密孔菌固態(tài)發(fā)酵農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)漆酶活性的研究

李秀男, 牛子琪, 胡衛(wèi)成,2,3, 王新風,2,4

(1.淮陰師范學院 生命科學學院, 江蘇 淮安 223300; 2.淮安市食品組分與功能食品重點實驗室, 江蘇 淮安 223300; 3.江蘇省區(qū)域農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 淮安 223300;4.江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點實驗室, 江蘇 淮安 223300)

密孔菌固態(tài)發(fā)酵農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)漆酶活性的研究

李秀男1, 牛子琪1, 胡衛(wèi)成1,2,3, 王新風1,2,4

(1.淮陰師范學院 生命科學學院, 江蘇 淮安 223300; 2.淮安市食品組分與功能食品重點實驗室, 江蘇 淮安 223300; 3.江蘇省區(qū)域農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 淮安 223300;4.江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點實驗室, 江蘇 淮安 223300)

分別以玉米秸稈、小麥秸稈和楊樹木屑為原料,研究了一株密孔菌在發(fā)酵不同農(nóng)業(yè)廢棄物時漆酶的活性．結(jié)果表明,農(nóng)業(yè)廢棄物對密孔菌產(chǎn)漆酶具有良好的誘導效果,且以玉米秸稈的效果最佳,漆酶酶活可達40.92 U·mg-1．Cu2+的存在或濃度變化顯著影響密孔菌產(chǎn)酶,當添加0.02% Cu2+時,菌株在小麥秸稈和木屑培養(yǎng)基上產(chǎn)酶活分別達到41.24 U·mg-1和57.13 U·mg-1;當Cu2+濃度為0.04%時,菌株在玉米秸稈培養(yǎng)基上分泌漆酶酶活達到峰值94.92 U·mg-1．pH值對密孔菌產(chǎn)漆酶有明顯影響,在中酸性環(huán)境中菌株產(chǎn)漆酶酶活較高．菌株在小麥秸稈和玉米秸稈培養(yǎng)基上發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度較高,分別為35℃和40℃,且在整個發(fā)酵周期能維持較高較穩(wěn)定的酶活水平．因此,密孔菌有很好產(chǎn)漆酶和降解農(nóng)作物秸稈的能力,可用于農(nóng)作物秸稈處理．

密孔菌; 固態(tài)發(fā)酵; 農(nóng)業(yè)廢棄物; 漆酶

0 引言

漆酶是一類含銅多酚氧化酶,廣泛存在于高等植物和真菌體內(nèi)[1]．目前已知真菌類的擔子菌、子囊菌和半知菌大多都具有產(chǎn)漆酶能力,其中具有降解木質(zhì)素能力的白腐菌是主要的漆酶產(chǎn)生菌[2]．在過去的幾十年中,人們發(fā)現(xiàn)漆酶具有廣泛的底物特異性,可以氧化酚類、芳胺類、羧酸類、甾體激素與生物色素、金屬有機化合物和一些非酚類物質(zhì),且副產(chǎn)物只有水,被譽為“綠色酶”．漆酶不僅在生物制漿、生物漂白以及有毒化合物的降解等方面有重要的應用前景,而且在合成工業(yè)、生物檢測、染料降解等方面也具有潛在的應用前景[3-5]．它們的應用從紡織到紙漿和造紙工業(yè)[6-7],從食品[8]到有機合成[9]和制藥工業(yè)[10],從生物降解到環(huán)境保護和生態(tài)修復[11-13]等多個領域越來越廣泛,隨著人們對漆酶作用機理的深入了解,以及對白腐真菌這一降解木質(zhì)素明星微生物的研究,利用白腐真菌來處理農(nóng)業(yè)廢棄物的研究也就走進了研究者的視線．

