心管內(nèi)，在離心管內(nèi)加入磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline，PBS)10 mL，將細(xì)胞吹打、漂洗，以1 500 r/min(離心半徑為8 cm)離心5 min，可見離心管底部有少許沉淀物，其余大部分液體為PBS沖洗液，底部沉淀物即為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，去除大部分PBS沖洗液，用10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹打、漂洗細(xì)胞，再次離心5 min(調(diào)整離心速度為1 000 r/min、離心半徑8 cm)，進(jìn)一步清洗細(xì)胞內(nèi)的雜質(zhì)，可見管內(nèi)液體仍為兩層，上層為DMEM沖洗液，下層沉淀物為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，僅保留離心管底部的沉淀物，再用5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹打細(xì)胞多次，完成細(xì)胞懸液制備。將制備好的細(xì)胞懸液移入容量為250 mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞2～3 d后半量換液，以后每3天全量換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)(培養(yǎng)液中加入1%的PRP進(jìn)行骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo))。取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 兔激素性股骨頭壞死模型建立 參照文獻(xiàn)[8]方法，對(duì)轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)環(huán)境的實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，在造模的過(guò)程中首先給予抗生素預(yù)防感染(腹腔注射阿米卡星1.63×104 U/kg、青霉素鈉5.0 mg/kg，1次/d，持續(xù)2周)，在首次抗生素給藥后24 h開始臀肌注射醋酸潑尼松龍20 mg/kg，首次激素給藥后48 h兔耳緣靜脈注射脂多糖5.0 μg/kg，注射脂多糖后24 h雙側(cè)臀肌間隔24 h交替注射醋酸潑尼松龍20 mg/kg各1次。

1.2.4 兔源性軟骨支架制備 參照文獻(xiàn)[7]方法麻醉狀態(tài)下處死實(shí)驗(yàn)兔，提取膝關(guān)節(jié)股骨髁部骨軟骨，用手術(shù)刀片把軟骨剔除下來(lái)，制作成長(zhǎng)條狀軟骨塊，用含有蛋白酶抑制劑的10 mM Tris-HCl液浸泡軟骨塊15～30 min，并以3 000 r/min離心3次，再將1 % Triton X-100 Tris-HCl 緩沖液(pH值為 7.5)浸泡經(jīng)過(guò)離心沖洗的軟骨塊，并放置在恒溫震蕩儀上震蕩48 h；震蕩后取出軟骨塊，置于含有1 U/mL RNase A，50 U/mL DNase Ⅰ的消化酶液中， 37 ℃下消化24 h，經(jīng)過(guò)消化后再用PBS反復(fù)沖洗，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 細(xì)胞-支架復(fù)合物的結(jié)合 取經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞移置到支架之前用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/cm2后將細(xì)胞接種到制備好的軟骨支架上，為在移植前細(xì)胞在支架上有良好的貼附，先將細(xì)胞-支架復(fù)合物在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一定時(shí)間，等細(xì)胞貼附在支架上后加入一定量的DMEM+F12細(xì)胞培養(yǎng)基，隔夜換液，2～3 d后將細(xì)胞-支架復(fù)合物通過(guò)髓芯減壓植入壞死股骨頭模型中，僅細(xì)胞-支架組移植，其他組均不移植。

1.2.6 不同組別動(dòng)物處理 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均用抗生素預(yù)防感染(腹腔注射阿米卡星1.63×104 U/kg、青霉素鈉5.0 mg/kg，持續(xù)2周)。A組無(wú)其他處理，B組以16號(hào)骨髓穿刺針進(jìn)行股骨頭髓芯減壓，C組髓芯減壓后植入1 mL密度為2×106個(gè)/cm2兔BMSCs，D組(髓芯減壓+細(xì)胞支架復(fù)合物組)經(jīng)過(guò)髓芯減壓后植入載有密度為2×106個(gè)/cm2的兔BMSCs的軟骨支架。

