任向陽(yáng) , 吳文福 , 岑小清，游啟有 , 劉秋燕，賴(lài)月輝，黃秋雪

(1.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州511356 ； 2.廣州出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州510623)

豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免疫產(chǎn)生期和免疫持續(xù)期試驗(yàn)

任向陽(yáng)1，2, 吳文福1, 岑小清1，游啟有1, 劉秋燕1，賴(lài)月輝1，黃秋雪1

(1.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州511356 ； 2.廣州出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州510623)

將三批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)以單劑量分別接種仔豬進(jìn)行免疫產(chǎn)生期試驗(yàn)。在免疫同時(shí)以及免后1、2、3、4、5日連同對(duì)照組分別攻擊豬瘟強(qiáng)毒，攻毒后觀察16天，結(jié)果表明，豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免后4日即可產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫保護(hù)力。將三批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)以單劑量分別接種仔豬進(jìn)行免疫持續(xù)期試驗(yàn)。在免后3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月、15個(gè)月連同對(duì)照組分別攻擊豬瘟強(qiáng)毒，攻毒后觀察16天，結(jié)果表明，豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)的免疫持續(xù)期可長(zhǎng)達(dá)15個(gè)月。

豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源) ； 免疫產(chǎn)生期 ； 免疫持續(xù)期

豬瘟是一種急性、熱性和高度接觸傳染的病毒性傳染病。其特征為發(fā)病急、高熱稽留和細(xì)小血管變性，引發(fā)全身泛發(fā)型小點(diǎn)出血，脾梗死。急性豬瘟由強(qiáng)毒引起，發(fā)病率和死亡率較高；弱毒感染不表現(xiàn)臨床癥狀則可能不被覺(jué)察。不同品種、性別、年齡的豬均易感，豬瘟嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。免疫接種是預(yù)防和控制該病流行和發(fā)生的主要措施。豬瘟疫苗的質(zhì)量好壞，直接影響豬瘟的免疫效果。利用牛睪丸細(xì)胞和兔脾淋組織生產(chǎn)的豬瘟活疫苗病毒含量低，制造工藝落后，效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)低，在當(dāng)前疫病復(fù)雜等因素影響下很難達(dá)到理想的免疫效果。利用豬睪丸傳代細(xì)胞系生產(chǎn)的豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)在生產(chǎn)工藝、病毒含量、純凈性和質(zhì)量穩(wěn)定性等方面獲得重大突破[1-3]。本試驗(yàn)對(duì)豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)的免疫產(chǎn)生期和免疫持續(xù)期進(jìn)行研究，現(xiàn)將試驗(yàn)方法和結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料

1.1 試驗(yàn)用疫苗 豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)三批，分別記錄為：疫苗1、疫苗2、疫苗3。由廣東永順生物制藥股份有限公司生產(chǎn)，并按照《豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，所有檢驗(yàn)結(jié)果均合格。

1.2 試驗(yàn)用仔豬 來(lái)源于廣東永順生物制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)自繁自養(yǎng)的CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、PPV抗原陰性、未接種過(guò)CSF疫苗的二元雜交仔豬。經(jīng)豬瘟病毒中和試驗(yàn)方法[8]檢測(cè)，選擇豬瘟病毒中和抗體陰性的健康易感豬(25～30日齡)。

1.3 攻毒用強(qiáng)毒 豬瘟強(qiáng)毒石門(mén)系血毒，由廣東永順生物制藥股份有限公司制備、鑒定和保存。

1.4 豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒(阻斷ELISA) 購(gòu)自IDEXX公司。

2 方法

2.1 免疫產(chǎn)生期試驗(yàn)

2.1.1 仔豬的篩選與分組 經(jīng)豬瘟病毒中和試驗(yàn)方法篩選豬瘟病毒中和抗體陰性的25～30日齡仔豬，無(wú)論是否同窩，均需逐頭檢測(cè)。選取95頭豬瘟病毒中和抗體陰性仔豬。隨機(jī)分為19組，其中18組為免疫組，每組5頭共90頭；另外1組為對(duì)照組5頭。