目前,我國已成為世界上農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)出量最大的國家,其中農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量達7億噸(干質(zhì)量),畜禽糞便排放量30多億噸,鋸末、刨花等林業(yè)廢棄物16 000噸[14]．在我國各地政府部門的大力倡導下,作為主要農(nóng)業(yè)廢棄物的秸稈大多以直接還田的方式行處理,如江蘇省淮安市秸稈年產(chǎn)量達420萬噸,其中夏季所產(chǎn)的秸稈還田量可達95%．秸稈還田的過程也是微生物降解的過程,農(nóng)業(yè)廢棄物是一種富含木質(zhì)素資源(如稻草中含木質(zhì)素10%～15%,纖維素35%～40%和半纖維素25%～30%),也是一種天然的漆酶誘導劑[15]．本文將討論一株密孔菌(Pycnoporuscoccineus)在發(fā)酵不同農(nóng)業(yè)廢棄物時漆酶的活性變化情況,旨在為加強農(nóng)業(yè)廢棄物的綜合利用和對農(nóng)業(yè)面源污染的綜合治理尋找理論依據(jù)．

1 材料方法

1.1 菌種

緋紅密孔菌(Pycnoporuscoccineus),采自江蘇省溧陽市天目湖南山竹海翠谷莊園板栗林,本實驗室保存．

1.2 試劑和儀器

2,2-連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),美國Sigma 公司產(chǎn)品;考馬斯亮藍G250和牛血清蛋白,Amresco分裝;冰乙酸,無水乙酸鈉為市售分析純．

T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析)．

1.3 培養(yǎng)基

母種活化培養(yǎng)基: PDA固體培養(yǎng)基．

液體種子培養(yǎng)基: 土豆200 g,葡萄糖20 g,酵母膏5 g,自來水1000 mL．

固體發(fā)酵培養(yǎng)基: 楊樹木屑、玉米秸稈、小麥秸稈分別輕度粉碎,按每種基質(zhì)的總質(zhì)量加入2%蔗糖、1% Ca(OH)2、1% KH2PO4、0.5% MgSO4、0.5%酵母膏、2%石膏、10 mg·L-1VB,以最終培養(yǎng)基含水量為65%為標準加入適量自來水,反復搓揉均勻,用塑料薄膜蓋2 h．

銅離子濃度試驗培養(yǎng)基: 在固體發(fā)酵培養(yǎng)基基礎上加入CuSO4·5H2O,調(diào)整培養(yǎng)基中銅離子濃度分別為(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%),以未加CuSO4·5H2O的培養(yǎng)基為空白對照考察銅離子濃度對緋紅密孔菌產(chǎn)漆酶的影響．

pH試驗培養(yǎng)基: 根據(jù)試驗培養(yǎng)基計算所需自來水體積,將除石膏外的各試劑溶于定量自來水中,用檸檬酸和Na2CO3分別調(diào)節(jié)pH為3.0，5.0，7.0，9.0，11.0,加入石膏,均勻拌入固體基質(zhì)中．考察發(fā)酵料初始pH對緋紅密孔菌產(chǎn)漆酶的影響．

溫度試驗培養(yǎng)基: 在固體發(fā)酵培養(yǎng)基基礎上加入適量的CuSO4·5H2O,分別置于不同溫度下(20℃，25℃，30℃，35℃，40℃)培養(yǎng),考察培養(yǎng)溫度對緋紅密孔菌產(chǎn)漆酶的影響．

1.4 方法

1.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)

將活化后的母種,接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基,25℃,120 r·min-1恒溫振蕩,避光培養(yǎng)5 d后,得到液體菌種．配制固體培養(yǎng)基,按每罐10 g基質(zhì)(小麥秸稈、玉米秸稈或木屑)分裝于玻璃罐頭瓶中,每罐發(fā)酵料終體積約占1/3．將液體菌種接種于不同配方的固體培養(yǎng)基上,適宜溫度下恒溫避光培養(yǎng)．

1.4.2 粗酶液獲取

在無菌條件下, 隨機選擇生長狀態(tài)一致的菌絲體培養(yǎng)料1 g, 置于加入15 mL醋酸緩沖液(0.2 mol·L-1,pH 4.5)的100 mL三角瓶中,25℃,120 rpm的搖床中浸提2 h,4 000 r·min-1離心10 min后取上清液,即為粗酶液．

1.4.3 可溶性蛋白測定

采用考馬斯亮藍G250法[16]．蛋白濃度在20 ～80μg·mL-1之間,蛋白含量與吸光度值呈很好的線性關(guān)系,兩者間的回歸方程為:y=0.0062x+0.0081,相關(guān)系數(shù)r=0.9981．

1.4.4 酶活測定方法

漆酶活力的測定采用ABTS法[1],以2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)為底物,量取2 mL ABTS,將3.2 mL pH 4.5的醋酸緩沖液和0.8 mL稀釋好的粗酶液混合,使反應總體積為6 mL．測定反應前3 min內(nèi)420 nm 處每30 s吸光值的變化,酶活定義為粗酶液中每mg蛋白每分鐘引起吸光度增加0.1所需要的酶量，單位為U·mg-1．酶活計算公式:

其中，V酶為添加酶液體積(mL);n為蛋白含量(μg·mL-1).