1.2.7 觀測(cè)指標(biāo) 對(duì)手術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷口愈合情況、進(jìn)食及活動(dòng)情況等進(jìn)行觀察。參照文獻(xiàn)[9]方法，于手術(shù)后第2、4 、8周各組分別處死6 、6 、8只實(shí)驗(yàn)兔，解剖B、C、D組實(shí)驗(yàn)側(cè)股骨頭，A組隨機(jī)取一側(cè)股骨頭解剖，對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行大體標(biāo)本和HE染色觀察。肉眼觀察實(shí)驗(yàn)兔各組股骨頭的表面情況，如顏色、是否有瘀斑、光滑度、是否有骨質(zhì)破壞和缺損等。把各組標(biāo)本做成病理切片，光鏡下觀察不同組別、同一組別不同時(shí)間段股骨頭骨質(zhì)、骨髓的組織結(jié)構(gòu)變化。光鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(10×40)計(jì)算空骨陷窩的數(shù)量，每個(gè)標(biāo)本5個(gè)高倍視野下空骨陷窩的總數(shù)納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。骨壞死診斷標(biāo)準(zhǔn)為：骨小梁連續(xù)性中斷，并可見彌漫性空骨陷窩或核皺縮，伴有周圍骨髓細(xì)胞壞死[10]?？展窍莞C百分率(%)=空骨陷窩數(shù)/總骨陷窩數(shù)×100%，骨壞死發(fā)生率(%)=任何一側(cè)股骨頭出現(xiàn)骨壞死的動(dòng)物數(shù)/組內(nèi)動(dòng)物總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兔BMSCs的培養(yǎng)及鑒定

原代細(xì)胞形態(tài)最初多成圓形或橢圓形，細(xì)胞貼壁時(shí)間為培養(yǎng)后1～2 d，細(xì)胞的形態(tài)由圓形或是橢圓形逐漸變?yōu)樗笮?，培養(yǎng)2～3 d后換液，5～7 d后細(xì)胞長(zhǎng)成集落狀，>90%的細(xì)胞貼壁完成。用流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果：CD29+細(xì)胞占92.76%，CD90+細(xì)胞占97.20%，CD45-細(xì)胞占99.20%。取3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 激素性股骨頭壞死模型建立

日常生存狀態(tài)觀察：第1次注射激素后所有實(shí)驗(yàn)兔較正常狀態(tài)下無(wú)明顯變化，正常進(jìn)食、飲水、活動(dòng)等。靜脈注射脂多糖后6～12 h實(shí)驗(yàn)兔的精神狀態(tài)變化較大，出現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)量減少，甚至俯臥不動(dòng)，進(jìn)食量減少，在脂多糖給藥后24～72 h內(nèi)實(shí)驗(yàn)兔死亡現(xiàn)象明顯，死亡率達(dá)20%。第2次進(jìn)行激素給藥后實(shí)驗(yàn)兔精神狀態(tài)開始恢復(fù)，活動(dòng)量、飲食量均好轉(zhuǎn)，實(shí)驗(yàn)兔死亡數(shù)量明顯減少。第3次激素給藥后實(shí)驗(yàn)兔的精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，進(jìn)食量增加、日?；顒?dòng)量增加。組織學(xué)觀察：股骨頭造模后對(duì)已經(jīng)死亡或處死瀕死實(shí)驗(yàn)兔取股骨頭標(biāo)本行HE染色觀察，造模1周后股骨頭骨小梁排列紊亂，連續(xù)性中斷，可見骨陷窩內(nèi)骨細(xì)胞缺失。造模后2周髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞明顯增多，脂肪栓塞形成，骨髓造血細(xì)胞減少，骨小梁內(nèi)空骨陷窩大量出現(xiàn)。造模3周后空骨陷窩率76%～90%，造模3周后股骨頭壞死率達(dá)100%。

