于丹，陳楠，張穎，孟凡佳，都曉偉

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

工程師園地

天花粉多糖的除蛋白工藝優(yōu)化研究*

于丹，陳楠，張穎，孟凡佳，都曉偉*

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

目的：優(yōu)化天花粉多糖的除蛋白工藝。方法：以除蛋白率、多糖收率和天花粉多糖中的中性糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)，篩選并優(yōu)化了天花粉多糖的除蛋白工藝。結(jié)果：天花粉多糖的最佳除蛋白工藝為提取液以50%乙醇濃度除雜，上清液調(diào)節(jié)乙醇濃度達(dá)80%醇沉；沉淀加水溶解，TCA濃度15%，體積1∶1，振蕩30min；取上清液，再加入氯仿-正丁醇溶液體積比10∶1，劇烈振搖20min，萃取兩次。除蛋白率為88.18%，多糖收率為75.07%，總糖含量可達(dá)77.74%，蛋白質(zhì)含量僅為0.23%。結(jié)論：乙醇分級醇沉、TCA法和Sevage法的聯(lián)合除蛋白質(zhì)方法簡便，成本較低，可大量除去天花粉多糖中的蛋白質(zhì)和淀粉雜質(zhì)，提高天花粉多糖純度。

天花粉；多糖；除蛋白質(zhì)工藝

天花粉（Trichosanthis Radix）來源于葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.或雙邊栝樓Trichosanthes rosthornii Harms的干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國有著悠久的藥用歷史。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)天花粉主要含有蛋白質(zhì)、凝集素、多糖和黃酮等化學(xué)成分[1]，其中天花粉多糖為一類主要活性化學(xué)成分，具有降血糖、抗腫瘤和免疫增強(qiáng)等多種藥理作用[2]。但在天花粉多糖的制備過程中，由于天花粉含有大量的蛋白質(zhì)和凝集素，常與多糖形成綴合物，且天花粉蛋白屬于水溶性的高分子化合物，在提取多糖時被一起提取出來，成為了影響天花粉多糖純度的主要雜質(zhì)。同時，天花粉蛋白和天花粉凝集素屬于核糖體滅活蛋白，二者是與天花粉臨床應(yīng)用不良反應(yīng)相關(guān)的主要成分[1]。另外，天花粉中淀粉含量豐富，且其也屬于多糖類成分，但卻沒有與天花粉多糖相一致的藥理活性，也是影響天花粉多糖純度的一類雜質(zhì)。因此，盡可能去除蛋白質(zhì)和淀粉類雜質(zhì)是提高天花粉多糖純度的重要環(huán)節(jié)，但目前尚未見此部分研究工作的詳細(xì)報(bào)道。

在多糖的純化工藝研究中，常見的除蛋白質(zhì)方法主要為Sevage法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法（TCA法）與酶法，各種除蛋白方法均有利弊，如效率低、多糖易降解、多糖損失大、除蛋白質(zhì)不完全等[3]。為了盡量除去天花粉多糖中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，并且降低多糖損失率，本實(shí)驗(yàn)采用聯(lián)合乙醇分級醇沉、TCA法和Sevage法的除蛋白質(zhì)方法優(yōu)化了天花粉多糖的純化工藝，得到了較為滿意的效果。此結(jié)果可為天花粉多糖的進(jìn)一步開發(fā)研究和生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

722E型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）;UV-2700型紫外分光光度計(jì)（日本島津）; N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化科技有限公司）;H1850型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司），PHS-25型精密數(shù)顯酸度計(jì)（杭州雷磁分析儀器廠）。

D-葡萄糖（供含量測定用，批號110833-201004，中國藥品生物制品檢定所）；D-半乳糖醛酸（供含量測定用，批號111646-200301，中國藥品生物制品檢定所）；牛血清白蛋白（生化級別，批號：735094，Roche），考馬斯亮蘭G-250（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；95%乙醇（AR天津廣成精細(xì)化學(xué)品有限公司）；NaOH（AR國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;三氯乙酸（AR天津廣成精細(xì)化學(xué)品有限公司）；正丁醇（AR天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；氯仿（AR天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；其它化學(xué)試劑均為分析純。

天花粉藥材購于安陽天尊生物工程股份有限公司，粉碎后過60目篩備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中性糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量測定

