正交試驗優(yōu)化提取壯藥馬尾千金草生物堿

許丹妮 楊海玲 許元明 蘇秀芳 鄭廣進

摘要[目的]優(yōu)化馬尾千金草生物堿的提取條件。[方法]以馬尾千金草的總生物堿含量為指標，運用正交試驗設(shè)計對酸水濃度、料液比、浸提次數(shù)3個因素進行考查，優(yōu)化最佳提取工藝。[結(jié)果]酸水浸泡提取的最佳條件為加入10倍的1%酸水液，浸泡提取3次，每次24 h，生物堿得率為0.0751%，馬尾千金草生物堿含量為7.51 mg/g。[結(jié)論]該提取方法操作較簡單、成本低、生物堿得率高，能有效提取馬尾千金草總生物堿。

關(guān)鍵詞馬尾千金草；總生物堿；正交試驗；優(yōu)化提取

中圖分類號S567.23文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）14-0115-02

Abstract[Objective] The research aimed to optimize the extraction condition of alkaloids from Lyeopodium sieboldii.[Method]Taking the total alkaloid content of Lyeopodium sieboldii as index，the orthogonal experiment was used to evaluate acid water concentration，solidliquid ratio and extraction times.The optimum extraction process was optimized.[Result]The optimum condition of the acid water extraction was 1% acid water solution with 10 times，soaking and extracting for 3 times，each time 24 h，the total alkaloids was 0.0751%，the alkaloid content of Lyeopodium sieboldii was 7.51 mg/g.[Conclusion]The extraction method is simple，low operation cost，high rate of alkaloids，which can effectively extract the total alkaloids of Lyeopodium sieboldii.

Key wordsLyeopodium sieboldii Miq；Total alkaloids；Orthogonal experiment；Optimal extraction

馬尾千金草（Lyeopodium sieboldii Miq），別名馬尾伸筋草、馬尾青青草、飛龍，為石松科植物馬尾杉屬植物鱗葉馬尾杉的全草，多年生常綠草本，外形狀如馬尾，價格昂貴，故有馬尾千金草之稱。味平，性淡；舒筋活絡、祛風濕，主治跌打損傷、肌肉痙攣、筋骨疼痛[1]，分布于臺灣、廣西，日本也有分布[2]。廣西崇左大新縣、天等縣及相鄰的白色靖西縣、德?？h均有分布，當?shù)貕衙癯Ｓ闷渲委煹蚺?、風濕關(guān)節(jié)痛、肥大性脊椎炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎。20世紀80年代中期，有學者從民間草藥千層塔中分離得到了具有很強地抑制乙酰膽堿酯酶活性[3-4]和提高學習記憶功能[5]的石杉堿甲。陳業(yè)高等[6]從同類石杉科蛇足石杉中分離得到具有強效、低毒、高選擇性抑制乙酰膽堿酯酶活性的生物堿石杉堿甲，臨床試驗研究表明其對治療重癥肌無力和抗老年性癡呆有顯著療效，被國際上列為第二代乙酰膽堿酯酶抑制劑之一。現(xiàn)代藥理試驗表明，石松生物堿在對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)肌肉以及精神分裂癥、發(fā)熱和青光眼等治療方面具有一定的作用[7-8]，因此研究石松科植物生物堿具有一定的臨床意義。

石松生物堿可采用多種方法進行提取，如酸水提取、醇提法、超聲波提取法等[9]。但酸水提取法以外的方法，大多操作方法比較煩瑣，如醇提法提取需加熱，生物堿結(jié)構(gòu)可能會因為溫度問題而遭到破壞，致使提取產(chǎn)物不純，且試驗需要用到大量的乙醇，成本高，產(chǎn)率不高，不適合大規(guī)模制備。因此該試驗采用酸水浸提法與陽離子交換樹脂法相結(jié)合的方法提取總生物堿。在該試驗的前期工作中以氧化鋁薄層層析法檢測該植物含有生物堿，并采用單因素試驗考察了酸水濃度、料液比、浸提次數(shù)對總生物堿得率的影響，在此以苦參堿為標準品，采用酸性染料比色法測生物堿得率，并采用正交試驗，優(yōu)化馬尾千金草酸水法提取生物堿的工藝，為后續(xù)進一步研究奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1儀器UV-3010型紫外可見分光光度計，CT -C-2型電熱恒溫干燥箱，SHZ-D-3 型循環(huán)水式真空泵，XLF-30B型超微粉碎機，層析柱，001×7型陽離子交換樹脂。

