黎金燕　王春暉　黃俊文

摘要：將不同濃度DPI添加到尾葉桉（Eucalyptus urophylla）愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分析DPI對其愈傷組織誘導(dǎo)和SOD、POD、CAT、APX 4種抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，高于1.5 μmol/L的DPI顯著抑制尾葉桉愈傷組織的誘導(dǎo)，0～0.25 μmol/L的DPI能減輕褐化，0.1 μmol/L DPI抗褐化效果最好，褐化率僅9.82%。0～0.25 μmol/L的DPI處理后，尾葉桉APX活性隨DPI濃度升高而升高，SOD、POD、CAT活性隨DPI濃度升高呈先升高后降低的趨勢。添加0.10 μmol/L DPI可提高保護(hù)酶活性，減輕褐化，促進(jìn)尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：尾葉桉（Eucalyptus urophylla）；DPI；愈傷組織誘導(dǎo)；抗氧化酶

中圖分類號：S792.39 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）11-2153-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.040

Abstract： The callus of Eucalyptus urophylla was induced by adding different concentrations of diphenyleneiodonium（DPI） to the callus induction medium. And SOD，POD，CAT and APX activities of the callus were measured. The concentration of DPI higher than 1.5 μmol/L significantly inhibited callus induction. 0～0.25 μmol/L DPI can reduce browning，of which 0.1 μmol/L concentration can get the best anti-browning effect，browning rate only 9.82%. In the DPI treatment of 0～0.25 μmol/L，the activity of APX increased，while the activities of SOD，POD and CAT increased first and then decreased with the increase of DPI concentration. The results showed that addition of 0.10 μmol/L DPI could promote the callus of Eucalyptus urophylla induction by increasing the protective enzyme activity and reducing the browning.

Key words： Eucalyptus urophylla；DPI；callus induction；antioxidase

尾葉桉（Eucalyptus urophylla）為桃金娘科（Myraceae）桉屬（Eucalyptus）植物，原產(chǎn)于印尼，中國1976年開始引種[1]。尾葉桉U6無性系具有抗病、抗風(fēng)、速生、易繁殖、萌芽力強(qiáng)、綜合性能好、實用性強(qiáng)等優(yōu)點，深受各地林農(nóng)的喜愛，已成為營造桉樹速生豐產(chǎn)造林的主要樹種之一[2]。桉樹是世界上主要產(chǎn)材樹種之一，其人工造林占世界人工造林的五分之一，桉樹組織培養(yǎng)是林木組織培養(yǎng)研究最早、最多的一大類，目前全世界已對60種桉樹進(jìn)行了組織培養(yǎng)技術(shù)的研究[3]。

二苯基氯化碘鹽（Diphenyleneiodonium chloride，DPI）是植物NADPH氧化酶的專一性抑制劑。ROS主要發(fā)生于質(zhì)膜上的氧化還原系統(tǒng)，質(zhì)膜NADPH氧化酶是此系統(tǒng)產(chǎn)生活性氧的主要功能蛋白質(zhì)[4，5]。DPI能夠通過結(jié)合到NADPH氧化酶的兩個氧化還原元件上抑制其活性[6]。ROS的過度積累會引起植物細(xì)胞膜系統(tǒng)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的氧化損傷，而生物膜的完整性和滲透性是外植體褐化的重要因素之一[7]。研究表明，DPI能影響植物根的伸長、氣孔開閉等[6，8]。本研究通過向尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同濃度的DPI，探究DPI對尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)及其對抗氧化酶活性的影響，以期為桉樹組織培養(yǎng)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

尾葉桉種子由國家林業(yè)局桉樹中心提供。

1.2 方法

1.2.1 尾葉桉無菌苗的培養(yǎng) 將尾葉桉種子在1%Triton X-100溶液中浸泡1 h后用無菌水漂洗1次，再用70%的乙醇表面消毒45 s，用無菌水漂洗2次，清除殘留乙醇。再用20%的次氯酸鈉溶液消毒7 min，期間輕輕搖動三角瓶以提高滅菌效果。用無菌水漂洗4次后，再用20%的次氯酸鈉溶液浸泡7 min，用無菌水漂洗6～8次后，將種子播種于播種培養(yǎng)基（1/2MS+蔗糖20 g/L+瓊脂7.5 g/L，pH 5.8～6.0），置于25 ℃暗處萌發(fā)。

