蒙藥材玉簪花指紋圖譜研究

李慧芳+王敏杰+朱賀年

[摘要] 目的 采用高效液相色譜法建立蒙藥材玉簪花指紋圖譜分析方法，為玉簪花藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。 方法 采用高效液相色譜法對(duì)蒙藥材玉簪花指紋圖譜進(jìn)行研究，色譜柱為Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-0.5%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長256 nm，結(jié)果采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)” 以中位數(shù)法生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。 結(jié)果 10個(gè)批次的玉簪花藥材的色譜指紋圖譜有18個(gè)共有峰，高效液相色譜指紋圖譜的相似度都>0.9，建立共有模式，不同批次玉簪花指紋圖譜相似性較好。 結(jié)論 高效液相色譜法用于蒙藥玉簪花指紋圖譜研究可為玉簪花藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)和今后規(guī)范藥用資源提供科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 蒙藥材；玉簪花；高效液相色譜；指紋圖譜

[中圖分類號(hào)] R284 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）05（a）-0034-04

Study on fingerprint of Mongolian medicine Hosta plantaginea Aschers

LI Huifang1 WANG Minjie2 ZHU Henian3

1.Department of Pharmacy， Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot 010059， China； 2.School of Basic Medicine， Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot 010110， China； 3.Baotou Traditional Chinese Medicine Co.， Ltd， Inner Mongolia Autonomous Region， Baotou 014040， China

[Abstract] Objective To establish the fingerprint of Mongolian medicine Hosta plantaginea Aschers by high performance liquid chromatography （HPLC） and to provide reference for scientific quality evaluation and effective control of quality. Methods HPLC was applied to study the fingerprints of Mongolian medicine Hosta plantaginea Aschers， chromatographic column was Phenomenex Luna C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， phase gradient elution was proceeded with methanol-0.5% phosphate aqueous mobile， with flow rate of 1.0 mL/min and temperature of 30℃ detected on 256 nm， the chromatographic fingerprints were analyzed with the "similarity of chromatographic fingerprints of traditional Chinese medicine evaluation system". Results The HPLC fingerprint of Hosta plantaginea Aschers from 10 different areas had eighteen common peaks， the similar degree of HPLC fingerprint was above 0.9， it was a better similarity of fingerprint of Mongolian medicine Hosta plantaginea Aschers from different areas. Conclusion Application of HPLC in the fingerprint of Mongolian medicine Hosta plantaginea Aschers can provide a scientific basis of quality evaluation and specification for medical resources in the future.

[Key words] Mongolian medicine； Hosta plantaginea Aschers； High performance liquid chromatography； Fingerprint

蒙藥玉簪花Hosta plantaginea Aschers為百合科玉簪屬植物玉簪Hosta plantaginea（Lam.）Asch.的花蕾，蒙藥名哈斯-哈塔胡爾-其其格，又名內(nèi)消花、白鶴花，始見于《本草綱目》[1-2]，性寒、味澀，具有清熱、解毒、止咳、利咽喉之功效，主治咽喉腫痛、音啞、肺熱、毒熱，具有悠久的蒙醫(yī)臨床用藥歷史和確切的療效，是蒙醫(yī)專用、常用藥物，在蒙醫(yī)臨床用藥中占有重要地位[3-5]。然而，目前對(duì)玉簪花的相關(guān)成分和藥理作用研究報(bào)道仍然較少，尤其對(duì)蒙藥玉簪花質(zhì)量控制方法的報(bào)道較少，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究關(guān)系到其臨床利用和開發(fā)研究，因此，明晰其質(zhì)量控制方法，建立玉簪花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是非常重要，可為其在臨床上使用奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

近年來關(guān)于玉簪花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，有關(guān)于總多糖、總黃酮、山奈酚、甾體化合物及總黃酮的含量測(cè)定的報(bào)道[6-11]，但對(duì)玉簪花藥材指紋圖譜的研究報(bào)道仍然較少。因此，基于目前對(duì)玉簪花所含主要成分、定性定量分析方法、指紋圖譜質(zhì)量控制方法、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范要求等仍不完善這一現(xiàn)狀，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法建立了玉簪花藥材的指紋圖譜分析方法，并對(duì)不同批次玉簪花藥材的質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)的比較研究，以便更好地進(jìn)行玉簪花質(zhì)量控制，為建立玉簪花法定藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)[12]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津CBM-10A VP plus HPLC儀；奧泰800型蒸發(fā)光檢測(cè)器；LC Solutionlite色譜工作站。電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；鼓風(fēng)式干燥箱（上海分析儀器廠）。

