栗偉娜,胡 佳，翟夢宇,高子彬,2

(1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2.河北省藥用分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，河北石家莊 050018)

手性色譜柱測定維格列汀中間體對映異構(gòu)體

栗偉娜1,胡 佳1，翟夢宇1,高子彬1,2

(1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2.河北省藥用分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，河北石家莊 050018)

為建立維格列汀中間體對映異構(gòu)體含量的測定方法，采用正相高效液相色譜法，色譜柱為Chiralpak?AD-H型手性色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為正己烷-乙醇-甲醇(三者體積比為65∶25∶10)，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣體積為10 μL，檢測波長為210 nm，柱溫為35 ℃。實(shí)驗(yàn)得知：維格列汀中間體與其對映異構(gòu)體的分離度良好，空白溶劑不干擾對映異構(gòu)體的含量測定；檢測限為27 ng/mL，定量限為81 ng/mL；重復(fù)性試驗(yàn)中，供試品所含對映異構(gòu)體含量的RSD值均小于2.0%；穩(wěn)定性試驗(yàn)中，12 h內(nèi)對映異構(gòu)體峰面積及含量的RSD值均小于2.0%；耐用性試驗(yàn)中，維格列汀中間體與其對映異構(gòu)體峰可實(shí)現(xiàn)完全分離，并且不同參數(shù)下對映異構(gòu)體含量的RSD值小于2.0%。結(jié)果表明，此方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性、耐用性良好，可用于維格列汀中間體對映異構(gòu)體含量的測定。

色譜分析；維格列汀中間體；高效液相色譜法；對映異構(gòu)體；含量測定

糖尿病是由于胰島素分泌及作用缺陷引起的以血糖升高為特征的慢性代謝疾病，口服的降糖藥包括胰島素增敏劑(噻唑烷二酮類和雙胍類)、胰島素分泌促進(jìn)劑(非磺酰脲類[1]、磺酰脲類[2]胰島素分泌促進(jìn)劑)、α-葡萄糖苷酶抑制劑等。近年來，噻唑烷二酮類藥物的幾個主要品種包括曲格列酮、羅格列酮、吡格列酮等在臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)了肝損傷、心血管風(fēng)險(xiǎn)及誘發(fā)癌癥風(fēng)險(xiǎn)等毒副作用[3-5]，限制了這類藥物的應(yīng)用。新型降糖藥二肽基肽酶-4抑制劑類藥物具有較好的安全性和耐用性，總不良反應(yīng)與安慰劑相似[6]。維格列汀是一種口服有效的二肽基肽酶-4抑制劑[7-9]，可有效改善2型糖尿病患者的血糖控制[10-13]，其藥理活性、降糖機(jī)理以及臨床療效已通過相關(guān)試驗(yàn)得到了證實(shí)[14-17]，為糖尿病患者提供了一種新的用藥選擇，顯示了良好的應(yīng)用前景。

(S)-1-(2-氯乙?；?吡咯烷-2-甲腈是維格列汀合成的關(guān)鍵中間體，維格列汀結(jié)構(gòu)中有一個手性中心，其對映異構(gòu)體幾乎全部由上述中間體合成過程[18-20]中的差向異構(gòu)化衍生而得，因此維格列汀中間體中的對映異構(gòu)體的控制對最終產(chǎn)品質(zhì)量控制至關(guān)重要。目前尚無維格列汀中間體對映異構(gòu)體含量測定方法的相關(guān)報(bào)道，正相手性色譜柱因其對對映異構(gòu)體有良好的分離效果而廣泛應(yīng)用于對映異構(gòu)體含量的測定中[21-25]。因此，本文采用正相高效液相色譜法，使用手性色譜柱對維格列汀中間體中對映異構(gòu)體含量的測定方法進(jìn)行研究。

1 主要儀器與試藥

1.1 主要儀器

日立L-2000型高效液相色譜儀，日本日立公司提供；AL-205型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司提供。

1.2 試劑與藥品

維格列汀中間體(自制，批號分別為131006，131015，131022，純度分別為99.27%，99.45%，99.31%)；維格列汀中間體對映異構(gòu)體對照品(自制，批號為DZWD01，純度為87.12%)；正己烷(色譜純，J.T.Baker)；乙醇(色譜純，J.T.Baker)；甲醇(色譜純，J.T.Baker)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Chiralpak?AD-H(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：正己烷-乙醇-甲醇(三者體積比為65∶25∶10)；流速：0.8 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.2 溶液配制