1.2.2 尾葉桉愈傷組織的誘導(dǎo) 將高3～5 cm、僅含1對子葉、苗齡為8 d的無菌苗取出，置于16 h光/8 h暗光周期、光照度為50 μmol/m·s、溫度（25±2） ℃的人工氣候箱中光處理2 d后，切取8 mm長的下胚軸切段為外植體，接種于添加了不同梯度濃度DPI的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（1/2MS+10 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂+100 mg/L 維生素C+0.57 μmol/L 6-BA+0.57 μmol/L IAA+3.99 μmol/L PBU，pH 5.8～6.0），置于（25±2） ℃暗處培養(yǎng)2周，然后轉(zhuǎn)移至16 h光/8 h暗光周期、光照度50 μmol/m·s、溫度（25±2） ℃的人工氣候箱繼續(xù)培養(yǎng)6周。

1.2.3 愈傷生長情況統(tǒng)計 每個試驗處理均設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)接種3個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿接種約10個外植體。外植體愈傷組織以切口基部能觀察到球狀突起，即生長出直徑大于2 mm的愈傷組織計數(shù)，愈傷組織誘導(dǎo)率為誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)占接種外植體數(shù)的百分比[9]。褐化外植體以通體為褐色或黑色，即肉眼不可見明顯白色、黃色、綠色組織塊的外植體計數(shù)，外植體褐化率為褐化外植體數(shù)占接種外植體數(shù)的百分比。

誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)出的愈傷組織塊數(shù)/總外植體數(shù)）×100%

褐化率=（褐色外植體數(shù)/總外植體數(shù)）×100%

1.2.4 抗氧化酶酶活性測定方法

1）酶液的制備：取梯度濃度的綠色愈傷組織 0.5 g于預(yù)冷的小研缽中，加入20 mg PVP和6 mL預(yù)冷的0.1 mol/L pH 6.9磷酸緩沖液（PBS）冰浴勻漿，4 ℃，8 000 r/min離心10 min，所得上清即為待測酶液。

2）考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量，用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算酶液的蛋白質(zhì)濃度。

3）四氮唑藍(lán)（NBT）光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性：參考鄒琦[10]的方法測定。3 mL反應(yīng)混合液含0.05 mL酶液、13 mmol/L Met、75 μmol/L NBT、10 μmol/L EDTA-Na2、2 μmol/L核黃素、5 mmol/L PBS（pH 7.8）、0.25 mL去離子水，在4 000 lx光照下反應(yīng)20 min。以不照光為空白對照，對照管以PBS代替酶液。在560 nm下測定試驗組的吸光度，SOD活性單位是以抑制NBT光化還原的50%作為1個酶活性單位。

4）愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性：參考張志良等[11]的方法，略有改進(jìn)。100 mmol/L PBS（pH 6.0）100 mL，加入愈創(chuàng)木酚56 μL，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30%過氧化氫38 μL配制成反應(yīng)混合液，混合均勻后裝到棕色瓶中4 ℃保存。對照組加入反應(yīng)混合液3 mL和1 mL PBS作為校零對照，試驗組加入反應(yīng)混合液3 mL、20 μL酶液、980 μL PBS。立即于470 nm波長下測定，每隔1 min讀數(shù)1次，共測4 min，以每分鐘A470 nm變化0.01為1個活力單位（U），計算出POD活性。

5）抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性：參考鄒琦[10]的方法測定，略有改進(jìn)。3 mL反應(yīng)混合液中含50 mmol/L PBS（pH 7.0）、0.1 mmol/L EDTA-Na2、0.3 mmol/L ASA、0.2 mmol/L H2O2和酶液0.1 mL。加入H2O2后立即在20 ℃下3 min內(nèi)每30 s測定1次A290 nm值變化，計算單位時間ASA減少量得到APX活性。

6）紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性：參考Aebi[12]的方法測定，略有改進(jìn)。3 mL的反應(yīng)體系為1.5 mL 100 mmol/L PBS，1.18 mL去離子水，試驗組加20 μL預(yù)熱的酶液，對照加20 μL煮沸的酶液，再加0.3 mL 150 mmol/L H2O2。加入H2O2后立即在240 nm下測定其吸光度，每隔1 min讀數(shù)1次，共測4 min，以每分鐘內(nèi)A240 nm變化0.01作為1個酶活單位（U），計算CAT活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度DPI處理對尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