2.1.2 免疫攻毒 將3批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)按標(biāo)簽注明頭份分別稀釋成1頭份/mL，耳后頸部肌肉注射，每頭注射1.0 mL。做好標(biāo)記，分開(kāi)飼養(yǎng)。免疫同時(shí)以及免后1、2、3、4、5日(即攻毒同時(shí)以及攻毒前1、2、3、4、5日免疫)連同5頭條件相同的非免疫對(duì)照仔豬分別攻擊豬瘟強(qiáng)毒，耳后頸部肌肉注射，每頭注射豬瘟強(qiáng)毒石門(mén)系血毒1.0 mL(105MLD/mL)。攻毒后每天觀察臨床癥狀，每天上、下午各測(cè)體溫1次，連續(xù)觀察16日，并統(tǒng)計(jì)分析攻毒結(jié)果。免疫產(chǎn)生期試驗(yàn)分組情況見(jiàn)表1。

表1 3批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免疫產(chǎn)生期試驗(yàn)分組

2.1.3 豬瘟病毒抗體水平的監(jiān)測(cè) 將各試驗(yàn)組分別于免疫前和攻毒前抽取血樣，分離血清，以阻斷ELISA方法測(cè)定其豬瘟病毒抗體水平，分析試驗(yàn)組在不同時(shí)期免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)中的抗體水平。豬瘟病毒抗體檢測(cè)操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)按照IDEXX-ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.2 免疫持續(xù)期試驗(yàn)

2.2.1 仔豬的篩選與分組 經(jīng)豬瘟病毒中和試驗(yàn)方法篩選豬瘟病毒中和抗體陰性的25～30日齡仔豬，無(wú)論是否同窩，均需逐頭檢測(cè)。選取100頭豬瘟病毒中和抗體陰性仔豬。隨機(jī)分為20組，其中15組為免疫組，每組5頭共75頭；另外5組為對(duì)照組，每組5頭共25頭。

2.2.2 免疫攻毒 將3批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)按標(biāo)簽注明頭份分別稀釋成1頭份/mL，每批疫苗分別注射25頭仔豬，耳后頸部肌肉注射，每頭注射1.0 mL。做好標(biāo)記，分開(kāi)飼養(yǎng)。免疫后3、6、9、12、15個(gè)月于每批疫苗的免疫組中隨機(jī)抽取5頭，連同5頭條件相同的非免疫對(duì)照仔豬分別攻擊豬瘟強(qiáng)毒，耳后頸部肌肉注射，每頭注射豬瘟強(qiáng)毒石門(mén)系血毒1.0ml(105MLD/mL)。攻毒后每天觀察臨床癥狀，每天上、下午各測(cè)體溫1次，連續(xù)觀察16天，并統(tǒng)計(jì)分析攻毒結(jié)果。免疫持續(xù)期試驗(yàn)分組情況見(jiàn)表2。

表2 3批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免疫持續(xù)期試驗(yàn)分組

2.2.3 豬瘟病毒抗體水平的監(jiān)測(cè) 分別在免前和免后3、6、9、12、15個(gè)月進(jìn)行豬瘟病毒抗體檢測(cè)。抽取血樣，分離血清，以阻斷ELISA方法測(cè)定其豬瘟病毒抗體水平，分析試驗(yàn)組在不同時(shí)期的抗體水平。豬瘟病毒抗體檢測(cè)操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)按照IDEXX-ELISA試劑盒使用書(shū)進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1 免疫產(chǎn)生期試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果 將三批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)以單劑量免疫仔豬進(jìn)行免疫產(chǎn)生期試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，3批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免疫同時(shí)以及免后1日、2日攻擊豬瘟強(qiáng)毒的仔豬均出現(xiàn)典型的豬瘟臨床癥狀；免后3日對(duì)仔豬的保護(hù)率為60%～80% (3/5～4/5)，免后4日、5日攻擊豬瘟強(qiáng)毒的仔豬既無(wú)體溫升高，也無(wú)豬瘟臨床癥狀，全部健活。對(duì)照豬全部發(fā)病，均呈典型的豬瘟臨床癥狀，在觀察16日內(nèi)有3頭死亡，剖檢可見(jiàn)豬瘟特征性病變。