2.3 激素性股骨頭壞死修復(fù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

2.3.1 一般情況 術(shù)后5只實(shí)驗(yàn)兔發(fā)生非計(jì)劃死亡，其中B組在術(shù)后1周內(nèi)死亡1只，C組在1周內(nèi)死亡1只，D組在術(shù)后1、2周分別死亡2、1只。術(shù)后3 d，各組傷口均出現(xiàn)輕微紅腫，5～7 d后紅腫逐漸消退，術(shù)后1～3 d內(nèi)實(shí)驗(yàn)兔活動(dòng)量、進(jìn)食量均較前減少，間歇性跛行，3 d后逐漸恢復(fù)(圖1)。

2.3.2 大體標(biāo)本觀察 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷口均無(wú)感染。A組肉眼可見股骨頭表面軟骨破壞，軟骨塌陷，表面顏色暗黑，大量瘀斑、充血，骨質(zhì)變脆，易于折斷。B組股骨頭表面粗糙，局部顏色暗黑，可見瘀斑和充血現(xiàn)象，隨著時(shí)間變長(zhǎng)，暗黑顏色變淺，8周時(shí)局部瘀斑、充血范圍減小。C組股骨頭術(shù)后2周顏色仍暗黑，局部瘀斑、充血，4周時(shí)股骨頭表面顏色變淺，瘀斑、充血范圍減小，8周時(shí)股骨頭表面顏色變淺，瘀斑、充血現(xiàn)象明顯改善。D組術(shù)后2周時(shí)股骨頭仍可見瘀斑、充血，4周時(shí)局部瘀斑、充血范圍較前明顯減少，股骨頭顏色暗黑現(xiàn)象較前減輕；8周時(shí)股骨頭軟骨面光滑，顏色接近正常兔股骨頭(圖2)。

圖1 實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后情況

注：A：實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后1 d坐立不起，精神萎靡，飲食、活動(dòng)量均明顯減少，甚至不愿意活動(dòng)、進(jìn)食；B：術(shù)后3 d實(shí)驗(yàn)兔開始恢復(fù)進(jìn)食，活動(dòng)量較前增加;C：實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后2周傷口愈合良好;D：實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后3 d開始半蹲位活動(dòng)，精神狀態(tài)較前好轉(zhuǎn)

圖2 術(shù)后大體標(biāo)本情況

注：A：8周時(shí)A組肉眼可見股骨頭表面軟骨破壞，骨面粗糙，表面顏色暗黑，大量瘀斑、充血，骨質(zhì)變脆，易于折斷；B：8周時(shí)B組股骨頭表面粗糙、不平整，局部顏色較同期A組稍淺；C:8周時(shí)C組股骨頭顏色變淺，與同期A、B兩組對(duì)比明顯;D:8周時(shí)D組可見股骨頭表面光滑、平整，股骨頭顏色淺淡，無(wú)明顯瘀斑、充血現(xiàn)象，接近正常

2.3.3 組織學(xué)觀察 術(shù)后第2、4、8周解剖已死亡或者處死實(shí)驗(yàn)兔，A組隨機(jī)取一側(cè)股骨頭，B、C、D組取實(shí)驗(yàn)側(cè)股骨頭， HE染色后光鏡下觀察。A組典型股骨頭缺血性壞死，骨小梁變細(xì)、斷裂，可見血管栓塞，空骨陷窩數(shù)無(wú)明顯變化。B組在術(shù)后2周時(shí)無(wú)明顯變化，髓腔內(nèi)可見脂肪栓塞，4周時(shí)逐漸有新骨出現(xiàn)，8周時(shí)新生骨數(shù)量較前明顯增多，但是骨組織的成熟程度一致。C組術(shù)后2周時(shí)鏡下可見少量成骨前體細(xì)胞和成骨細(xì)胞，4周時(shí)可見少量哈佛氏管內(nèi)細(xì)胞增加，但明顯低于未經(jīng)處理的正常兔。8周時(shí)空骨陷窩數(shù)量明顯減少，但是仍未完成骨改造。D組術(shù)后2周即出現(xiàn)空骨陷窩數(shù)量減少，并可見增生活躍的成骨細(xì)胞和少量的增生血管；4周時(shí)新生骨小梁形成，骨小梁內(nèi)的空骨陷窩數(shù)量進(jìn)一步減少；8周時(shí)空骨陷窩繼續(xù)減少，新生骨小梁排列整齊、連續(xù)，新生骨改造接近正常松質(zhì)骨(圖3和圖4)。各組術(shù)后2、 4 、8周股骨頭空骨陷窩計(jì)數(shù)見表1， D組空骨陷窩數(shù)與各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