由表1可知，以沒有添加DPI處理為對照組，對照組的愈傷組織誘導(dǎo)率為98.14%。低濃度DPI處理（0.50、1.00 μmol/L）尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)率與對照沒有顯著差異，愈傷組織細(xì)胞分裂旺盛，膨大良好；當(dāng)DPI處理濃度超過1.50 μmol/L時，DPI對尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)表現(xiàn)出明顯的抑制作用，愈傷組織誘導(dǎo)率84.41%，愈傷組織細(xì)胞分裂正常，膨大體積相對較?。划?dāng)DPI處理濃度超過2.50 μmol/L時，DPI對尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，愈傷組織誘導(dǎo)率9.34%，外植體不膨大或僅兩端略微膨大，體積很小。

2.2 不同濃度DPI對尾葉桉愈傷褐化率的影響

由表2可知，一定濃度的DPI處理能減輕尾葉桉愈傷組織在培養(yǎng)過程中的褐化程度，在0.10 μmol/L DPI處理時，對抑制尾葉桉愈傷組織褐化的效果最好，可以觀察到誘導(dǎo)出的綠色尾葉桉愈傷組織比例較高，呈淺綠色至翠綠色，愈傷組織塊表面有多個可見顆粒，顆粒內(nèi)可見明顯芽點。

2.3 不同濃度DPI對尾葉桉愈傷抗氧化酶活性的影響

由表3可知，一定濃度的DPI可以提高尾葉桉愈傷組織的抗氧化酶活性。添加終濃度為0.05～0.25 μmol/L的DPI處理尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基時，抗壞血酸過氧化物酶（APX）隨著DPI處理濃度的升高而升高。超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）均表現(xiàn)出隨著DPI處理濃度的升高，酶活性先升高后下降，活性最高點分別位于0.05、0.15和0.10 μmol/L。而這3個DPI處理濃度對應(yīng)的褐化率分別為11.84%、9.82%、10.88%，褐化率較低。由此可以推斷，DPI對尾葉桉愈傷組織的抗褐化作用與提高抗氧化酶活性有關(guān)。

3 小結(jié)與討論

活性氧ROS包括超氧化物、H2O2、單線態(tài)氧和羥自由基等。外植體在切傷刺激和離體培養(yǎng)條件的脅迫下，ROS過度積累。ROS以其極強(qiáng)的氧化性造成細(xì)胞膜脂過氧化反應(yīng)，損傷膜系統(tǒng)，導(dǎo)致外植體褐化。DPI是NADPH氧化酶的特異性抑制劑，能通過抑制NADPH氧化酶的活性進(jìn)而抑制ROS的形成。

植物的抗氧化系統(tǒng)由抗氧化酶類和抗氧化物質(zhì)即抗氧化劑類組成?？寡趸割惏ǔ趸镝福⊿OD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化物酶（POD）以及抗壞血酸（AsA）-谷胱甘肽（GsH）循環(huán)酶類等[13]。植物的抗氧化酶防御系統(tǒng)和抗氧化劑防御系統(tǒng)通過協(xié)同作用清除ROS進(jìn)而調(diào)控過度的氧化級聯(lián)反應(yīng)和保護(hù)植物細(xì)胞[14]。

通過測定尾葉桉愈傷組織SOD、POD、CAT、APX 4種抗氧化酶活性，發(fā)現(xiàn)一定濃度的DPI對尾葉桉愈傷組織這4種抗氧化酶活性均具有顯著提高的作用。SOD、CAT、POD是抗氧化酶系統(tǒng)中控制植物體內(nèi)活性氧積累的最主要酶，SOD能清除細(xì)胞中多余的超氧陰離子，CAT和POD可以使H2O2歧化成無毒害的水和氧分子[15]，而APX是葉綠體專一清除H2O2的關(guān)鍵酶[13]?？寡趸富钚缘奶岣哂欣跍p緩愈傷組織活性氧對細(xì)胞的氧化損害，減緩其細(xì)胞膜質(zhì)過氧化并抑制褐化[16]。但也有研究表明，POD催化H2O2氧化酚類物質(zhì)，在植物愈傷組織褐化過程中起重要作用[17]。這說明POD對愈傷組織的作用具有兩重性，抗氧化酶對愈傷組織的作用及機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