3.1.2 豬瘟病毒抗體水平的監(jiān)測(cè)結(jié)果 各試驗(yàn)組和對(duì)照組分別于免前和攻毒前均抽取血樣，分離血清，以阻斷ELISA方法測(cè)定其豬瘟病毒抗體水平，試驗(yàn)結(jié)果顯示，各組的樣品阻斷率均不大于30%，判斷為陰性(無(wú)豬瘟病毒抗體存在)。

表3 3批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免疫產(chǎn)生期試驗(yàn)結(jié)果

3.2 免疫持續(xù)期試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果 將3批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)以單劑量免疫仔豬進(jìn)行免疫持續(xù)期試驗(yàn)，豬只接種后觀察14日，接種部位均無(wú)腫塊出現(xiàn)，未見(jiàn)任何不良反應(yīng)。免疫持續(xù)期試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，3批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免后3、6、9、12、15個(gè)月分別攻擊豬瘟強(qiáng)毒對(duì)豬的保護(hù)率均為100%(5/5)。對(duì)照豬全部發(fā)病，均呈典型的豬瘟臨床癥狀，且每組對(duì)照組均有3頭以上死亡，剖檢可見(jiàn)豬瘟特征性病變。

表4 3批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免疫持續(xù)期試驗(yàn)結(jié)果

3.2.2 豬瘟病毒抗體水平的監(jiān)測(cè)結(jié)果 分別在免前和免后3、6、9、12、15個(gè)月進(jìn)行豬瘟病毒抗體檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，三批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)以單劑量免疫仔豬，至免疫后15個(gè)月，仍維持在理想的水平。

血清抗體變化圖

圖1 3批豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免后不同時(shí)期的豬瘟抗體水平(抗體平均值)

4 結(jié)論

4.1 豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免疫接種屬于人工主動(dòng)免疫。疫苗免疫之后動(dòng)物機(jī)體需要一定的時(shí)間來(lái)進(jìn)行抗原的識(shí)別和遞呈，動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)受到抗原刺激后則產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答從而保護(hù)動(dòng)物免受疫病干擾。從疫苗免疫到獲得堅(jiān)強(qiáng)保護(hù)力的時(shí)間為非免疫保護(hù)期，即為免疫空白期，免疫空白期在任何動(dòng)物上都不可避免，但免疫空白期越短動(dòng)物越安全，反之越危險(xiǎn)[4]。從豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)的免疫產(chǎn)生期試驗(yàn)結(jié)果可知，豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免疫4日后即可產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫保護(hù)力，證明豬瘟兔化弱毒株是非常優(yōu)秀的疫苗株，盡管如此免疫后2日內(nèi)依然無(wú)法抵抗豬瘟野毒的感染導(dǎo)致發(fā)病或死亡，免疫后3日只能提供部分保護(hù)，說(shuō)明豬瘟活疫苗免后存在2～3日的免疫空白期，在此期間要特別注意豬群免受豬瘟野毒感染；免前至免后5日各試驗(yàn)組和對(duì)照組的豬瘟病毒抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果均為陰性，但免后4日和免后5日免疫豬對(duì)豬瘟強(qiáng)毒已經(jīng)產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)力，說(shuō)明體液免疫相對(duì)細(xì)胞免疫出現(xiàn)較晚，在免疫初期細(xì)胞免疫發(fā)揮了重要作用。