2 結(jié)果

2.1 農(nóng)業(yè)廢棄物對密孔菌漆酶活性的影響

如表1所示,密孔菌在玉米秸稈培養(yǎng)基上產(chǎn)酶酶活最高,在培養(yǎng)的第11 d,漆酶酶活達到峰值40.92 U·mg-1．而菌株在小麥秸稈和木屑培養(yǎng)基上產(chǎn)酶酶活最大值相差不多,分別為12.33 U·mg-1和11.18 U·mg-1．這可能是由于廢棄物的種類或所取廢棄物的部位不同,而導致各發(fā)酵培養(yǎng)基中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量不同造成的結(jié)果[17]．

表1 農(nóng)業(yè)廢棄物對密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

2.2 Cu2+對密孔菌漆酶活性的影響

漆酶作為一種含銅的多酚氧化酶,屬于藍色多銅氧化酶[18]．它的活性位點主要由4個3種不同類型的銅離子組成,因此銅離子是漆酶分泌的一個重要影響因素[19]．本實驗通過改變產(chǎn)酶培養(yǎng)基中Cu2+濃度,研究其對漆酶產(chǎn)量的影響．結(jié)果如表2～表4所示．

表2 小麥秸稈培養(yǎng)基上Cu2+對密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

表3 玉米秸稈培養(yǎng)基上Cu2+對密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

表4 木屑培養(yǎng)基上Cu2+對密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

結(jié)果表明,在以不同農(nóng)業(yè)廢棄物為主料的培養(yǎng)基上,Cu2+對密孔菌產(chǎn)酶活性的影響也不相同．對于小麥秸稈,當Cu2+濃度為0.02%時,菌株產(chǎn)漆酶酶活最高,為41.24 U·mg-1．對于玉米秸稈,當Cu2+濃度為0.04%時,菌株分泌漆酶酶活達到峰值94.92 U·mg-1．在培養(yǎng)初期,添加Cu2+的培養(yǎng)基產(chǎn)酶酶活低于空白培養(yǎng)基,而隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,Cu2+對菌株分泌漆酶的促進作用逐漸表現(xiàn)出來;而木屑培養(yǎng)基中,Cu2+濃度為0.02%時,菌株產(chǎn)漆酶酶活最高,達到57.13 U·mg-1．并且在整個培養(yǎng)過程中,添加0.02%和0.03%濃度Cu2+的培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶酶活均高于空白培養(yǎng)基,Cu2+對菌株產(chǎn)漆酶的促進作用十分顯著．過高或過低濃度的銅離子都不利于漆酶的分泌．

2.3 發(fā)酵料初始pH對密孔菌漆酶活性的影響

研究表明,漆酶合成與活力表達受環(huán)境pH影響顯著[20-21]．本實驗調(diào)整3種發(fā)酵料不同初始pH值,考察其對密孔菌產(chǎn)酶活性的影響．實驗結(jié)果如表5～表7所示．

表5 小麥秸稈培養(yǎng)基上發(fā)酵料初始pH對密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

表6 玉米秸稈培養(yǎng)基上發(fā)酵料初始pH對密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

表7 木屑培養(yǎng)基上發(fā)酵料初始pH對密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