1)供試品溶液

取維格列汀中間體(批號為131006)50 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入乙醇溶解并稀釋，制成1 mL約含維格列汀中間體1 mg的溶液，作為供試品溶液。

2)對照品溶液

取維格列汀中間體對映異構(gòu)體對照品(批號為DZWD01)25 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，用乙醇溶解，制成1 mL約含維格列汀中間體對映異構(gòu)體0.5 mg的溶液，作為維格列汀中間體對映異構(gòu)體的對照品溶液。

3)系統(tǒng)適用性溶液

取維格列汀中間體50 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中；再精密量取上述對照品溶液1 mL，置于同一50 mL容量瓶中，用乙醇溶解，制成1 mL中含有維格列汀中間體對映異構(gòu)體約10 μg、含維格列汀中間體約1 mg的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

取乙醇、對照品溶液、供試品溶液和系統(tǒng)適用性溶液，分別采用高效液相色譜儀分析，記錄色譜圖，供試品溶液及系統(tǒng)適用性溶液的色譜圖見圖1和圖2。

圖1 供試品溶液高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of sample solution

圖2 系統(tǒng)適用性溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of system suitation

結(jié)果表明：溶劑(乙醇)不干擾對映異構(gòu)體的測定，維格列汀中間體與其對映異構(gòu)體完全分離。系統(tǒng)適用性結(jié)果詳見表1。

表1 系統(tǒng)適用性結(jié)果

2.3.2 檢測限與定量限

1)檢測限

取“2.2”項(xiàng)下維格列汀中間體對映異構(gòu)體對照品溶液適量，進(jìn)行逐級稀釋后進(jìn)樣，當(dāng)峰高約為基線噪音的3倍時測得檢測限，結(jié)果見表2。

表2 檢測限結(jié)果

2) 定量限

取“2.2”項(xiàng)下維格列汀中間體對映異構(gòu)體對照品溶液適量，進(jìn)行逐級稀釋后進(jìn)樣，當(dāng)峰高約為基線噪音的10倍時測得定量限，此時質(zhì)量濃度為81 ng/mL，結(jié)果見表3。

表3 定量限考察結(jié)果

由以上數(shù)據(jù)可知：3份定量限溶液的色譜圖中，信噪比均大于10，對映異構(gòu)體峰保留時間及峰面積重復(fù)性良好(RSD值小于2.0%)。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取維格列汀中間體適量，精密稱定，加入乙醇溶解并稀釋制成1 mL中含有維格列汀中間體1 mg的溶液，平行配制6份樣品溶液進(jìn)行檢測，采用面積歸一化測定樣品中對映異構(gòu)體的含量，結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性考察結(jié)果

表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：樣品中對映異構(gòu)體含量的RSD值(n=6)在2.0%以內(nèi)，說明該方法重復(fù)性好，能夠滿足對映異構(gòu)體的測定要求。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液于室溫放置，每隔2 h取樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行高效液相色譜儀分析，考察對映異構(gòu)體峰面積及其含量的變化情況。結(jié)果得知，對映異構(gòu)體峰面積及其含量的RSD值分別為0.51%和0.59%，將供試品溶液在室溫下放置，對映異構(gòu)體峰面積及含量在12 h內(nèi)均無明顯變化(RSD值小于2.0%)，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 耐用性試驗(yàn)

通過改變流動相配比、流速、柱溫、色譜柱批次，評估測定條件下參數(shù)微小變動時測定結(jié)果不受影響的承受程度。要求在色譜條件變動參數(shù)(見表5)下，維格列汀中間體與其對映異構(gòu)體分離度大于1.5，對映異構(gòu)體含量測定結(jié)果的RSD值不大于2.0%。耐用性考察結(jié)果見表6。

表5 色譜條件變動參數(shù)

表6 耐用性考察結(jié)果

結(jié)果表明：流動相配比、流速、柱溫、色譜柱的微小變動不影響分離，維格列汀中間體與其對映異構(gòu)體峰的分離度均大于1.5，并且不同參數(shù)下對映異構(gòu)體含量的RSD值小于2.0%，說明該方法耐用性好。

2.4 樣品測定

分別取批號為131006，131015，131022的維格列汀中間體適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，采用面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算。試驗(yàn)得知，3批維格列汀中間體對映異構(gòu)體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.06%，0.06%，0.05%。

