王 慶，趙 冰，陳 娜

疏毛羅勒揮發(fā)油纖維素酶輔助提取工藝及其抗氧化作用的研究

王 慶1，趙 冰2，陳 娜1

目的 研究使用纖維素酶輔助提取疏毛羅勒揮發(fā)油的工藝，并測定揮發(fā)油的抗氧化性。方法 采用單因素試驗和正交試驗相結(jié)合的辦法研究酶濃度、預(yù)處理溫度、預(yù)處理時間對疏毛羅勒揮發(fā)油得率的影響，采用紫外分光光度法測定疏毛羅勒揮發(fā)油對羥自由基的清除率。結(jié)果 最佳提取工藝組合為酶濃度2 mg·mL-1、預(yù)處理溫度45 ℃、預(yù)處理時間4 h。用最佳工藝進(jìn)行預(yù)處理，疏毛羅勒揮發(fā)油得率可達(dá)0.62%，比溫水浸泡預(yù)處理法和直接蒸餾法分別提高了16.98%和58.97%。疏毛羅勒揮發(fā)油具有較強(qiáng)的清除羥自由基活性的作用，EC50=4.846 mg·mL-1。結(jié)論 該工藝可用于疏毛羅勒揮發(fā)油輔助提取，疏毛羅勒揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗氧化性。

疏毛羅勒；揮發(fā)油；纖維素酶；提取工藝

唇形科植物疏毛羅勒(OcimumbasilicumL.)又名九重塔，原產(chǎn)非洲、美洲及亞洲熱帶地區(qū)，為藥食兩用芳香植物，具有化濕消食、疏風(fēng)行氣、活血解毒的作用[1]?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，疏毛羅勒中含有較豐富的揮發(fā)油類化學(xué)物質(zhì)，具有抗氧化、抗菌消炎等多種藥理活性，是疏毛羅勒能防病治病的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[2-4]。本研究采用纖維素酶預(yù)處理輔助提取疏毛羅勒揮發(fā)油，并對其清除羥自由基活性進(jìn)行研究，希望為疏毛羅勒的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 疏毛羅勒采自安徽省亳州市譙東鎮(zhèn)，經(jīng)亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院劉耀武教授鑒定，為唇形科植物疏毛羅勒的全草。纖維素酶活力為100 000 U·g-1，購于山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，批號為L54738。石油醚、無水硫酸鈉、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、過氧化氫等均為分析純。HDM型電加熱套(上虞市鑫達(dá)試驗設(shè)備廠)，RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SHB-Ⅲ型循環(huán)水式正空泵(鞏義市科學(xué)儀器有限公司)，HH-4恒溫水浴鍋(金壇市宏華儀器)。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油提取的工藝流程 將疏毛羅勒的地上部分剪碎，取100 g置于燒瓶中。按試驗設(shè)計，在不同的酶濃度、溫度、預(yù)處理不同的時間，之后按水蒸氣蒸餾法提取2 h，提取終點以石油醚萃取，萃取物再以無水硫酸鈉脫去水分，減壓蒸發(fā)回收石油醚，得疏毛羅勒揮發(fā)油，按照下面的公式計算揮發(fā)油得率[5]。

其中m為提取獲得的揮發(fā)油質(zhì)量，M為參與提取的疏毛羅勒粗粉質(zhì)量。

1.2.2 單因素試驗 ①酶濃度對揮發(fā)油得率的影響控制預(yù)處理條件：酶濃度(0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg·mL-1)、預(yù)處理溫度為40 ℃、預(yù)處理時間為1 h，預(yù)處理結(jié)束按“1.2.1”項的方法完成提取并計算揮發(fā)油的得率。②預(yù)處理溫度對揮發(fā)油得率的影響控制預(yù)處理條件：酶濃度2 mg·mL-1、 預(yù)處理溫度為(35、40、45、50、55、60 ℃)、預(yù)處理時間為1 h，預(yù)處理結(jié)束按“1.2.1”項的方法完成提取并計算揮發(fā)油的得率。③預(yù)處理時間對揮發(fā)油得率的影響控制預(yù)處理條件：酶濃度2 mg·mL-1、 預(yù)處理溫度為50 ℃、預(yù)處理時間為(1、2、3、4、5、6 h)，預(yù)處理結(jié)束按“1.2.1”項的方法完成提取并計算揮發(fā)油的得率。

