超聲提取柑橘皮中總黃酮的研究

張冬冬，徐 迪，洪 偉

（蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽蕪湖241003）

超聲提取柑橘皮中總黃酮的研究

張冬冬，徐 迪，洪 偉

（蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽蕪湖241003）

選用超聲法提取柑橘皮中的總黃酮，將單因素試驗(yàn)分析與正交試驗(yàn)相結(jié)合，得到超聲法提取柑橘皮中黃酮類化合物的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶25，提取液pH值8，提取時間60 min，提取次數(shù)3次，在此條件下總黃酮提取率為2.68%。

柑橘皮；總黃酮；超聲提取；影響因素

黃酮類化合物是重要的一類含氧雜環(huán)天然有機(jī)化合物，廣泛存在于一些植物和漿果中，在柑橘皮中已經(jīng)鑒定出60多種黃酮類化合物[1]，它們具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌等多種生理活性，在食品和醫(yī)藥行業(yè)有著廣泛應(yīng)用。柑橘類水果包括橘、柑、橙、柚、枳、椽等，是世界上產(chǎn)量最大的水果，但目前柑橘類果皮絕大部分作為廢料丟棄，造成極大的資源浪費(fèi)。試驗(yàn)嘗試使用超聲法從柑橘皮中提取黃酮類物質(zhì)，為柑橘類果皮的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

市售新鮮柑橘，清洗除雜后剝皮切片，在65℃條件下干燥至恒質(zhì)量，粉碎后過40目篩備用。

1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海伊卡生物技術(shù)有限公司提供；石油醚（60～90℃）、無水乙醇，以及NaOH，Al（NO3）3，NaNO2，均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

臺式超聲波清洗器、紫外可見分光光度計、分析天平、高速萬能粉碎機(jī)、臺式高速離心機(jī)、恒溫干燥箱等。

1.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取19.97 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶解，稀釋至刻度，精確量取25 mL置于50 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇稀釋至刻度，即得0.099 85 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 mL分別置于25 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇補(bǔ)足至12.5 mL，加5%NaNO2溶液0.75 mL，搖勻后靜置5 min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.75 mL，搖勻后靜置5 min，最后加入1.013 mol/L NaOH溶液10 mL，定容至刻度，于波長510 nm處測其吸光度[2]，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、吸光度A為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=11.22X+ 0.000 8，R2=0.999 9。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

1.5 柑橘皮總黃酮的提取測定

準(zhǔn)確稱取1.00 g的干燥橘皮粉，用超聲輔助石油醚脫脂脫色2 h，用蒸餾水沖洗橘皮粉至黃色消失，干燥后備用，選用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為提取劑，按照不同的料液比、超聲功率、提取液pH值、提取時間、提取次數(shù)，提取后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，取樣品上清液1 mL，將體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇稀釋至50 mL，再取1 mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定吸光度。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出顯色液中總黃酮質(zhì)量濃度，再按下式計算提取率：

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 柑橘皮中總黃酮提取的影響因素

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取多份1.00 g的干燥橘皮粉，選取料液比1∶25，提取液pH值8，超聲功率300 W，提取時間1 h，分別溶于乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，60%，70%，80%，90%的提取液中，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對柑橘皮中總黃酮提取率的影響。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時，提取率不斷升高；而乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%～90%時，提取率逐漸降低。由于總黃酮包括黃酮苷和苷元，黃酮苷在水和乙醇中都易溶解，但苷元的水溶性較差，而70%乙醇對黃酮苷和苷元都有較好的溶解性[3]。

2.1.2 料液比對總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取多份1.00 g的干燥橘皮粉，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取液pH值8，超聲功率300 W，提取時間1 h，料液比1∶15，1∶25，1∶35，1∶40，研究料液比對柑橘皮中總黃酮提取率的影響。

料液比對總黃酮提取率的影響見圖3。

由圖3可知，料液比為1∶15～1∶40時，總黃酮的提取率逐漸增加，到1∶40時達(dá)到最大；但據(jù)資料研究表明，料液比由1∶25～1∶40時，總黃酮的提取率增加緩慢[4]。料液比大，有利于溶解、擴(kuò)散，但回收濃縮成本高。綜合考慮，提取柑橘皮中黃酮類物質(zhì)以料液比1∶25較為適宜。

2.1.3 提取液pH值對總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取多份1.00 g的干燥橘皮粉，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶25，超聲功率300 W，提取時間1 h，分別調(diào)節(jié)提取液pH值為5，6，7，8，9，研究提取液pH值對柑橘皮中總黃酮提取率的影響。

提取液pH值對總黃酮提取率的影響見圖4。

由圖4可知，提取液pH值為5～8時，總黃酮提取率提高，由于黃酮pH值為8～9時，其酚羥基易離子化，水溶性增強(qiáng)，有利于乙醇提取柑橘皮中的總黃酮。

2.1.4 提取時間對總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取多份1.00 g的干燥橘皮粉，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶25，超聲功率300 W，提取液pH值8，分別設(shè)定提取時間為45，60，75，90 min，研究提取時間對總黃酮提取率的影響。

提取時間對總黃酮提取率的影響見圖5。

圖3 料液比對總黃酮提取率的影響

圖4 提取液pH值對總黃酮提取率的影響

圖5 提取時間對總黃酮提取率的影響

由圖5可知，提取時間為30～60 min時，總黃酮提取率增幅較大；當(dāng)提取時間超過60 min，提取率基本不再變化，總黃酮已提取充分，溶質(zhì)在溶液中達(dá)到了溶解平衡，所以提取時間60 min較為適宜。