3 討 論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

前期方法建立的試驗(yàn)結(jié)果表明，流動相中甲醇的加入對分離有重要作用。當(dāng)流動相為正己烷-乙醇(二者體積比為65∶35)時，維格列汀中間體與其對映異構(gòu)體不能分離；當(dāng)流動相為正己烷-乙醇-甲醇(三者體積比為65∶30∶5)時，維格列汀中間體與其對映異構(gòu)體取得良好的分離效果。隨著流動相中甲醇比例的增加，主峰保留時間縮短，靈敏度提高，但分離度減小。兼顧靈敏度與分離度，確定流動相為正己烷-乙醇-甲醇(三者體積比為65∶25∶10)。調(diào)整柱溫分別為30，35，40 ℃，考察柱溫對分離的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著柱溫的提高，保留時間縮短，分離度略有增大，但考慮色譜柱的溫度耐受范圍，在滿足分離的情況下選擇較低柱溫，因此最終確定柱溫為35 ℃。

3.2 樣品濃度的選擇

通過對比不同濃度樣品的分離圖譜及數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)樣品濃度對分離及峰形的影響較大。結(jié)果表明，維格列汀中間體濃度減小，分離度明顯增大，半峰寬減小。在滿足檢測靈敏度的前提下，選擇較低的樣品濃度對分離有利，因此確定樣品質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL。

4 結(jié) 語

本研究建立了采用手性色譜柱測定維格列汀中間體中對映異構(gòu)體含量的方法，由于維格列汀中間體和其對映異構(gòu)體具有相同的響應(yīng)值且在檢測濃度下主成分峰未出現(xiàn)超載現(xiàn)象，因此采用面積歸一化法可以準(zhǔn)確測定對映異構(gòu)體的含量。此方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性、耐用性良好，可作為維格列汀中間體的對映異構(gòu)體常規(guī)檢測方法。

本方法使用的色譜柱為多糖涂敷型正相手性柱，即固定相表面涂敷了手性多聚物(直鏈淀粉-三-(1，5-二甲苯基氨基甲酸酯))的球形硅膠。由于是物理涂敷，因此必須注意流動相的選擇。通常情況下用正己烷、乙醇、異丙醇為流動相，特殊情況下可使用甲醇和乙腈，但需嚴(yán)格控制流動相的混合比例，否則會影響分離甚至導(dǎo)致色譜柱的不可逆損傷，減少色譜柱使用壽命。此外，正相手性柱生產(chǎn)廠家很多，不同廠家的分離效果不同，使用時應(yīng)注意甄別。

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Determination of the vildagliptin intermediate enantiomer by chiralce-columns

LI Weina1， HU Jia1， ZHAI Mengyu1， GAO Zibin1,2

(1.School of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China; 2.State Key Laboratory Breeding Base-Key Laboratory of Molecular Chemistry for Drug of Hebei Province, Shijiazhuang, Hebei 050018, China)

In order to establish a NP-HPLC method for the determination of enantiomer in vildagliptin intermediate, the determination is carried out on the column of Chiralpak?AD-H(250 mm×4.6 mm, 5 μm), with the mobile phase ofn-hexane, ethanol and methanol(volume ratio of 65∶25∶10)at flow rate of 0.8 mL/min. The sample volume is 10 μL, the wavelength is 210 nm and the column temperature is 35 ℃. The result shows that the vildagliptin intermediate and its enantiomer could be well separated and detected effectively; blank solvent doesn't interfere with the enantiomer assaying; the detection limit is 27 ng/mL and the quantification limit is 81 ng/mL; in repetitive test, the RSD of enantiomer assaying of samples are no more than 2.0%; in stability test, the RSD are no more than 2.0% in 12 h; the vildagliptin intermediate and its enantiomer could be well separated in the test of durability with all RSDs below 2.0%. The method is simple, reliable, accurate and durable, and can be used for determination of enantiomer in vildagliptin intermediate.

chromatography; vildagliptin intermediates; HPLC; enantiomer; content determination

1008-1542(2017)03-0249-06

10.7535/hbkd.2017yx03006

2017-01-22；

2017-03-22；責(zé)任編輯：張士瑩

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2014ZX09507001)

栗偉娜 (1991—)，女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事藥物制劑方面的研究。

高子彬教授。E-mail：zbgao74@163.com

O175.8

A

栗偉娜,胡 佳，翟夢宇，等.手性色譜柱測定維格列汀中間體對映異構(gòu)體[J].河北科技大學(xué)學(xué)報(bào),2017,38(3):249-254. LI Weina，HU Jia，ZHAI Mengyu，et al.Determination of the vildagliptin intermediate enantiomer by chiralce-columns[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2017,38(3):249-254.