彭繼慶++徐志高++曹福祥++董旭杰++張鵬鴻

摘要：以繡球、圓錐繡球2個種38個品種為材料，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)及PopGen32軟件對其遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，100條引物中篩選出10條引物用于PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出條帶132個，其中多態(tài)性條帶122個，占 92.42%，繡球、圓錐繡球2個種的多態(tài)條帶比例分別為79.55%、67.42%；38個繡球花品種觀測等位基因數(shù)為 1.924 2，有效等位基因數(shù)為1.676 8，Neis基因多樣性指數(shù)為0.378 2，Shannons信息指數(shù)為0.549 7，具有較高的遺傳多樣性和較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力；繡球、圓錐繡球2個種的基因多樣性為0.375 8，種內(nèi)基因多樣性為0.282 6，種內(nèi)遺傳變異占75.20%；38個繡球花品種間的遺傳一致度變化范圍為0.454 5～0.977 3，存在很大差異，繡球、圓錐繡球的遺傳一致度為0.749 1，遺傳距離為0.288 9，兩者之間親緣關(guān)系較近；UPGMA聚類分析將38個品種分成2類4個亞類，聚類結(jié)果與葉片、花的特征基本分類結(jié)果一致，可完全區(qū)分繡球與圓錐繡球2個種。

關(guān)鍵詞：繡球；圓錐繡球；ISSR；遺傳多樣性

中圖分類號： S685.990.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0018-04

繡球花別稱八仙花，是繡球花科繡球?qū)伲℉ydrangea）植物的總稱，為常綠或落葉亞灌木、灌木或小喬木，主要分布于亞洲東部至東南部、北美洲東南部至中美洲和南美洲西部，全球有60余種，我國約有37個種、7個變種，是繡球花分布較多的國家之一。目前，市場上的繡球花品種繁多，花大艷麗，性狀各異，形態(tài)優(yōu)美，極具觀賞價值，已成為世界上極具發(fā)展?jié)摿Φ幕ɑ芷贩N之一，在花卉產(chǎn)業(yè)中具有重要意義。我國具有豐富的繡球花資源，對繡球花的研究主要集中在抗逆性、扦插繁殖、組培快繁、栽培管理、病蟲害防治、次生代謝物質(zhì)提取與檢測等方面[1-19]，而在新品種培育方面的研究較少，屈連偉等雖有報道，也僅局限于繡球花品種的雜交方面[20-21]，有關(guān)繡球花品種遺傳多樣性的研究報道相對較少。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是在SSR分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型分子標(biāo)記方法，具有成本低、穩(wěn)定性高、操作簡單、重復(fù)性高等特點[22]，近年來在園林花卉植物遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系與子代鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等應(yīng)用廣泛。董海燕等利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，將41個紅花檵木品種聚為5類，聚類結(jié)果與葉色分類結(jié)果[23]一致；胡仲義等對重慶南山植物園中的26株川茶花古樹進(jìn)行分類研究，將26個品種分為5個類群，并獲得山牡丹可能是由牡丹茶芽變的結(jié)論[24]；嚴(yán)華利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)建立了部分國蘭的指紋圖譜[25]；王湘瑩等成功分析了23個金銀花品種間的遺傳變異[26]；楊梅等將9個武當(dāng)木蘭典型種群分為3大類群，聚類結(jié)果與地理分布和花部特征劃分基本一致[27]。此外，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對崇明水仙、金葉女貞、芍藥等品種或雜交后代進(jìn)行了鑒定[28-30]。中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院通過多年努力，從國內(nèi)外共收集繡球花新優(yōu)品種38個，其中21個繡球花品種屬于繡球種，17個繡球花品種屬于圓錐繡球種，研究收集到的38個繡球花品種的遺傳多樣性，有助于了解繡球花品種間或種間的親緣關(guān)系和遺傳背景，可為繡球花新品種培育親本的選擇提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1植物材料

繡球花材料來源于中南林業(yè)科技大學(xué)植物園繡球花品種資源庫，包含繡球、圓錐繡球2個種，共計38個品種（表1），其中25個繡球花品種引自美國，12個品種源自荷蘭，1個為中國原生種。

1.2DNA提取與檢測

每個繡球品種采集3～5株新鮮葉片，直接帶回實驗室，采用天根生物科技（北京）有限責(zé)任公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取繡球基因組總DNA；采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，溴化乙錠（EB）核酸染料濃度為 0.5 mg/mL，緩沖液為1×TAE，電泳電壓為5 V/cm，電泳時間30 min；電泳成像采用凝膠成像系統(tǒng)，DNA純度及濃度用核酸蛋白分析儀測定；將DNA條帶明亮清晰、無拖帶現(xiàn)象、無RNA和蛋白質(zhì)污染的樣品于-70 ℃冰箱保存，備用。

1.3ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系與程序

以繡球基因組總DNA樣品為模板，利用引物UBC855通過單因素試驗和正交試驗對Mg2+，TaqDNA聚合酶、引物、dNTPs、模板DNA濃度等影響因素進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化[31]，確定繡球品種的ISSR-PCR擴(kuò)增體系為（20 μL）：10[CM（24*2]×PCR Buffer 2.0 μL，DNA 30 ng，Mg2+ 2.0[KG*3]mmol/L，ISSR 引物0.6 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U，用ddH2O補(bǔ)足到20 μL。擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，52 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸90 s，共36個循環(huán)；72 ℃ 總延伸420 s，4 ℃保存[32]。