圖3 A 、B兩組術(shù)后8周鏡下表現(xiàn)

注：A：A組8周時(shí)光鏡下(400×)顯示骨小梁斷裂，骨細(xì)胞數(shù)量減少;B：A組8周時(shí)光鏡下(400×)顯示骨小梁內(nèi)空骨陷窩布滿，骨細(xì)胞細(xì)胞核萎縮; C：B組8周時(shí)光鏡下(400×)顯示骨小梁內(nèi)可見多個(gè)空骨陷窩，骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則;D：B組8周時(shí)光鏡下(100×)顯示骨小梁塌陷、連續(xù)性中斷，髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞充盈

圖4 C、D兩組術(shù)后8周鏡下表現(xiàn)(400×)

注：A：C組光鏡下：骨陷窩豐富，空骨陷窩較少;B：C組光鏡下：骨小梁連續(xù)、排列較整齊;C：D組光鏡下骨陷窩內(nèi)骨細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，空骨陷窩數(shù)量少，可見新生血管形成;D：D組光鏡下骨小梁排列規(guī)律、連續(xù)、整齊

表1 各組術(shù)后2、4、8周后空骨陷窩計(jì)數(shù)(n=20)

注:與A組比較，#P<0.05;與B組比較，*P<0.05；與C組比較，*P<0.05

3 討論

股骨頭缺血性壞死是一種常見疾病，致殘率較高，早期表現(xiàn)為患肢疼痛、活動(dòng)障礙，晚期會(huì)出現(xiàn)一些列器質(zhì)性病變，如重度髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)、因股骨頭塌陷引起的肢體短縮，從而嚴(yán)重影響患者日常的行走和體力勞動(dòng)，致使患者生活質(zhì)量下降，嚴(yán)重者可喪失勞動(dòng)力，其病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前各種學(xué)術(shù)觀點(diǎn)的共識(shí)是：股骨頭內(nèi)血液循環(huán)障礙造成股骨頭缺血性壞死。激素是造成股骨頭壞死的一個(gè)重要原因。有研究發(fā)現(xiàn)股骨頭缺血性壞死患者的BMSCs數(shù)量減少，活性下降，國(guó)外研究[11]發(fā)現(xiàn)，在激素性股骨頭壞死中，激素可降低骨BMSCSc前體細(xì)胞的數(shù)量和活性，股骨頭缺血性壞死是與BMSCs相關(guān)的疾病。國(guó)內(nèi)外對(duì)BMSCs與股骨頭缺血性壞死之間的關(guān)系進(jìn)行的研究，主要集中在BMSCs對(duì)股骨頭缺血性壞死早期的干預(yù)和成骨方面的修復(fù)，如用細(xì)胞因子、化學(xué)試劑、仿生支架材料、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)來(lái)誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，從而達(dá)到治療股骨頭壞死的療效。近年發(fā)現(xiàn)PRP有促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的作用，其作用機(jī)制可能是和血小板血漿內(nèi)的某些生長(zhǎng)因子有關(guān)，如胰島素樣生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子等都是血小板血漿內(nèi)的主要成分[12]，這些生長(zhǎng)因子在誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化、促進(jìn)骨缺損的再生修復(fù)方面有重要的作用[13-16]。