1.2.3 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，將每個因素各選擇3個較優(yōu)水平，即酶濃度(1、1.5、2 mg·mL-1)、預(yù)處理溫度(35、40、45 ℃)、預(yù)處理時間(2、3、4 h)，設(shè)計L9(34)型正交表進(jìn)行正交試驗，優(yōu)選最佳預(yù)處理工藝。

1.2.4 清除羥自由基活性測定 在試管中依次加入pH=7.4的0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液6 mL、12 mmol·L-1的硫酸亞鐵溶液0.5 mL、12 mmol·L-1的鄰二氮菲溶液0.5 mL、不同濃度的揮發(fā)油的95%乙醇溶液0.5 mL，最后加入0.16%的過氧化氫溶液，混合均勻，混合液在37 ℃水浴中恒溫1 h，于510 nm處測定吸光度AX，用同體積的蒸餾水代替0.16%的過氧化氫溶液測定AX0，用同體積的蒸餾水代替揮發(fā)油的95%乙醇溶液測定吸光度A0，以VC作為對照。按照下列公式計算疏毛羅勒揮發(fā)油的羥自由基的清除率[6-7]。

2 結(jié)果

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 酶濃度對揮發(fā)油得率的影響 由圖1可知，當(dāng)纖維素酶濃度小于2 mg·mL-1時，疏毛羅勒揮發(fā)油的得率隨著酶濃度的增加而不斷增大，但是當(dāng)纖維素酶濃度大于2 mg·mL-1時，疏毛羅勒揮發(fā)油的得率幾乎不再變化，說明酶濃度在2 mg·mL-1附近時，所有底物(疏毛羅勒)都已經(jīng)和纖維素酶結(jié)合，增加纖維素酶濃度，沒有與之結(jié)合的底物，提取率不再增加[8-9]。

圖1 酶濃度對揮發(fā)油得率的影響

2.1.2 預(yù)處理溫度對揮發(fā)油得率的影響 由圖2可知，疏毛羅勒揮發(fā)油的得率一開始隨著提取溫度的增高而增加，當(dāng)提取溫度達(dá)到45 ℃時疏毛羅勒揮發(fā)油的得率最高，但是當(dāng)溫度超過45 ℃時揮發(fā)油的得率反而迅速下降。分析有兩種可能，一是高溫影響了纖維素酶的活性[10]，二是高溫促使揮發(fā)油中的酯類等物質(zhì)溶于水，在接下來的蒸餾過程中發(fā)生了水解[11]。

圖2 溫度對揮發(fā)油得率的影響

2.1.3 預(yù)處理時間對揮發(fā)油得率的影響 由圖3可知，隨著時間的增加，疏毛羅勒揮發(fā)油的得率一開始呈上升趨勢，當(dāng)預(yù)處理時間達(dá)到4 h時疏毛羅勒揮發(fā)油的得率最高，之后延長時間得率幾乎不再變化，因此預(yù)處理4 h為較優(yōu)的時間。

圖3 溫度對揮發(fā)油得率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果 由正交試驗結(jié)果和方差分析可知，各因素對疏毛羅勒揮發(fā)油得率影響大小的順序為酶濃度>溫度>時間，其中酶濃度對疏毛羅勒揮發(fā)油得率具有顯著影響。最佳提取工藝組合為A3B3C3，即酶濃度為2 mg·mL-1、預(yù)處理溫度為45 ℃、預(yù)處理時間為4 h。見表1-2。

表1 各因素對疏毛羅勒揮發(fā)油正交試驗結(jié)果

表2 各因素對疏毛羅勒揮發(fā)油方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00，F(xiàn)0.01(2,2)=99.00。

2.5 不同預(yù)處理方法對疏毛羅勒揮發(fā)油得率的影響 由于正交試驗結(jié)果不包括最佳工藝組合，因此需做驗證試驗。由表3可知，以纖維素酶在最佳工藝條件下進(jìn)行預(yù)處理，疏毛羅勒揮發(fā)油得率可達(dá)0.62%，高于正交試驗中任何一組，比溫水浸泡預(yù)處理法提高了16.98%，比直接蒸餾法提高了58.97%，效果明顯。