1.2 樣品及試劑

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）購買于Merck，Germany，超純水，山萘酚（100081-200406，中國藥品生物制品檢定研究所），其他試劑均為分析純。

玉簪花1、2、3批（購于亳州市颯楓藥業(yè)）；玉簪花4、5、6批（購于亳州榮華堂中藥材采購站）；玉簪花7、8、9、10批（購于安國市榮草藥材行），經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中藥鑒定教研室渠弼教授鑒定為百合科植物玉簪的干燥花。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取玉簪花藥材粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲（25 kHz）提取40 min，放冷至室溫，并用甲醇補(bǔ)足重量，溶液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，搖勻，取一定量的甲醇提取液續(xù)濾液，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取在60℃減壓干燥4 h至恒重的山奈酚對(duì)照品1.00 mg，至10 mL的容量瓶中，加甲醇制成每毫升含100 μg山奈酚的溶液，即得。

2.3 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑色譜柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.5%磷酸溶液（B）（線形梯度）按表1程序進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長256 nm。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察 精密吸取玉簪花藥材供試品溶液10 μL，依給定色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其HPLC圖譜?？疾爝x出的18個(gè)共有指紋峰，以6號(hào)峰為參照峰。結(jié)果表明：各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD（RT）值<1%，相對(duì)峰面積比值的RSD值分別在RSD（RA）值<3%，表明儀器等整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性考察 取同一個(gè)批次的玉簪花樣品5份，按“2.1”步驟操作，通過HPLC分析5份玉簪花藥材供試品溶液，結(jié)果表明：各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD（RT）值<2%，相對(duì)峰面積比值的RSD值分別在RSD（RA）值<5%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取新鮮制備的玉簪花供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、6、12、24、48 h進(jìn)樣10 μL，結(jié)果顯示，通過HPLC分析玉簪花藥材供試品溶液，結(jié)果表明：上述各色譜峰各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD（RT）值<2%，相對(duì)峰面積比值的RSD值分別在RSD（RA）值<3%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.5 不同批次藥材玉簪花指紋圖譜測(cè)定

本研究分別取10批次玉簪花藥材樣品，按照“2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的條件依次對(duì)供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，10個(gè)批次藥材色譜圖的疊加圖譜見圖1，其中有18個(gè)峰特征顯著，重現(xiàn)性好，因此確定這18個(gè)峰為指紋圖譜的共有指紋峰。根據(jù)10批玉簪花藥材指紋圖譜的檢測(cè)結(jié)果[共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間（RT）和相對(duì)峰面積（RA）]，采用國家藥典委員會(huì)編寫的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2010年2.0版）以中位數(shù)法生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（見圖1）。在圖1中，6號(hào)峰為參照物（山奈酚）峰。結(jié)果表明，10批不同產(chǎn)地的玉簪花相似度值均>0.9，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長考察

玉簪花主要含有皂苷類、黃酮類及香豆素類成分，實(shí)驗(yàn)中同時(shí)選定了256、295、340 nm 3個(gè)波長進(jìn)行檢測(cè)。又因供試品和對(duì)照品溶液經(jīng)200～400 nm全波長掃描，溶液在256 nm處均呈現(xiàn)最大吸收，故實(shí)驗(yàn)中選定了256 nm為檢測(cè)波長。

3.2 流動(dòng)相選擇

選擇流動(dòng)相時(shí)，為使各成分分離完全，相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，出峰時(shí)間短，本研究中采用梯度洗脫的方法，分別以甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-冰醋酸等不同體積分?jǐn)?shù)、不同比例的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行等度和梯度洗脫試驗(yàn)。結(jié)果表明：采用甲醇（A）-0.5%磷酸溶液（B）進(jìn)行梯度洗脫為佳，峰形尖銳且分離度較好，流動(dòng)相在不同時(shí)間洗脫比例時(shí)，各峰的保留時(shí)間適中，且基線較平穩(wěn)，不易漂移?？紤]到線性梯度洗脫程序簡單、操作容易、具有普遍適用性的特點(diǎn)，并能有效的提高色譜圖的分離度，因此選擇上述流動(dòng)相條件進(jìn)行線性洗脫。鑒于玉簪花中化學(xué)成分復(fù)雜，為避免色譜峰拖尾，因此流動(dòng)相加入酸，既可以有效避免了色譜圖的拖尾現(xiàn)象，又有利于指紋圖譜的分析。