細(xì)胞因子對(duì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化發(fā)揮重要作用，本實(shí)驗(yàn)采用自體PRP對(duì)BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)和分化，不存在異源性、獲取方便、價(jià)格低廉。 本實(shí)驗(yàn)還采取同種異體關(guān)節(jié)軟骨為原料制備軟骨支架，形成細(xì)胞-支架復(fù)合物移植治療兔激素性股骨頭壞死。關(guān)節(jié)軟骨支架與其他支架材料相比更有優(yōu)勢(shì)，它不但保持了軟骨基質(zhì)中的主要成分，其生物相容性和理化性質(zhì)也較良好，是可以開發(fā)和應(yīng)用的一種新型組織工程材料。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組別之間的股骨頭壞死修復(fù)差別顯著，D組效果最佳，且各組的空骨陷窩數(shù)隨治療時(shí)間增加而減少，但減少的數(shù)量和速度差異明顯，空骨陷窩減少的數(shù)量、速度與實(shí)驗(yàn)干預(yù)的方法、時(shí)間呈正相關(guān)。造成結(jié)果差異的原因可能與PRP增強(qiáng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的能力、外支架為種子細(xì)胞提供重要的媒介作用有關(guān)，但在PRP誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的最佳濃度、外支架材料最合適的大小、兔股骨頭壞死治療達(dá)到最佳療效的時(shí)間等方面還需進(jìn)一步研究。

[1]Song H J, Lan B S, Cheng B,etal. Peripheral blood stem cell transplantation for ischemic femoral head necrosis[J]. Transplant Proc, 2010, 42(5): 1862-1864.

[2] 孫偉. 骨頭壞死的病因、病理和發(fā)病機(jī)制[J]. 中華全科醫(yī)師雜志, 2006, 5(2): 75-77.

[3] Robiony M, Zorzan E, Polini F,etal. Osteogenesis distraction and platelet-rich plasma: combined use in restoration of severe atrophic mandible. Long-term results[J]. Clin Oral Implants Res, 2008, 19(11): 1202-1210.

[4] Pieri F, Lucarelli E, Corinaldesi G,etal. Effect of mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma on the healing of standardized bone defects in the alveolar ridge: a comparative histomorphometric study in minipigs[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2009, 67(2): 265-272.

[5] Petrungaro P S. Using platelet-rich plasma to accelerate soft tissue maturation in esthetic periodontal surgery[J]. Compend Contin Educ Dent, 2001, 22(9): 729-732.

[6] 劉玉英, 歐陽(yáng)錫林, 劉景漢. 富含血小板血漿冰凍保存及保存效果的研究[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 23(12): 1455-1456.

[7] 譚洪波, 崔運(yùn)利, 王富友, 等. 脫細(xì)胞骨軟骨支架復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)羊骨軟骨缺損的研究[J]. 中華關(guān)節(jié)外科雜志(電子版), 2010, 4(6): 765-771.

[8] 喻鈞倫, 羅天友, 吳少平, 等. 激素聯(lián)合脂多糖建立股骨頭缺血壞死模型兔的技術(shù)改良[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2015, 19(20): 3129-3133.

[9] 周傳友, 朱亞林, 賀瑞, 等. 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合rhBMP-2/rhVEGF治療兔早期激素性股骨頭缺血性壞死的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2011, 17(12): 1870-1873.

[10] Miyanishi K, Yamamoto T, Irisa T,etal. A high low-density lipoprotein cholesterol to high-density lipoprotein cholesterol ratio as a potential risk factor for corticosteroid-induced osteonecrosis in rabbits[J]. Rheumatology (Oxford), 2001, 40(2): 196-201.