結(jié)果顯示,菌株在中酸性條件下分泌漆酶酶活較高,而在堿性環(huán)境中產(chǎn)酶酶活極低甚至檢測不出．此外,菌株在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)酶所需最適pH也存在差異．對于小麥秸稈和玉米秸稈培養(yǎng)基,菌株在偏中性環(huán)境中產(chǎn)酶酶活較高,分別在初始pH為7和5時達到酶活峰值45.79 U·mg-1和59.77 U·mg-1;而在木屑培養(yǎng)基中,菌株更適宜在偏酸性環(huán)境中生長,在初始pH值為3時酶活最高,為86.14 U·mg-1,且出現(xiàn)的時間晚于小麥秸稈和玉米秸稈．有研究表明,真菌在中偏酸性環(huán)境下酶活較高,這與本實驗研究結(jié)果基本一致[22]．尹艷麗等[23]認為偏酸性條件,一方面會促進白腐菌生長,另一方面,由于漆酶的最適作用pH為酸性,因而能使白腐菌分泌的漆酶保持較高活性．

2.4 培養(yǎng)溫度對密孔菌漆酶活性的影響

微生物的生命活動都是由一系列的生化反應組成的,這些反應受溫度影響極其明顯,所以溫度是影響微生物生長繁殖的重要因素之一[24]．本實驗設置不同的培養(yǎng)溫度,考察其對密孔菌產(chǎn)酶活性的影響．實驗結(jié)果如表8～表10所示．

表8 小麥秸稈培養(yǎng)基上培養(yǎng)溫度對密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

表9 玉米秸稈培養(yǎng)基上培養(yǎng)溫度對密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

表10 木屑培養(yǎng)基上培養(yǎng)溫度對密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

結(jié)果顯示,培養(yǎng)溫度對密孔菌產(chǎn)酶酶活具有較大的影響．菌株在以不同農(nóng)業(yè)廢棄物為主料的培養(yǎng)基上所需的最適溫度也不同．在小麥秸稈培養(yǎng)基上,當培養(yǎng)溫度為35℃時,在培養(yǎng)的第4 d,酶活達到最大值65.07 U·mg-1．但隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,酶活下降非常迅速．而當培養(yǎng)溫度為40℃時,在整個培養(yǎng)周期內(nèi),酶活均能穩(wěn)定維持在20 U·mg-1上下．在玉米秸稈培養(yǎng)基上,當培養(yǎng)溫度為40℃時,在培養(yǎng)的第12 d,菌株產(chǎn)酶酶活達到峰值34.80 U·mg-1,整個培養(yǎng)周期內(nèi),菌株都能維持較高的酶活．實驗中我們還發(fā)現(xiàn),40℃高溫條件下,菌絲體生長狀況欠佳,因此我們認為密孔菌產(chǎn)的漆酶在較高的溫度下活性會增強．在木屑培養(yǎng)基上,當培養(yǎng)溫度為25℃時,菌絲生長至12～14 d,酶活達到16～17 U·mg-1,且在此溫度下,菌絲生長茂密．在高于25℃溫度條件下,反應體系中的酶活最大值均出現(xiàn)提早,并且最大酶活較低．這可能因為木屑培養(yǎng)料透氣性和保水性都較差,較高溫度會導致濕度下降,不利于其發(fā)酵．相比于小麥秸稈和玉米秸稈培養(yǎng)基,木屑酶活最大值出現(xiàn)的時間較晚,這可能與木屑培養(yǎng)基營養(yǎng)成分與前兩者不同,菌株在其上生長較慢有關(guān)．并且在40℃培養(yǎng)條件下,菌株在木屑培養(yǎng)基上產(chǎn)酶酶活低于小麥和玉米秸稈培養(yǎng)基,這可能與木屑保水性較差有關(guān)．

3 討論

農(nóng)作物秸稈等廢棄物對密孔菌產(chǎn)漆酶具有良好的誘導效果,主要是因為半纖維素和木質(zhì)素結(jié)構(gòu)是白腐真菌的主要降解部位[25-26],密孔菌在以玉米秸稈為主料的培養(yǎng)基上產(chǎn)漆酶酶活高于以小麥秸稈和楊樹木屑為主料的培養(yǎng)基,可達40.92 U·mg-1．這是因為玉米秸稈、小麥秸稈以及楊樹木屑三者的組成成分、含量以及物理結(jié)構(gòu)不同,玉米、小麥秸稈和楊樹木屑中木質(zhì)素的含量分別為14.93%，20.51%和35%[27-28]．隨著發(fā)酵周期的延長,漆酶活性逐漸下降,主要是因為菌絲生長活力下降和秸稈中的木質(zhì)素只能部分被降解的緣故[29]．