2.1.5 提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取多份1.00 g的干燥橘皮粉，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶25，超聲功率300 W，提取時間60 min，提取液pH值8，提取次數(shù)分別為1，2，3，4，5次，研究提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響。

提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響見圖6。

圖6 提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響

由圖6可知，提取次數(shù)為1～4次時，總黃酮提取率逐漸增加，再繼續(xù)提取會浪費(fèi)溶劑和消耗動力。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，考慮到避免了高體積分?jǐn)?shù)乙醇提取出脂溶性成分而影響黃酮類物質(zhì)的提取，對乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇確定在70%，而料液比（A）、提取時間（B）、提取液pH值（C）和提取次數(shù)（D）4個因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)[5]。

超聲提取正交試驗(yàn)與極差分析見表1。

表1 超聲提取正交試驗(yàn)與極差分析

由表1可知，對總黃酮提取率影響因素的大小順序?yàn)锳＞B＞D＞C，即料液比＞提取時間＞提取次數(shù)＞提取液pH值；最佳的試驗(yàn)工藝條件為A2B2C2D1，即料液比1∶25，提取液pH值8，提取時間60 min，提取次數(shù)3次。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)確定的最佳工藝條件下，使用乙醇體積分?jǐn)?shù)70%作為提取液，料液比1∶25，提取液pH值8，提取時間60 min，提取次數(shù)3次，將3次測定總黃酮的提取率求平均值，得到最優(yōu)提取工藝條件下總黃酮的提取率為2.68%。

3 結(jié)論與討論

柑橘中總黃酮提取方法研究較多的有溶劑浸提法、微波提取法、酶法提取、超聲波輔助提取法、超臨界萃取法等[6]，試驗(yàn)采用超聲波輔助提取，因其簡便、快速和安全等優(yōu)點(diǎn)，在植物的有效成分提取中得到了廣泛應(yīng)用。通過超聲提取法對柑橘皮中的黃酮類化合物進(jìn)行提取，設(shè)計單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，考查了超聲提取的5個因素對柑橘皮中黃酮類化合物提取效果的影響，最后確定了柑橘皮中總黃酮超聲提取的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶25，提取次數(shù)3次，提取液pH值8，提取時間60min，該工藝條件下總黃酮提取率達(dá)2.68%。

試驗(yàn)所得的總黃酮提取率較有關(guān)文獻(xiàn)報道偏低，這可能是由于：①原料經(jīng)過石油醚脫脂后再提取總黃酮，降低了總黃酮的提取率，增加此步驟的目的是柑橘皮中所含的脂溶性色素和芳香油，如采用溶劑直接提取后濃縮，脂溶性雜質(zhì)混入會造成顯色法測定總黃酮產(chǎn)生較大檢測誤差；②因?qū)嶒?yàn)室未配備可調(diào)功率、溫度的超聲處理器，無法考查提取溫度和超聲功率2個因素對總黃酮提取率的影響。在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)考慮降低提取次數(shù)以減少時間和試劑成本，并剔除石油醚脫脂步驟來增加總黃酮提取率。

[1]Benavente Garcia O，Castillo J，Marin F R，et al.Uses and properties of citrus flavonoids[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45（12）：4 505-4 515.

[2]蔣雪蕾，劉軍海，李安源.超聲輔助正交試驗(yàn)優(yōu)化提取桔皮總黃酮的工藝研究[J].廣東化工，2013，40（5）：53-54.

[3]曾暉.鮮橘皮、陳皮、青皮中黃酮化合物的提取[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，15（6）：94-97.

[4]陳鳳清，張紫瑤，鄭長新，等.丑橘皮總黃酮的提取工藝及抑菌活性研究[J].中國農(nóng)機(jī)化學(xué)報，2017，38（1）：69-73.

[5]薛長暉.微波提取橘皮總黃酮的工藝[J].糧油加工，2010（7）：142-145

[6]秦艷，馮衛(wèi)華，白衛(wèi)東，等.柑橘類黃酮化合物的提取及定量分析方法研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012，33（11）：404-406，413.◇

Study on Extraction of Total Flavonoids from Orange Peel

ZHANG Dongdong，XU Di，HONG Wei
（Department of Biology Engineering，Wuhu Institute of Technology，Wuhu，Anhui 241003，China）

Selection of ultrasonic method for extracting total flavonoids from orange peel，the extraction technologies of ultrasonic-assisted of total flavonoids from orange peel through are optimized through orthogonal test based on single factor.The result shows that the optimum conditions are as flows：ethanol concentration 70%，1∶25 of the radio of material and solvent，pH values 8，extractiing time 60 min，extraction time 3，under the conditions of total flavonoids extraction rate of 2.68%.

orange peel；flavonoids；ultrasonic extraction；impact factors

TQ461

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.028

1671-9646（2017）05b-0001-03

2017-04-26

安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2016A765）；安徽省高校優(yōu)秀拔尖人才培育資助項(xiàng)目（GXFX2017245）；安徽省省級質(zhì)量工程資助項(xiàng)目（2016MOOC328）。

張冬冬（1983—），男，碩士，講師，研究方向?yàn)樯瘷z測。