擬南芥銨轉運蛋白AtAMT1.3的電生理功能

郝東利++楊順瑛++黃亞楠++蘇彥華

摘要：在生理條件下，植物銨的吸收主要由定位于細胞膜上的銨轉運蛋白（ammonium transporter，AMT）介導完成，研究模式植物擬南芥AMT的功能特性及調控機制對于解析植物的銨吸收過程具有重要意義。本研究克隆了擬南芥AtAMT1.3并將其在蛙卵異源系統中表達，電生理結果表明，AtAMT1.3 是一個典型的對銨有高度選擇性、高親和的銨吸收系統[Km =（25.5 ± 3.2） μmmol/L]。同時，AtAMT1.3也能介導銨的同系物甲基銨的吸收[Km =（3.3±0.2） mmmol/L]，對銨和甲基銨的吸收具有濃度依賴性和電壓依賴性。 AtAMT1.3的銨轉運能力不受pH值調控，它的轉運底物是NH4+，運輸機制是NH4+單向運輸。

關鍵詞：擬南芥；銨轉運蛋白AtAMT1.3；介導；電生理；功能特征；銨吸收系統；運輸機制

中圖分類號： S184；Q946.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0036-05

銨態(tài)氮是植物能夠直接吸收的重要無機氮素形態(tài)。模式植物擬南芥是一種喜銨植物，在相同濃度供應下，銨態(tài)氮的吸收速率高達硝態(tài)氮的20倍[1]，植物對銨的吸收主要是由銨轉運蛋白（AMT）介導的[2-4]。擬南芥基因組中一共有6個AMT，即AtAMT1.1、AtAMT1.2、AtAMT1.3、AtAMT1.4、AtAMT1.5、AtAMT2[5]。除了AtAMT1.4 專一地在花粉和花粉管中表達外[6]，其他5個AMT在根部均有表達[5，7]。擬南芥突變體試驗證明，3個AtAMT1（AtAMT1.1、AtAMT1.2、AtAMT1.3）貢獻了約90%的銨吸收，其中AtAMT1.1和AtAMT1.3各貢獻了約30%[3，5]，AtAMT1.2貢獻率略小（18%～26%）[5]。AtAMTS 通過時空定位以及對銨親和力的差異來滿足擬南芥生長合適的氮素需要[5]。簡單來說，AtAMT1.1、AtAMT1.3 和AtAMT1.5主要定位于表皮細胞，其對銨的親和力很強，三者負責將銨從土壤溶液中吸收到根內并通過共質體途徑運輸；而AtAMT1.2主要定位于內皮層，且對銨的親和力相對較低，通過質外體途徑運輸的銨受阻于凱氏帶，此時AtAMT1.2將其運進細胞，進入共質體途徑，最終完成同化或木質部的輸送。由于植物體的復雜，將單個銨轉運蛋白在異源系統中表達更有利于研究其轉運、調控機制。酵母和蛙卵是2種常用的表達系統，酵母銨吸收缺失突變體31019b 不能在 <5 mmol/L NH4+作為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長[8-9]，轉入任意一個AtAMT1 均能使其恢復生長，再次證實了它們直接吸銨的功能[5-6，10-11]。蛙卵系統除了能夠驗證其吸銨功能外，還有一個重要的作用就是可以用來解析其轉運機理。雖然植物AMT1之間同源性很高，但是其轉運機理卻大不相同[12]，目前對于AtAMT1.3的蛙卵電生理功能特征研究尚缺少。本試驗克隆了AtAMT1.3并將其在蛙卵系統中進行表達，通過電生理技術研究其離子選擇性，對銨及其同系物甲基銨的親和性、pH值響應，初步闡明了AtAMT1.3的運輸機制及功能特征。

1材料與方法

1.1材料

擬南芥（Arabidopsis）、大腸桿菌 DH5α和蛙卵表達載體 pCI 由筆者所在實驗室保存，非洲爪蟾由筆者所在實驗室飼養(yǎng)；PCR擴增高保真酶PrimeSTAR購自TaKaRa 公司；T4連接酶、限制性內切酶 EcoRⅠ和XbaⅠ購自 NEB公司；引物由上海英駿生物技術有限公司合成；膠原酶A 購自 Roche 公司；電生理用試劑購自Ameresco 公司；雙電極電壓鉗設備購自Axon公司。放大器型號為pClamp 900A，數模轉換型號為Digidata 1440，質粒注射儀器型號為 Nanoliter 2000。