Cu2+的存在或濃度變化顯著影響密孔菌產(chǎn)漆酶的酶活．多數(shù)漆酶是含銅的蛋白,而漆酶基因轉(zhuǎn)錄合成時需要銅離子的調(diào)節(jié),因此在限銅或缺銅時,漆酶蛋白表達受限,所以活力較低[30]．發(fā)酵料中的Cu2+濃度對密孔菌的漆酶活性的影響,隨著秸稈種類的不同而存在差異,具體的調(diào)節(jié)機理則需進一步的研究．

pH值對密孔菌產(chǎn)漆酶有明顯影響,在中酸性環(huán)境中菌株產(chǎn)漆酶酶活較高．一般認為培養(yǎng)基中的氫離子和氫氧根離子對微生物的影響是間接的,首先作用于胞外可解離的弱酸或弱堿,形成易透過細胞膜的游離態(tài)進入胞內(nèi),再作用于參與代謝的各種酶類,從而影響菌體的生長和酶的合成[31]．

菌株在小麥秸稈和玉米秸稈培養(yǎng)基上發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度較高,分別為35℃和40℃,且在整個發(fā)酵周期能維持較高較穩(wěn)定的酶活水平．運用本實驗菌株進行這兩類農(nóng)業(yè)廢棄物降解時,在保持較高濕度的同時,應適當增加堆料厚度,提高料內(nèi)溫度．

對于不同的農(nóng)業(yè)廢棄物,菌株產(chǎn)酶的最適銅離子濃度、最適pH和最適培養(yǎng)溫度也是不同的,因此我們要因材制宜．密孔菌能利用農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵產(chǎn)漆酶,可以作為外源菌劑縮短秸稈還田周期,在農(nóng)業(yè)廢棄物資源利用方面具有廣闊的應用前景．此外,產(chǎn)生的漆酶具有降解DDT等多種污染物的能力,還可以起到環(huán)境保護和生態(tài)修復的作用．

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[責任編輯：蔣海龍]

Research on Laccase Production by Pycnoporus in Solid-Stage Fermentation using Agricultural Residues

LI Xiu-nan1, NIU Zi-qi1, HU Wei-cheng1,2,3, WANG Xin-feng1,2,4

(1.College of Life Sciences, Huaiyin Normal University, Huaian Jiangsu 223300, China) (2.Huaian Key Laboratory of Food Components and Functional Foods, Huaian Jiangsu 223300, China) (3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Regional Modern Agriculture & Environmental protection, Huaian Jiangsu 223300, China) (4.Jiangsu Key Laboratory for Biomass-based Energy and Enzyme Technology, Huaian Jiangsu 223300, China)

The aim of this study is to investigate laccase production by Pycnoporus in solid-stage fermentation using different agricultural residues, such as corn stalk, wheat straw and poplar sawdust. The results reveled that agricultural residues can induce Pycnoporus to produce laccase and corn stalk showed the highest effect with production of 40.92 Umg-1. Moreover, the concentration of Cu2+has a significant effect on laccase production and the production could reach 41.24Umg protein-1 and 57.13Umg-1using wheat straw and poplar sawdust as medium with 0.02% Cu2+; the production of laccase could reach 94.92 U·mg-1using corn stalk as medium with 0.04% Cu2+. Lassase production was affected by pH obviously and the activity of laccase was higher in neutral and acid environment. The optimum temperature for Pycnoporus to produce laccase in wheat straw medium and corn stalk medium was 35°C and 40°C, respectively. Moreover, laccase activity could maintain a high and stable level during the whole fermentation period. The results from this study indicate that Pycnoporus has a high efficacy in producing laccase and degrading crop straw, which can be used in the treatment of crop straw.

pycnoporus; solid state fermentation; agricultural wastes; laccase

2017-03-28

江蘇省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510323013Z); 江蘇高校品牌專業(yè)建設工程資助項目(PPZY2015A018); 江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新基金項目(CX(13)3026)

王新風(1964-),男，江蘇漣水人，教授，主要從事微生物及食用菌等研究. E-mail: wangxf@hytc.edu.cn

S147.4

A

1671-6876(2017)02-0147-07