（1）中性糖含量測定精密吸取濃度為0.044，0.055，0.066，0.077，0.088，0.099，0.11mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液1mL置具塞試管中，以水為空白對照，分別加入1mL蒸餾水與1mL 5%苯酚溶液，迅速加入濃H2SO45mL，沸水浴15min，冷卻至室溫。于490 nm處測定吸光度（A），以A為橫坐標(biāo)，質(zhì)量為縱坐標(biāo)，得回歸方程為：Y=197.8X-4.252，r= 0.9985，線性范圍為44～110μg。

（2）糖醛酸含量測定精密量取濃度為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06mg·mL-1的D-半乳糖醛酸對照品溶液1mL置于具塞試管中，于冰水浴中緩慢加入四硼酸鈉－濃H2SO4溶液5mL，搖勻，沸水浴中加熱8min，取出冰浴中冷卻后加入0.15%間羥聯(lián)苯溶液80μL，混勻，靜置30min。于525nm處測定吸光度（A），以A為橫坐標(biāo)，質(zhì)量為縱坐標(biāo)，得回歸方程為：Y=87.807X+3.4042，r=0.9991，線性范圍為10～60μg。

（3）蛋白質(zhì)含量測定精密吸取濃度分別為0.01，0.02，0.04，0.06，0.08和0.10mgomL-1的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL至試管中，以水為空白對照，分別加入0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5mL，再加入0.9%NaCl溶液4ml，混勻。于638nm處測定吸光度（A），以A為橫坐標(biāo)，質(zhì)量為縱坐標(biāo)，得回歸方程為：Y=193.4X-2.9043，r=0.9994，線性范圍為10～100μg。

1.2.2 天花粉多糖的提取精密稱取天花粉藥材500g，加入25倍量體積水，于45℃浸泡提取3次，每次4h，過濾，合并濾液，減壓回收至500mL，-20℃冷凍備用。

1.2.3 天花粉多糖的分級醇沉條件考察取1.2.1項(xiàng)下提取液80mL，緩慢加入95%乙醇使含醇量達(dá)50%，4℃靜置12h，過濾，濾液平均分成4份。分別緩慢加入95%乙醇使含醇量達(dá)60%、70%、80%和90%，4℃靜置12h，離心，沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌3次，干燥，稱重，計(jì)算收率，并測定多糖得量，計(jì)算多糖含量。

1.2.4 除蛋白質(zhì)方法的考察

（1）Sevage法除蛋白質(zhì)取天花粉多糖醇沉樣品1.50g，溶于10mL水中，加入氯仿-正丁醇溶液（5：1）2mL，劇烈振搖20min，蛋白質(zhì)變性成膠狀存在于水相與溶劑相的交界面上，分去水層與溶劑層交界處的變性蛋白。此操作重復(fù)多次，直至水相與溶劑相的交界面上無變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)為止。取水相分別測定蛋白質(zhì)與多糖含量。

（2）TCA法除蛋白質(zhì)取天花粉多糖醇沉樣品1.50g，溶于10mL水中，加入15%TCA10mL，強(qiáng)烈振搖30min，離心，取上清液加入NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值為7，過濾，回收至5 mL，分別測定蛋白質(zhì)與多糖含量。

1.2.5 TCA-Sevage法除蛋白質(zhì)的條件優(yōu)化

（1）TCA法除蛋白質(zhì)的濃度考察取天花粉多糖醇沉樣品5份，每份1.50g，溶于10mL水中，分別加入5%，10%，15%、20%、和30%的TCA 10mL，強(qiáng)烈振搖30min，離心，取上清液加NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值為7，過濾，回收至5mL，分別測定蛋白質(zhì)與多糖含量。

1.2.5.2 TCA法除蛋白質(zhì)的體積考察取天花粉多糖醇沉樣品5份，每份1.50g，溶于10mL水中，分別加入15%TCA 4、6、8、10和12mL，強(qiáng)烈振搖30min，離心，取上清液加NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值為7，過濾，回收至5 mL，分別測定蛋白質(zhì)與多糖含量。

（3）TCA法除蛋白質(zhì)的時間考察取天花粉多糖醇沉樣品5份，每份1.50g，溶于10mL水中，分別加入15%TCA 10 mL，強(qiáng)烈振搖20、30、40、50和60min，離心，取上清液加NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值為7，過濾，回收至5 mL，分別測定蛋白質(zhì)與多糖含量。

（4）Sevage法除蛋白質(zhì)的次數(shù)考察取經(jīng)TCA法除蛋白質(zhì)后的上清液3份，每份20mL，加入氯仿-正丁醇溶液（5∶1）2mL，劇烈振搖20min，分別萃取1、2和3次，分去水層與溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。取水層加氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值為7，過濾，回收至5 mL，分別測定蛋白質(zhì)與多糖含量。