4.2 從豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)的免疫持續(xù)期試驗(yàn)結(jié)果可知，至免疫后15個(gè)月，豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)的免疫保護(hù)率仍為100%(5/5)。根據(jù)豬瘟病毒抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果可知，豬瘟體液免疫應(yīng)答相對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答出現(xiàn)較晚，但豬瘟體液免疫應(yīng)答出現(xiàn)后則維持時(shí)間較長(zhǎng)，免疫后15個(gè)月豬瘟病毒抗體仍維持在理想水平。從豬瘟強(qiáng)毒攻擊后的免疫保護(hù)率和豬瘟病毒抗體的變化規(guī)律兩方面綜合判斷，免后15個(gè)月，豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)對(duì)豬仍可提供堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)力，免疫效果確切。

4.3 在實(shí)驗(yàn)室條件下，斷奶后無(wú)母源抗體的仔豬，注射豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)1頭份可為豬提供15個(gè)月的免疫保護(hù)。但在豬場(chǎng)實(shí)際使用中會(huì)遇到如豬瘟母源抗體干擾、其他病原混合感染等諸多問(wèn)題[5]。因此，在生產(chǎn)實(shí)際中可進(jìn)行兩次免疫，仔豬可于出生后25～35日齡和60日齡左右各注射1次，1頭份/頭，確保豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)的免疫效果。

[1] 吳文福，岑小清，任向陽(yáng)，等.豬瘟兔化弱毒疫苗的研制概況[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2009，34(6)：6-8.

[2] 張毓金，林旭埜，吳文福，等.豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免疫豬的攻毒保護(hù)試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2014，50(3)：28-30.

[3] 孫彥偉，查云峰，田云，等.三個(gè)廠家豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免疫效果比較試驗(yàn)[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2012，37(2)：29-32.

[4] 南文金，黃健強(qiáng)，黃鴻惠，等.某規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟抗體水平的檢測(cè)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37(3)：120-123.

[5] 原霖，顧曉雪，張碩，等.規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟免疫失敗調(diào)查及免疫程序優(yōu)化[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2013，49(7)：27-29.

The Onset Time and Maintenance Phase of Immunity Protection for Classical Swine Fever Live Vaccine(Cell Line Origin)

REN Xiang-yang1，2，WU Wen-fu1，CEN Xiao-qing1，YOU Qi-you1，LIU Qiu-yan1，LAI Yue-hui1，HUANG Qiu-xue1

(1.Guangdong Win-sun Pharmaceytical Stock Limited Company,Guangzhou 511356, China；2.Guangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510623, China)

To evaluate the onset time of immunie protection for Classical Swine Fever Live Vaccine (Cell Line Origin),the piglets together with the control group were injected with strong CSFV 0，1，2，3，4 and 5 days post the inoculation of each batch of the total 3 batches of Vaccine for a single dose. It was observed for 16days after injection with strong CSFV. The results showed that day 4 was the onset time of immunie protection for Classical Swine Fever Live Vaccine (Cell Line Origin).To evaluate the maintenance phase of immune protection for Classical Swine Fever LiveVaccine (Cell Line Origin), the piglets together with the control group were injected with strong CSFV on Months 3，6，9，12 and 15 post the inoculation of each batch of the total 3 batchesof Vaccine for a single dose. It was observed for 16 days after the injection with strong CSFV. The results showed the maintenance phase of immunity protection for Classical Swine Fever Live Vaccine lasted at least 15months(Cell Line Origin).

Classical Swine Fever Live Vaccine (Cell Line Origin)； The Onset Time of Immunity Protection； The Maintenance Phase of Immunity Protection

WU Wen-fu

2016-11-16

任向陽(yáng)(1981-)，男，獸醫(yī)師，碩士，從事獸用生物制品研發(fā)與管理工作，E-mail: 1046253137@qq.com

吳文福，E-mail: wuwf18@163.com

S858.23

A

0529-6005(2017)04-0092-03