1.2AtAMT1.3開放閱讀框的擴增及表達載體的構建

取凍存的擬南芥樣品約100 mg，液氮研磨，根據說明書提取RNA。利用反轉錄試劑合成cDNA第1鏈，AtAMT1.3序列登錄號為At3g24300.1。以cDNA為模板，進行PCR擴增。引物序列：P1，5′-GTCGAATTCATGTCAGGAGCAATAACATGC-3′；P2，5′-GTCTCTAGATTAAACGCGAGGAGGAGTAGC-3′。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1.67 min，24個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。割膠回收，將產物“3′-”端加A尾后連到 PMD19-T vector，轉入大腸桿菌DH5α，陽性克隆送往華大基因科技有限公司測序。用限制性內切酶EcoRⅠ和XbaⅠ將測序正確地克隆切下來，通過T4連接酶連入蛙卵表達載體pCI。

1.3注射蛙卵及電生理檢測

首先，將蛙卵從非洲爪蟾中取出，用 1 mg/mL 膠原酶A 消解1.5～2.0 h，然后挑選健康的單個蛙卵保存于ND96溶液中，其中ND96溶液成分包括96 mmol/L NaCl、2 mmol/L KCl、1.8 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L HEPES（用NaOH調pH值至7.4）。將59.8 nL的質粒pCI-OsAMT1.3注射進入健康的蛙卵，同等體積的無菌水注射進入蛙卵，作為對照。將蛙卵置于ND96溶液（2.5 mmol/L丙酮酸鈉）中，19 ℃ 培養(yǎng)3 d，檢測。蛙卵鉗置于-70 mV中，利用連續(xù)ramp記錄。膜電位施加程序的電壓為-140～20 mV，與之前的報道一樣，注射水的蛙卵對1 mmol/L NH4+ 或 10 mmol/L MeA+ 不敏感[12]。電生理用基本溶液成分包括100 mmol/L NaCl、2 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgCl2、4 mmol/L Tris （用MES調pH值至7.4），NH4Cl或者MeACl 根據圖表的指示添加。在做離子選擇性試驗時，基本溶液中的 NaCl 換成相同濃度的CholineCl。

2結果與分析

2.1AtAMT1.3-pCI載體的構建

以擬南芥cDNA為模板，以 P1、P2為引物進行PCR擴增，獲得長度為1 497 bp 目的片段（圖1），割膠回收，連入 PMD19-T vector 載體，經轉化、篩選、測序得到正確的AtAMT1.3-PMD19-T，用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切 AtAMT1.3-PMD19-T和 pCI，割膠回收AtAMT1.3片段和pCI大片段，通過T4 連接酶連接目的片段和大載體片段，轉化后篩選獲得陽性質粒AtAMT1.3-pCI，酶切驗證正確后濃度濃縮至>1 μg/μL，備用 （圖2），AtAMT1.3-pCI 質粒構成見圖3。

2.2AtAMT1.3 的氨基酸序列分析

氨基酸序列分析表明，AtAMT1.3 在進化上與AtAMT1.5親緣關系最近，AtAMT1.1次之 （圖4）。它們都屬于 AMT-1亞家族，其中AtAMT1.3 與 AtAMT1.2之間的親緣關系在該亞家族內部最遠（圖4）?；?AtAMT1.1 和 AtAMT1.2 已較

為明了的功能特征[11，13-15]進行預測，結果顯示，AtAMT1.3在功能特征方面的表現與 AtAMT1.1相近，而與 AtAMT1.2 差異較大。

2.3AtAMT1.3的離子選擇性

在-70 mV 下添加 1 mmol/L堿性陽離子Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+入電生理基本溶液，對AtAMT1.3介導的電流沒有明顯影響，而用 1 mmol/L NH4+ 灌流能產生大幅內向的電流（圖5-a），說明 AtAMT1.3是一個高度選擇性的銨吸收系統。這種高度銨的選擇性在整個電壓區(qū)間內（-140 ～20 mV）皆是如此（圖5-b），說明 AtAMT1.3 對銨吸收的高度選擇性是不依賴于膜電位的。

2.4AtAMT1.3的銨濃度響應

在-70 mV 下，AtAMT1.3 介導的內向銨電流隨著銨濃度的增加而增加，在<400 μmol/L 的銨濃度下，電流急劇增大；而在1 000 μmol/L 下，接近飽和，說明AtAMT1.3介導的銨吸收具有濃度依賴性（圖6-a）；AtAMT1.3介導的內向銨電流睡著膜電位的增加而增加，說明AtAMT1.3的銨吸收具