3.3 提取溶劑及方法的考察

3.3.1 提取溶劑的考察 取玉簪花藥材粉末1 g，共6份，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各20 mL，稱重，超聲處理40 min，取出，放冷，稱重。分別用相應(yīng)的溶劑補(bǔ)足失重，過濾，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。分別考察HPLC指紋圖譜，經(jīng)過對(duì)出峰個(gè)數(shù)及分離度等的綜合比較，確定甲醇為適宜的提取溶劑。

3.3.2 提取條件的考察 取玉簪花藥材樣品中粉0.5 g，共5份，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱重，分別在設(shè)定條件下提取，放冷，用甲醇補(bǔ)足失重，濾過，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過。比較用甲醇超聲提60、40、20 min所測(cè)得相應(yīng)峰峰面積與甲醇回流60 min的相應(yīng)峰峰面積，各提取方式色譜圖的峰數(shù)、峰位差別比較，超聲提取40 min的響應(yīng)值較其他提取方式高，因此選超聲提取40 min。因此選擇以甲醇為提取溶劑，超聲40 min為玉簪花藥材的提取條件。

3.4 參照物的選擇

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道玉簪屬植物中含有黃酮類[13]，其中解紅霞等[9-10]從玉簪花中分離出了山奈酚，何健等[14]建立了藥材中山奈酚-7-O-葡萄糖苷含量測(cè)定方法，王靜等[15]以山奈酚作為對(duì)照品對(duì)玉簪花中的總黃酮進(jìn)行測(cè)定。玉簪花藥材中提取物全波長掃描中最大吸收波長與山奈酚一致，故選用山萘酚為參照物（S）。

3.5 試驗(yàn)結(jié)果和研究意義

蒙藥是中華民族醫(yī)藥的瑰寶，具有鮮明的民族特色、地域特點(diǎn)和獨(dú)特的理論體系，其資源獨(dú)特，具有悠久的臨床應(yīng)用和實(shí)踐歷史，療效顯著。然而，由于蒙藥的研究開發(fā)相對(duì)于中藥以及其他民族藥相對(duì)緩慢，尤其是在蒙藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制上，仍然有很多蒙藥材尚不完善，這大大限制了蒙藥的現(xiàn)代臨床應(yīng)用和開發(fā)研究，因此，亟待完善蒙藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為加快蒙醫(yī)藥發(fā)展奠定理論基礎(chǔ)。另外，民族藥材在臨床上應(yīng)用廣泛，而且藥材產(chǎn)地來源廣泛，所以有必要對(duì)藥材的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)進(jìn)行研究。但是其成分復(fù)雜，活性成分不明，鑒別困難，單靠測(cè)定已知的有效成分控制其質(zhì)量穩(wěn)定性是不夠的，藥效的發(fā)揮必須強(qiáng)調(diào)整體性，所以提出了色譜指紋圖譜鑒別。色譜指紋圖譜質(zhì)量控制能夠在中藥（蒙藥）有效成分不明確的狀況下，仍可有效地表征其質(zhì)量。HPLC 指紋圖譜技術(shù)作為鑒別和評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的有效工具，目前已廣泛用于中草藥及其各種制劑的質(zhì)量控制。