表3 不同預(yù)處理方法疏毛羅勒揮發(fā)油得率結(jié)果

2.6 清除羥自由基活性測定結(jié)果 由圖4可以看出，在測定濃度下，疏毛羅勒揮發(fā)油對羥自由基的清除能力低于VC，用PASW Statistics 18.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果VC對羥自由基的EC50=3.213 mg·mL-1，疏毛羅勒揮發(fā)油對羥自由基的EC50=4.846 mg·mL-1。

圖4 清除羥自由基活性測定結(jié)果

3 討論

關(guān)于揮發(fā)油的提取，目前報道較多的主要有超臨界CO2流體萃取法和水蒸氣蒸餾法[12-13]。超臨界CO2流體萃取法雖然提取率高，但是對設(shè)備要求高，成本較大，目前還難以實現(xiàn)大生產(chǎn)，水蒸氣蒸餾法簡單易操作，但揮發(fā)油提取率較低。纖維素酶可水解植物細(xì)胞壁，具有提取條件溫和，時間短等特點，可顯著提高有效成分的溶出度，近年來經(jīng)常被用于天然產(chǎn)物中有效成分的輔助提取[14-16]。

抗氧化劑可代替人體的組織和細(xì)胞被自由基氧化而保護(hù)機(jī)體，在食品、保健品、藥品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。目前市場上最流行的是合成型抗氧化劑，但是其具有潛在的毒性，逐漸被人們排斥，從天然藥物中尋找低毒高效的活性成分開發(fā)抗氧化劑已經(jīng)成為研究的熱點。天然的揮發(fā)油中含有較多不飽和基團(tuán)，具有抗氧化的基礎(chǔ)，近年來，關(guān)于揮發(fā)油的抗氧化活性時有報道。亳州產(chǎn)疏毛羅勒是羅勒的一個變種。

本試驗采用纖維素酶預(yù)處理法輔助提取疏毛羅勒揮發(fā)油，并研究了其清除羥自由基的活性，結(jié)果，最佳工藝組合為酶濃度2 mg·mL-1、預(yù)處理溫度45 ℃、預(yù)處理時間4 h，其中酶濃度對揮發(fā)油得率具有顯著影響。用最佳工藝進(jìn)行預(yù)處理，疏毛羅勒揮發(fā)油得率可達(dá)0.62%，比溫水浸泡預(yù)處理法和直接蒸餾法分別提高了16.98%和58.97%。抗氧化結(jié)果表明疏毛羅勒揮發(fā)油對羥自由基具有較強(qiáng)的清除能力，EC50為4.846 mg·mL-1。

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Assisted Extraction by Cellulase of Volatile Oil inOcimumBasilicumL and Its Antioxygenation

WANG Qing1, ZHAO Bing2, CHEN Na1

(1.Bozhou Vocational and Technical College,Bozhou 236800,China; 2.Huatuo Medicines co.,Ltd, Bozhou 236800,China)

ObjectiveTo study assisted extraction by cellulase of volatile oil inOcimumbasilicumL and its antioxygenation.MethodsSingle factor test and orthogonal test were used to study effects of enzyme concentration, pretreatment temperature and pretreatment time on the yield of volatile oil fromOcimumbasilicumL. UV spectrophotometry was used to determine the scavenging rate of hydroxyl radical in volatile oil fromOcimumbasilicumL.ResultsThe optimum extraction process was that enzyme concentration was 2 mg·mL-1, pretreatment temperature was 45℃, and pretreatment time was 4h. Under the optimum pretreatment conditions, the yield ofOcimumbasilicumLvolatile oil was 0.62%. Compared with warm water soaking pretreatment and direct distillation method, the yield was increased by 16.98% and 58.97%, respectively. The volatile oil ofOcimumbasilicumL had a stronger role of scavenging hydroxyl radical, EC50=4.846 mg·mL-1.ConclusionThis process could be used for the assisted extraction of volatile oil fromOcimumbasilicumL, and the volatile oil ofOcimumbasilicumL has stronger antioxidant activity.

OcimumbasilicumL；volatile oil；cellulase；extraction process

1672-688X(2017)02-0097-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.02.005

安徽省教育廳自然科學(xué)基金重點課題(KJ2015A397)

2017-04-25

1.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽亳州 236800 2.安徽華佗國藥股份有限公司，安徽亳州236800

王慶(1982—)，女，安徽亳州人，講師，從事藥物活性成分提取分離研究工作。

R283.6

A