有電壓依賴性（圖6-b）。通過米氏方程擬合得到AtAMT1.3 介導的銨吸收在 1 mmol/L左右達到飽和（圖6-c）。在 -140 mV 下，Km值（達到1/2最大吸收速率時的銨濃度）為（18.1±2.8） μmol/L；在-130 mV下，Km值為（21.4±3.01） μmol/L；在-120 mV下，Km值為（25.5±3.2） μmol/L；在-110 mV下，Km值為（28.2±3.5） μmol/L；在-100 mV下，Km值為（35.0±3.5） μmol/L；在-90 mV下，Km值為（44.6±4.0） μmol/L；在-80 mV下，Km值為（57.8±5.2） μmol/L，由此可見Km值具有電壓依賴性，即膜電位越正，Km值越大，說明銨是以離子的形態(tài)進入細胞膜的（圖6-d）。假設在膜內有1個NH4+的結合位點，則這個位點應位于整個膜電場52%的位置。

2.5AtAMT1.3的甲基銨濃度響應

甲基銨是銨的同系物，廣泛應用于AMT的功能研究。在-70 mV 下，AtAMT1.3 介導的內向甲基銨電流也具有濃度依賴性，即隨著甲基銨濃度的增加而增加，在銨濃度<7.5 mmol/L 下，電流急劇增大；而在胺濃度為10 mmol/L 下，電流接近飽和（圖7-a）。AtAMT1.3介導的內向甲基銨具有電壓依賴性，即膜電位越負，電流越大（圖7-b）。通過米氏方程擬合得到甲基銨親和力常數Km值在毫摩爾級：在 -140 mV 下，Km =（2.5±0.1） mmol/L；在-130 mV下，Km =（2.9±0.1） mmol/L；在-120 mV下，Km=（3.3±0.2） mmol/L；在-110 mV下，Km=（3.8±0.2） mmol/L；在-100 mV下，Km=（4.4±0.2） mmol/L；在-90 mV下，Km=（5.1±0.3） mmol/L；在-80 mV下，Km=（5.7±0.4） mmol/L。Km值具有電壓依賴性，即膜電位越正，Km值越大（圖7-c），說明甲基銨是以離子的形態(tài)進入細胞膜的。假設在膜內有1個MeA+的結合位點的話，則這個位點應位于整個膜電場34%的位置。

2.6AtAMT1.3的pH值響應

在-70 mV 下，AtAMT1.3介導的銨電流不受外界pH值調控，即酸性條件和接近中性的pH值對銨電流基本沒有影響（圖8-a）。在不同膜電位下，AtAMT1.3介導的銨電流皆不受pH值調控（圖8-b、圖8-c）。

3結論與討論

在同一氮素水平供應下，擬南芥對銨的吸收速率是硝的20倍[1]，說明銨態(tài)氮對其生長極其重要，植物的銨吸收是由AMT介導完成的[2-4]。AtAMT1.3雖然貢獻于根部的銨吸收，但是其功能特征如對銨吸收專一與否、對膜電位的響應、不同電壓下的親和力、運輸機理等還不清楚。本研究結果表明，AtAMT1.3 是一個典型的高度選擇性的、高親和銨吸收系統 （圖5、圖6），其 Km 值為25 μmol/L，與AtAMT1.1 的Km 值很接近[13]，但與AtAMT1.2差距很大[11]。AtAMT1.3與AtAMT1.1親緣性近，而與AtAMT1.2遠（圖4），再根據結構決定功能的原理可知，這種Km 值的差異反映了AtAMT1.3與AtAMT1.1的相似性。 AtAMT1.3不僅能通透NH4+，也能通透NH4+的同系物MeA+，但其對MeA+的通透性要低，親和力降低了約100倍（圖7），這與大多數報道的AMT-1亞家族的銨轉運類似[11，16-17]。AMT既能通透NH4+、又能通透MeA+的種特性有利于對AMT功能特征的研究，如在酵母表達系統中，通過14C標記的MeA來研究AMT的吸收以及親和特征[18-19]。