[11] Hernigou P, Beaujean F, Lambotte J C. Decrease in the mesenchymal stem-cell pool in the proximal femur in corticosteroid-induced osteonecrosis[J]. J Bone Joint Surg Br, 1999, 81(2): 349-355.

[12] Fréchette J P, Martineau I, Gagnon G. Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing[J]. J Dent Res, 2005, 84(5): 434-439.

[13] Froum S J, Wallace S S, Tarnow D P,etal. Effect of platelet-rich plasma on bone growth and osseointegration in human maxillary sinus grafts: three bilateral case reports[J]. Int J Periodontics Restorative Dent, 2002, 22(1): 45-53.

[14] Tischler M. Platelet rich plasma. The use of autologous growth factors to enhance bone and soft tissue grafts[J]. N Y State Dent J, 2002, 68(3): 22-24.

[15] Fréchette J P, Martineau I, Gagnon G. Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing[J]. J Dent Res, 2005, 84(5): 434-439.

[16] Eppley B L, Woodell J E, Higgins J. Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma: implications for wound healing[J]. Plast Reconstr Surg, 2004, 114(6): 1502-1508.

A Study on the Therapeutic Effect of Platelet-rich Plasma Induced Bone Marrow Stromal Stem Cells Combined with Cartilage Scaffold in Treating Steroid-induced Femoral Head Necrosis of Rabbits

Chen Desheng, Lin Yanshui△.

Department of Orthopedics and Joint Surgery, The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China

Objective To observe the therapeutic effect of autologous platelet-rich plasma (PRP) induced bone marrow stromal stem cells (BMSCs) combined with the same osteochondral scaffolds in the treatment of early femoral head necrosis in rabbits and to explore a new method for the treatment of early steroid-induced femoral head necrosis. Methods 5 mL of arterial blood was taken from the central artery of the experimental rabbits by using the anticoagulant-containing vacuum blood collection tube. Then the platelet-rich plasma (PRP) was obtained from those blood by centrifugation. 5 mL of bone marrow was extracted from the autologous femoral cavity of the rabbits by the 16th bone marrow aspiration needle. The rabbit bone marrow stromal stem cells were obtained from those bone marrow by density gradient centrifugation for the primary culture and osteogenesis induction of cells. Then, the rabbits of the extracted PRP and BMSCs were made as the steroid-induced femoral head necrosis models. The same kind of femoral condyle bone cartilage was taken to produce the cartilage scaffold. Finally, BMSCs induced by osteogenesis were transplanted into cartilage scaffolds to form cell-scaffold complexes. The bone-core decompression was performed on the necrotic femoral head with the 16th bone marrow aspiration needle, and the cell-scaffold complex was implanted into the necrotic femoral head. The rabbits were divided into four groups and each group consisted of 20 rabbits. Different groups were given different interventions: Group A was the blank control; Group B was only given decompression of core decompression; Group C was treated with the implantation with osteoblast-induced cells after decompression; Group D was administered with the implantation with cell-scaffold complex. 6 rabbits in each group were sacrificed at Week 2 and 4 respectively, and the other 8 rabbits were sacrificed at Week 8. The gross and histological examinations were performed in all the femoral heads. Results The therapeutic effect of Group D was the most significant, and Group D was significantly different from the other three groups respectively in the numbers of empty bone lacunae (P<0.05). Conclusion The bone marrow stromal cells differentiate into osteoblasts by the induction of platelet-rich plasma. Cartilage scaffolds provide a good spatial structure for differentiation of bone marrow stromal cells into osteoblasts in order to differentiate into osteoblasts. Platelet-rich plasma and cartilage scaffolds can be combined together to promote the repair of early steroid-induced femoral head necrosis of rabbits.

Platelet-rich plasma; Bone marrow stromal stem cells; Cartilage scaffold; Steroid-induced femoral head necrosis

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170523.1116.010.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.03.006

四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目(No:120483)

R681.8

A

△通信作者：林炎水，E-mail：lys0596@163.com