1.2.6 天花粉多糖的純度測定取天花粉多糖配制成10mg·mL-1的樣品溶液，分別測定中性糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量。取天花粉多糖配制成2mg·mL-1的溶液，離心，取上清液在200～400nm范圍內(nèi)利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行紫外全波長掃描，以確定天花粉多糖中是否含有核酸和蛋白質(zhì)綴合物。

2 結(jié)果與討論

2.1 天花粉多糖的分級醇沉條件考察

乙醇分級醇沉考察結(jié)果表明（表1），當(dāng)乙醇濃度為60%，沉淀量、收率、多糖得量、多糖含量均較低。經(jīng)70%，80%與90%乙醇濃度醇沉后，多糖含量相近；但在多糖得量、沉淀量與收率方面，90%醇沉濃度最高，80%醇沉濃度其次，二者均顯著高于70%醇沉濃度；90%與80%醇沉濃度相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。從經(jīng)濟(jì)方面考慮，本實(shí)驗(yàn)確定的最佳乙醇醇沉條件為：天花粉多糖提取液（藥液濃度相當(dāng)于含生藥材1gomL-1）先加95%乙醇調(diào)節(jié)乙醇濃度達(dá)50%，4℃靜置12h，過濾，除雜，上清液繼續(xù)加入95%乙醇調(diào)節(jié)乙醇濃度達(dá)80%醇沉。

表1 不同乙醇濃度考察結(jié)果（n=3）Tab.1Results of precipitation with different amount of alcohol（n=3）

2.2 除蛋白質(zhì)方法比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表2），TCA法的除蛋白率與多糖收率均顯著性高于Sevage法（P＜0.05），但TCA法的除蛋白率雖可達(dá)80.18%，但仍有少量蛋白質(zhì)雜質(zhì)未除盡。

表2 不同除蛋白方法比較結(jié)果（n＝3）Tab.2Results of deprotein with different methods（n＝3）

2.3 TCA-Sevage法除蛋白質(zhì)優(yōu)化結(jié)果

TCA-Sevage法除蛋白質(zhì)優(yōu)化結(jié)果見圖1和表3。

圖1TCA除蛋白質(zhì)考察結(jié)果Fig.1Results of deprotein with TCA

表3 Sevage法除蛋白的次數(shù)考察結(jié)果（n＝3）Tab.3Result of different times with sevage method（n＝3）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著TCA濃度和體積的增加，除蛋白率增強(qiáng)，但多糖回收率下降，最終確定TCA的濃度為15%，體積為10mL；隨著TCA除蛋白時間的延長，30min后除蛋白率增長緩慢，但多糖回收率基本保持不變，最終確定除蛋白時間的為30min。隨著Sevage法除蛋白次數(shù)的增加，除蛋白率升高，但不存在顯著性差異（P＞0.05）；多糖收率下降，以除蛋白3次的多糖收率下降最為顯著（P＜0.05）。綜合除蛋白率與多糖收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定Sevage法除蛋白次數(shù)為2次。故最終確定的除蛋白質(zhì)方法為：取天花粉多糖的醇沉沉淀加一定量的水溶解，溶液（mL）∶15%三氯乙酸（mL）體積比1∶1，振蕩30min，離心，取上清液（mL）：體積氯仿-正丁醇溶液（5∶1，mL）體積比10∶1，劇烈振搖20min，萃取兩次，分去水層與溶劑層交界處的變性蛋白。取水層加氫氧化鈉，調(diào)節(jié)PH值為7，過濾，即得。

2.4 天花粉多糖的純度測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表4和圖2），天花粉多糖具有較高的純度，其總糖含量可達(dá)77.74%，蛋白質(zhì)含量僅為0.23%。且紫外光譜中，在260和280nm處無明顯吸收峰，表明無核酸和蛋白質(zhì)。

表4 天花粉多糖中的中性糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)的含量測定（n=3）Tab.4Content of neutral sugar,uronic acid and protein of polysaccharides from Trichosanthis Radix（n=3）

圖2天花粉多糖紫外光譜圖Fig.2UV spectra of polysaccharides from Trichosanthis Radix

3 討論

3.1 提取方法的確定

由于天花粉中含有大量的淀粉，當(dāng)提取溫度高于45℃時溶液成糊狀，使提取液與殘?jiān)y以分離。碘試液檢測提取液呈明顯藍(lán)色，表明有大量的淀粉溶出。淀粉的溶出給多糖的分離造成困難，同時使多糖的含量測定結(jié)果偏高。為了避免上述現(xiàn)象的發(fā)生，故本實(shí)驗(yàn)確定采用提取溫度≤45℃、水浸泡的方法提取天花粉總多糖。此結(jié)果與黃曉蘭等的研究報(bào)道結(jié)果相一致[4]。