盡管AMTs在結構上同源性很高，但其轉運底物和轉運機理卻大不相同[12]，甚至對相同的AMT提出不同的轉運機制。Khademi等通過解析大腸桿菌EcAmtB晶體結構提出該蛋白結合的是NH4+，但是最終運輸的是NH3[20]。因為記錄得到了離子態(tài)的NH4+內流，這個NH3運輸的觀點受到挑戰(zhàn)[21]。對于植物AMT，研究者們根據一系列的試驗證據提出了4種運輸機制：如番茄LeAMT1.1、水稻OsAMT1.1的運輸機制是NH4+單向運輸[16-17]；擬南芥AtAMT1.2、小麥TaAMT1.1的運輸機制是NH3/H+共運[22-23]；菜用大豆的PvAMT1.1運輸機制是 NH4+/H+同向運輸[24]；擬南芥AtAMT2的運輸機制是NH3運輸[25]。本研究解析出AtAMT1.3的運輸機制是NH4+單向運輸，原因如下：（1）酵母功能互補證明了AtAMT1.3 具有吸銨功能[5]，電生理記錄得到了NH4+產生的電流（圖3），說明進入蛙卵的銨形態(tài)是離子態(tài)的（因分子進入不會產生電流），排除了NH3運輸的機制。（2）AtAMT1.3介導的銨內流不受pH值調控（圖8），排除了NH4+/H+同向運輸和NH3/H+共運2種可能，因為如果是這2種機制的話，外界pH值改變（pH 值由5.4 轉變到 74）使得溶液中H+的濃度減小100倍，即其中的一個底物量急劇減少，勢必會對其運輸產生巨大的影響。事實上，AtAMT1.3介導的銨內流不受外界pH影響（圖8），那么AtAMT1.3的銨運輸機理只可能是NH4+單向運輸。（3）吸收動力學擬合得到AtAMT1.3的希爾吸收等于1，說明只有1種底物（圖6）。通過擬合Km值對電壓的依賴性，得到這個底物的結合位點位于整個膜電場52%的位置；進一步說明AtAMT1.3的運輸機制是 NH4+單向運輸。AtAMT1.3運輸機制與AtAMT1.1相同，而與AtAMT1.2不同；在同源性上前兩者之間也比AtAMT1.3與AtAMT1.2之間近 （圖4）。由此推測，決定AtAMT1.3與AtAMT1.2 運輸機制不同的很可能是與AtAMT1.1相同、而與AtAMT1.2差異較大的氨基酸區(qū)域，這個猜想需要進一步的試驗證實。

擬南芥中AtAMT1.3缺失突變體引起的側根分化差異表型，只能由AtAMT1.3 補回，而不能由AtAMT1.1補回[26]。AtAMT1.3在基本功能特征上與AtAMT1.1很相似，如對銨的高度選擇性和很高的親和力，NH4+作為轉運底物，不受pH值調控 （圖5至圖7）。功能如此相似，表型卻不能被相似的AtAMT1.1恢復，進一步說明AtAMT1.3 在植物體內除了養(yǎng)分吸收外還扮演其他的角色，如影響側根分化。

總體來說，本試驗通過研究擬南芥的AtAMT1.3電生理功能特征，證明該蛋白是典型的高度選擇性的高親和銨吸收系統，其對銨的親和力在微摩爾級，而對甲基銨的親和力至少低了10倍。AtAMT1.3介導的銨內流不受外界pH值調控，其運輸機制是NH4+單向運輸。

參考文獻：

[1]Gazzarrini S，Lejay L，Gojon A，et al. Three functional transporters for constitutive，diurnally regulated，and starvation-induced uptake of ammonium into arabidopsis roots[J]. The Plant Cell，1999，11（5）：937-947.

[2] von Wirén N，Merrick M. Regulation and function of ammonium carriers in bacteria，fungi，and plants[J]. Top Current Genetics，2004，9：1-26.

[3]Loque D，Yuan L X，Kojima S，et al. Additive contribution of AMT1.1 and AMT1.3 to high-affinity ammonium uptake across the plasma membrane of nitrogen-deficient Arabidopsis roots[J]. Plant Journal，2006，48（4）：522-534.

[4]Ludewlg U，Neuhduser B，Dynowski M. Molecular mechanisms of ammonium transport and accumulation in plants[J]. FEBS Letters，2007，581（12）：2301-2308.

[5]Yuan L X，Loque D，Kojima S，et al. The organization of high-affinity ammonium uptake in Arabidopsis roots depends on the spatial arrangement and biochemical properties of AMT1-type transporters[J]. The Plant Cell，2007，19（8）：2636-2652.

[6]Yuan L X，Graff L，Loque D，et al. AtAMT1.4，a pollen-specific high-affinity ammonium transporter of the plasma membrane in Arabidopsis[J]. Plant and Cell Physiology，2009，50（1）：13-25.