抗褐化劑在一定的適用濃度范圍起作用，超過這個適用濃度范圍通常會引起負(fù)效應(yīng)的發(fā)生[18]。ROS影響著植物許多基因的表達(dá)，包括控制生長、細(xì)胞周期、細(xì)胞程序性死亡、非生物脅迫反應(yīng)、病原體防御、全身信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和發(fā)育等[14]。NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS可以激活Ca2+通道使細(xì)胞外的Ca2+向細(xì)胞內(nèi)流動，從而保證細(xì)胞生長所必須的Ca2+，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物細(xì)胞生長[8]。ROS對于植物體重要的生物學(xué)意義已經(jīng)引起科學(xué)家的廣泛關(guān)注。本試驗發(fā)現(xiàn)在尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加高濃度的DPI時，對外植體產(chǎn)生極大的毒害作用，愈傷組織誘導(dǎo)率顯著降低。原因可能是添加高濃度的DPI過度抑制了NADPH氧化酶活性，減少ROS生成的同時，又提高具有ROS清除能力的抗氧化酶活性，導(dǎo)致外植體體內(nèi)ROS不足，進(jìn)而影響外植體細(xì)胞的生長與增殖。

就保持細(xì)胞膜系統(tǒng)完整性而言，在組培過程中多余的ROS對細(xì)胞膜的氧化損傷是有害的，DPI是質(zhì)膜NADPH氧化酶的特異抑制劑，能抑制ROS的產(chǎn)生，而本試驗也發(fā)現(xiàn)DPI能增強(qiáng)尾葉桉愈傷組織抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX的活性，增強(qiáng)ROS的清除能力，雖然目前尚未明確DPI對這4種抗氧化酶活性的作用機(jī)制，但使用DPI通過控制尾葉桉愈傷組織ROS的積累量，減輕細(xì)胞膜損傷并進(jìn)一步減輕褐化是可行的。綜合尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)率、褐化率、抗氧化酶活性的統(tǒng)計分析結(jié)果及具體生長情況，0.10 μmol/L DPI處理對尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)、抗褐化效果最好。本研究為提高木本植物的愈傷組織誘導(dǎo)效率提供了新的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉 瑩，徐剛標(biāo).尾葉桉叢生芽和生根的誘導(dǎo)[J].河南林業(yè)科技，2009，29（2）：3-5.

[2] 宛淑艷，陳文淵，何曉玲.尾葉桉莖段再生系統(tǒng)的建立[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（5）：937-942.

[3] 馬生健，潘清梅，吳志華，等.尾葉桉的組織培養(yǎng)與植株再生[J].桉樹科技，2006，23（1）：11-16.

[4] 丁坤峰，譚曉榮.植物NADPH氧化酶研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2010，22（8）：723-728.

[5] 劉懷攀，胡炳義，劉天學(xué)，等.亞精胺對滲透脅迫的玉米幼苗葉片NADPH氧化酶和抗氧化酶活性的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，41（4）：363-367.

[6] 張歡玲，劉淑春，蘇小雨，等.外源SA和DPI對灌漿期高溫強(qiáng)光下小麥葉片氣孔開閉的影響[J].作物雜志，2014（3）：67-71.

[7] 姚洪軍，羅曉芳，田硯亭.植物組織培養(yǎng)外植體褐變的研究進(jìn)展[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，21（3）：78-84.

[8] JULIA F，VADIM D，JOHN H F B，et al. Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth[J].Nature，2003，422：442-446.

[9] 歐陽樂軍，黃真池，沙月娥，等.新型分裂素PBU對尾葉桉胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的影響[J].植物生理學(xué)報，2011，47（8）：785-791.

[10] 鄒 琦.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[11] 張志良，瞿偉菁.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].第三版.北京：高等教育出版社，1980.

[12] AEBI H. Catalase in vito[J].Methods Enzymology，1984，105：121-126.

[13] 胡國霞，馬蓮菊，陳 強(qiáng)，等.植物抗氧化系統(tǒng)對水分脅迫及復(fù)水響應(yīng)研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（3）：1278-1280， 1282.

[14] SARVAJEET S G，NARENDRA T. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants[J].Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（12）：909-930.

[15] 李 璇，岳 紅，王 升，等.影響植物抗氧化酶活性的因素及其研究熱點和現(xiàn)狀[J].中國中藥雜志，2013，38（7）：973-978.

[16] 蘇 江，岑忠用，奉艷蘭，等.抗壞血酸對巖黃連愈傷組織褐化及抗氧化酶活性的影響[J].北方園藝，2015（20）：138-142.

[17] 鄭 超，徐 晟，夏 冰，等.三種抗氧化劑對曼地亞紅豆杉愈傷組織褐化及相關(guān)物質(zhì)含量的影響[J].植物生理學(xué)報，2013， 49（3）：259-263.

[18] 戴 瑩，楊世海，趙鴻崢，等.藥用植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象的研究進(jìn)展[J].中草藥，2016，47（2）：344-351.