1.2試材馬尾千金草，采購于廣西崇左市大新縣，超微粉碎，過200目篩備用。

1.3方法

1.3.1標準品溶液的制備。準確稱取25.00 mg苦參堿標準品，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋、搖勻，配制成0.5 mg/mL標準液。分別移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL母液于50 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋，配制成梯度濃度的標準液。

1.3.2樣品溶液的制備。將馬尾千金草超微粉碎后，分別用濃度為0.1%、0.5%、1.0%的鹽酸溶液浸泡[10]，以不同的料液比，每次浸泡24 h。過濾，經(jīng)陽離子交換樹脂，用150 mL8%氨水乙醇洗脫樹脂[11]，將洗脫液萃取后低溫蒸干，用甲醇溶解，定容至250 mL，得樣品溶液。

1.3.3波長檢測。分別移取少量不同濃度的標準品溶液和樣品溶液，利用紫外分光光度計，在波長300～500 nm處進行掃描，得到紫外吸收數(shù)據(jù)，確定標準溶液在波長423 nm處的吸光度最大，樣品液在423 nm處吸收值最大。則選取測定波長為423 nm。

1.3.4標準曲線的繪制。分別移取梯度濃度的標準液 1 mL置于分液漏斗中，添加溴麝香草酚藍溶液1 mL、pH為6.5的緩沖液，再移入三氯甲烷溶液10 mL，振蕩搖勻，靜置后，取下層，在波長423 nm處測定不同濃度標準溶液的吸光度，以三氯甲烷溶液為空白液。以標準液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.5樣品溶液中生物堿含量的測定。按照“1.3.4”方法測定不同濃度樣品溶液的吸光度。根據(jù)苦參堿線性回歸方程計算得樣品液中生物總堿的含量。

1.3.6生物堿得率的計算。將測得的樣品溶液吸光度（A）代入標準品的線性回歸方程，得樣品溶液濃度C（mg/mL）。提取物中生物堿質(zhì)量（m）=C×V，生物堿得率=m/M×100%，其中M為粗草的質(zhì)量。

1.3.7正交試驗設(shè)計。分別選取酸水濃度、料液比、浸泡次數(shù)3個因素進行正交試驗設(shè)計。精確稱取馬尾千金草粉末10.00 g（9份），按照正交試驗因素表（表1）進行試驗，得生物總堿，再通過酸性染料比色法測定樣品中總生物堿含量[12]，最后計算得率。

2結(jié)果與分析

2.1苦參堿標準曲線繪制按照“1.3.4”操作，以標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線（圖1），得出苦參堿的線性回歸方程為y=175.25x+0.166 3（R2=0.999 2），表明苦參堿含量在0.001～0.006 mg/mL線性關(guān)系良好。

圖1苦參堿標準曲線

Fig.1Standard curve of matrine2.2正交試驗由表2可知，各因素對酸水提取法的影響從大到小依次為A、B、C，即酸水濃度的影響最大，其次是料液比，浸提次數(shù)的影響最??；酸水提取法的最佳提取工藝是A3B1C1，即鹽酸溶液濃度為1.0%、料液比1∶10，浸提次數(shù)1次。綜合考慮預試驗中單因素試驗和正交試驗結(jié)果，最終確定酸水提取法的最佳提取條件為A3B1C3，即鹽酸溶液濃度為1.0%，料液比1∶10，浸提3次，每次24 h，生物堿得率為0.075 1%，馬尾千金草中生物堿含量為7.51 mg/g。

3討論與小結(jié)

馬尾千金草為石松科植物，預試驗以氧化鋁薄層層析法[13]檢測生物堿，結(jié)果出現(xiàn)橘紅色斑點，證明馬尾千金草提取液中存在生物堿。單因素試驗結(jié)果生物堿得率幾乎隨著酸水濃度的增大而增大，但當濃度超過1%時，生物堿得率基本沒有太大的變化；在料液比增大的同時，得率逐漸增大，但在料液比超過1∶15后，得率無顯著變化；生物堿得率隨浸提次數(shù)的增加而增大，當浸提次數(shù)超過3次，得率基本不變。綜合考慮單因素預試驗結(jié)果與正交試驗結(jié)果，確定提取壯藥馬尾千金草生物堿的最佳提取條件為料液比1∶10，浸提3次，每次24 h。該方法操作簡便、成本低、可行，可作為壯藥馬尾千金草生物堿提取方法的參考，為進一步做其藥理研究奠定基礎(chǔ)。

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