蒙藥玉簪花是蒙藥常用的一種藥物，可用于治療肺熱、咽喉腫痛、嘶啞、胸?zé)岬龋哂杏凭玫挠盟帤v史，其療效確切，然而，目前對(duì)于玉簪花的化學(xué)成分和藥理作用研究仍然較少，國內(nèi)一些學(xué)者對(duì)其化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行了研究報(bào)道，如薛培鳳等對(duì)玉簪花的主要化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行了研究，對(duì)玉簪花中的總多糖、總黃酮、山奈酚、甾體化合物等的提取方法和含量測(cè)定進(jìn)行了研究報(bào)道，并發(fā)現(xiàn)玉簪花具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[16-17]。另外，何軍偉等[18]也對(duì)玉簪花的乙醇提取物進(jìn)行了抗炎作用研究，劉接卿等[19]對(duì)玉簪花中的抗腫瘤活性甾體成分進(jìn)行了研究，葉曉川等[20]及辛穎等[21-22]對(duì)玉簪花進(jìn)行了體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究。然而，因玉簪花產(chǎn)地眾多，來源廣泛，其活性物質(zhì)含量也稍具差異，雖然有關(guān)于玉簪花中總多糖、總黃酮、山奈酚、甾體化合物及總黃酮的含量測(cè)定的報(bào)道，但是對(duì)玉簪花藥材指紋圖譜的研究報(bào)道仍然較少。因此，基于目前對(duì)玉簪花指紋圖譜質(zhì)量控制方法、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范要求等仍不完善這一現(xiàn)狀，本研究采用HPLC法，對(duì)采集的10個(gè)批次玉簪花藥材，通過對(duì)玉簪花指紋圖譜中的峰數(shù)目、峰形、柱效、分離度及峰面積等多指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，表明該方法的穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性較好，圖譜相似度采用國家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2010年2.0版），結(jié)果顯示，各產(chǎn)地藥材與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度在 0.9～1.0。結(jié)果表明，各批次玉簪花藥材來源質(zhì)量均一、穩(wěn)定。該指紋圖譜方法的建立為玉簪花藥材的內(nèi)在質(zhì)量及相關(guān)制劑的研究控制提供了科學(xué)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草（蒙藥卷）[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004：142.

[2] 李時(shí)珍.本草綱目[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1977：1208.

[3] 內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳.內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)[M].赤峰：內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版，1987：386.

[4] 衛(wèi)生部.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（蒙藥分冊(cè)）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：10.

[5] 占布拉道爾吉.無誤蒙藥鑒（蒙文版）[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，1988：233-244.

[6] 王娜娜，薛培鳳，耿婕，等.蒙藥玉簪花總多糖提取工藝優(yōu)選與含量測(cè)定[J].中國藥業(yè)，2014，23（15）：47-49.

[7] 李曉娟，薛培鳳，鞠愛華，等.蒙藥玉簪花中山奈酚的HPLC含量測(cè)定與薄層色譜鑒別[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，33（4）：307-310.

[8] 張金花.蒙藥玉簪花化學(xué)成分研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院，2009：25-26.

[9] 解紅霞，張金花，張宏桂，等.蒙藥玉簪花的化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志，2009，44（10）：733-735.

[10] 解紅霞，薛培鳳，張宏桂，等.可見分光光度法測(cè)定玉簪花中總皂苷的含量[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32（9）：624-625.

[11] 張金花，謝紅霞，薛培鳳，等.蒙藥玉簪花中的甾體化合物[J].中國藥學(xué)雜志，2010，45（5）：335-337.

[12] 國家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）[J].中成藥，2000，22（10）：671-675.

[13] 鐘國躍，周華蓉，禹志領(lǐng)，等.民間藥物“玉簪”抗非特異性炎癥活性的研究[J].中國中藥雜志，2003，28（10）：979-980.

[14] 何健，高英，李衛(wèi)民.HPLC法測(cè)定蒙藥玉簪花中山奈酚葡萄糖苷的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21（2）：192-194.

[15] 王靜，薛培鳳，趙子龍，等.紫外分光光度法測(cè)定蒙藥玉簪花中總黃酮的含量[J].內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013， 35（2）：93-95.

[16] 李春燕，薛培鳳，劉美娜，等.蒙藥玉簪花抗炎作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2015，26（7）：1559-1560.

[17] 解紅霞，薛培鳳，周靜，等.蒙藥玉簪花鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，32（1）：36-38.

[18] 何軍偉，楊麗，朱繼孝，等.蒙藥玉簪花不同濃度乙醇提取物的抗炎作用及其HPLC分析[J].江西師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2016，40（2）：183-185.

[19] 劉接卿，王翠芳，邱明華，等.玉簪花的抗腫瘤活性甾體皂苷成分研究[J].中草藥，2010，41（4）：520-526.

[20] 葉曉川，李文媛，顏彥，等.玉簪花體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究[C].第九屆全國中藥和天然藥物學(xué)術(shù)研討會(huì)，2007：4.

[21] 辛穎，達(dá)拉胡.蒙藥玉簪花不同萃取部位抗炎活性研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2015，11（23）：5-7.

[22] 辛穎，白玉花.蒙藥玉簪花乙醇提取物體外和體內(nèi)的抑菌活性研究[J].中成藥，2015，37（3）：653-656.

（收稿日期：2017-01-02 本文編輯：張瑜杰）