[7]Birnbaum K，Shasha D E，Wang J Y，et al. A gene expression map of the Arabidopsis root[J]. Science，2003，302（5652）：1956-1960.

[8] Marini A M，Soussi-Boudekou S，Vissers S，et al. A family of ammonium transporters in saccharomyces cerevisiae[J]. Molecular and Cellular Biology，1997，17（8）：4282-4293.

[9]楊順瑛，叢郁，郝東利，等. 利用異源酵母功能互補法研究水稻銨轉運體OsAMT1.1功能及調控機制[J]. 江蘇農業(yè)科學，2015，43（1）：27-31.

[10]Loque D，Lalonde S，Looger L L，et al. A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake[J]. Nature，2007，446（7132）：195-198.

[11]Neuhaeuser B，Dynowski M，Mayer M，et al. Regulation of NH4+ transport by essential cross talk between AMT monomers through the carboxyl tails[J]. Plant Physiology，2007，143（4）：1651-1659.

[12]Mayer M，Dynowski M，Ludewig U. Ammonium ion transport by the AMT/Rh homologue LeAMT1.1[J]. Biochemical Journal，2006，396（3）：431-437.

[13]Loque D，Mora S I，Andrade S L，et al. Pore mutations in ammonium transporter AMT1 with increased electrogenic ammonium transport activity[J]. Journal of Biological Chemistry，2009，284（37）：24988-24995.

[14]Mayer M，Ludewig U. Role of AMT1.1 in NH4+ acquisition in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Biology，2006，8（4）：522-528.

[15]Wood C C，Poree F，Dreyer I，et al. Mechanisms of ammonium transport，accumulation，and retention in ooyctes and yeast cells expressing Arabidopsis AtAMT1.1[J]. FEBS Letters，2006，580（16）：3931-3936.

[16]Ludewig U，von Wiren N，Frommer W B. Uniport of NH4+ by the root hair plasma membrane ammonium transporter LeAMT1.1[J]. Journal of Biological Chemistry，2002，277（16）：13548-13555.

[17]Yang S Y，Hao D L，Cong Y，et al. The rice OsAMT1.1 is a proton-independent feedback regulated ammonium transporter[J]. Plant Cell Reports，2015，34（2）：321-330.

[18]Dapuzzo E，Rogato A，Simon-Rosin U，et al. Characterization of three functional high-affinity ammonium transporters in Lotus japonicus with differential transcriptional regulation spatial expression[J]. Plant Physiology，2004，134（4）：1763-1774.

[19]Shelden M C，Dong B，de Bruxelles G L，et al. Arabidopsis ammonium transporters，AtAMT1.1 and AtAMT1.2，have different biochemical properties and functional roles[J]. Plant and Soil，2001，231（1）：151-160.

[20]Khademi S，Oconnell J，Remis J，et al. Mechanism of ammonia transport by Amt/MEP/Rh：structure of AmtB at 1.3.5 A[J]. Science，2004，305（5690）：1587-1594.

[21]Wacker T，Garcia-Celma J J，Lewe P，et al. Direct observation of electrogenic NH4+ transport in ammonium transport （Amt） proteins[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2014，111（27）：9995-10000.

[22]Neuhaeuser B，Ludewig U. Uncoupling of Ionic currents from substrate transport in the plant ammonium transporter AtAMT1.2[J]. Journal of Biological Chemistry，2014，289（17）：11650-11655.

[23]Sogaard R，Alsterfjord M，Macaulay N，et al. Ammonium ion transport by the AMT/Rh homolog TaAMT1.1 is stimulated by acidic pH[J]. Pflugers Archiv（European Journal of Physiology），2009，458（4）：733-743.

[24]Ortiz-Ramirez C，Mora S I，Trejo J，et al. PvAMT1；1，a highly selective ammonium transporter that functions as H+/NH4+ symporter[J]. Journal of Biological Chemistry，2011，286（36）：31113-31122.

[25]Neuhaeuser B，Dynowski M，Ludewig U. Channel-like NH3 flux by ammonium transporter AtAMT2[J]. FEBS Letters，2009，583（17）：2833-2838.

[26]Lima J E，Kojima S，Takahashi H，et al. Ammonium triggers lateral root branching in Arabidopsis in an ammonium transporter 1，3-dependent manner[J]. The Plant Cell，2010，22（11）：3621-3633.