3.2 乙醇分級醇沉條件的確定

乙醇醇沉法是經(jīng)典的多糖純化方法，當(dāng)向天花粉多糖提取液中加入95%乙醇調(diào)節(jié)含醇量達(dá)50%時，出現(xiàn)少量淡黃色沉淀，采用苯酚-硫酸法未檢測到多糖成分，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測到蛋白質(zhì)類成分。故為了提高多糖純度，本實(shí)驗(yàn)樣品先調(diào)節(jié)含醇達(dá)50%，4℃靜置12h，過濾除雜，然后上清液繼續(xù)加95%乙醇調(diào)節(jié)含醇量考察最佳的分級醇沉條件。

3.3 除蛋白質(zhì)方法的確定

Sevage法和TCA法是常用的除蛋白質(zhì)方法，尤其是TCA法，除蛋白質(zhì)效率較高，常用于植物多糖的蛋白質(zhì)去除。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于天花粉多糖中蛋白質(zhì)含量較高，采用Sevage法需重復(fù)操作11次才能使兩相交界面上無變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)，且多糖損失率較高（49.55%）。TCA法較Sevage法除蛋白率高，多糖損失率低，操作簡便，可除去大量蛋白質(zhì)，但仍有少部分蛋白質(zhì)殘留，若增加TCA除蛋白質(zhì)次數(shù)，多糖損失量增高。故本實(shí)驗(yàn)先采用TCA法除去樣品中的大量蛋白，再用Sevage法除去殘留的少量蛋白質(zhì)，以盡可能多的除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所確定的天花粉多糖除蛋白工藝，操作方法簡便，成本較低，可大量除去天花粉多糖中的蛋白質(zhì)和淀粉雜質(zhì)，提高天花粉多糖純度。此純化工藝可為天花粉多糖在分離、結(jié)構(gòu)鑒定和藥理作用等方面的進(jìn)一步開發(fā)研究與生產(chǎn)應(yīng)用提供相應(yīng)的技術(shù)支持。

［1］李振紅，陸陽，劉晶星.天花粉化學(xué)成分與藥理活性［J］.國外醫(yī)藥.（植物藥分冊），2003，18（1）：1-4.

［2］洪纓，顧海鷗.天花粉藥理研究進(jìn)展［J］.北京醫(yī)藥，1994，（3）：32-35.

［3］王珊,黃勝陽.植物多糖提取液脫蛋白方法的研究進(jìn)展［J］.食品科技,2012,37（9）:188-191.

［4］黃曉蘭，吳惠勤，王蔚，等.,天花粉多糖的提取、分離與純化研究［J］.中草藥，2008，39（11）：1662-1665.

Optimization study of deproteinization process for polysaccharides from Trichosanthis Radix*

YU Dan,CHEN Nan,ZHANG Ying,MENG Fan-jia,DU Xiao-wei*
（Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Objective:To optimize deproteinization process of polysaccharides from Trichosanthis Radix. Method:With retention rate of polysaccharides,deproteinized rate and the content of neutral sugar,uronic acid and protein as indexes,the optimized deproteinization process of polysaccharides from Trichosanthis Radix were studied. Result:The concentrated solution was precipitated sequentially by final concentration of 50%（v/v）ethanol and 80%（v/v）ethanol,then the precipitate was removed protein by adding the equal volume of 15%TCA to deprotein 30min,and the last step is that the supernate was mixed with chloroform and n-butanol as volume ratio of 10:1 to severe vibrate 20 min and repeat two times.Retention rate of polysaccharides,deproteinized rate,the content of total sugar and protein were 75.07%,88.18%,77.74%and 0.23%,respectively．Conclusion:The deproteinized method united grade alcohol sink,TCA and Sevage method could improve the purity of polysaccharide from trichosanthis radix by removing the large amounts of protein and starch impurity,meanwhile the method is simple and low costing.

Trichosanthis Radix;polysaccharides;deproteinization process

R93

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170663

2017-04-11

黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目（12511523）

于丹（1980-），女，博士，副教授，研究方向：中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

都曉偉，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥及天然藥物的質(zhì)量評價與開發(fā)。