1.4引物篩選及擴(kuò)增

利用最優(yōu)ISSR-PCR反應(yīng)體系，以任意一個繡球品種總DNA樣品為模板，從100條隨機(jī)引物中篩選出擴(kuò)增條帶多、條帶清晰、能擴(kuò)增出高質(zhì)量條帶的引物用于38個繡球花品種遺傳多樣性檢測，并經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離、凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)DNA指紋圖譜和條帶位置，確定樣品圖譜中擴(kuò)增條帶的位置和大小，清晰、可辨認(rèn)的條帶記為“1”，模糊不清或沒有條帶的記為“0”，建立數(shù)據(jù)庫；利用PopGen32統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行計算、分析，利用Mega 6進(jìn)行聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1繡球花品種ISSR-PCR擴(kuò)增多態(tài)性

多態(tài)位點比率是衡量一個群體內(nèi)遺傳變異水平高低的重要指標(biāo)，比值越高，該群體變異水平越大，環(huán)境適應(yīng)性越強(qiáng)，反之則越弱，在進(jìn)化過程中越易被淘汰。由表2可見，從100條引物篩選出10條引物對38個繡球花品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出132個位點，其中多態(tài)性位點122個，每個引物平均擴(kuò)增13.2個位點、多態(tài)位點12.2個，多態(tài)位點比率為92.42%，說明繡球花品種間具有較大的遺傳變異，環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，這可能與繡球花新品種的培育方式有關(guān)。由表3可見，繡球種群體包含21個繡球花品種，多態(tài)性位點為105個，多態(tài)位點[CM（25]比率為79.55%，圓錐繡球群體包含17個繡球花品種，多態(tài)性位點為89個，多態(tài)位點比率為67.42%，說明這2個繡球種群具有較高的遺傳多樣性，圓錐繡球品種多態(tài)性略低于繡球品種。

2.2繡球花品種的遺傳多樣性

由表3可見，38個繡球花品種的觀測等位基因數(shù)為 1.924 2，有效等位基因數(shù)為1.676 8，Neis基因多樣性指數(shù)為0.378 2，Shannons信息指數(shù)為0.549 7，這表明該群體具有較高的遺傳多樣性；繡球種群的觀測等位基因數(shù)為1.795 5，有效等位基因數(shù)為1.560 7，Neis基因多樣性指數(shù)為0.315 5，Shannons信息指數(shù)為0.460 2；圓錐繡球種群的觀測等位基因數(shù)為1.674 2，有效等位基因數(shù)為1.435 1，Neis基因多樣性指數(shù)為0.249 8，Shannons信息指數(shù)為0.368 8。統(tǒng)計結(jié)果表明，2種繡球群體總的基因多樣性為0.375 8，種內(nèi)基因多樣性為0.282 6，種內(nèi)遺傳變異占75.20%，種間遺傳變異占 24.80%，這說明2個繡球群體之間存在遺傳變異，并主要存在于種內(nèi)，繡球與圓錐繡球之間的雜交親和性相對較低，二者通過雜交培育新品種難度較大；2個種群之間的基因流為 1.517 4（大于1），這表明二者之間存在明顯的基因流。

2.3繡球花品種的遺傳一致度

采用PopGen 32軟件對38個繡球花品種進(jìn)行遺傳距離和遺傳一致度分析，結(jié)果表明，38個繡球花品種間的遺傳一致度變化范圍為0.454 5～0.977 3，其中繡球花品種夢幻藍(lán)（pop10）與繡球花品種史歐尼（pop11）之間的遺傳一致度相對最高，為0.977 3，二者親緣關(guān)系相對較近，繡球花品種史歐尼（pop11）與繡球花品種小檸檬（pop27）的遺傳一致度相對最低，為0.454 5，二者之間親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，彼此間存在較大的差異；2個種群之間的遺傳一致度為0.749 1，遺傳距離為0.288 9，這說明2個種群之間的親緣關(guān)系相對較近。

2.4繡球花品種的親緣關(guān)系

由圖1可見，38個繡球花品種聚分為兩大類，第1類包含所有的繡球品種，第2類包含所有的圓錐繡球品種；每類又分2個亞類，第1亞類包括19個繡球品種，第2亞類包括2個繡球品種，第3亞類包括1個圓錐繡球品種，第4亞類包括16個圓錐繡球品種；繡球為傘房狀聚傘花序近球狀或頭狀，小枝粗，無毛，葉倒卵形或?qū)挋E圓形，先端驟尖，基部鈍圓或?qū)捫ㄐ?，具粗齒，兩面無毛；圓錐繡球為圓錐狀聚傘花序，密被柔毛，幼枝疏被柔毛，葉紙質(zhì)，卵形或橢圓形，先端漸尖或驟尖，具短尖頭，基部圓或?qū)捫ㄐ?。聚類結(jié)果與形態(tài)分類基本一致，可將繡球、圓錐繡球2個種完全區(qū)分。

3討論與結(jié)論

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有檢測靈敏、多態(tài)性好、穩(wěn)定、重復(fù)性高等優(yōu)點。利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對國內(nèi)外收集的38個繡球花品種進(jìn)行的品種鑒定結(jié)果、聚類關(guān)系表明，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能很好地區(qū)分繡球花品種種群，38個繡球花品種聚為兩大類，第1類為繡球，第2類為圓錐繡球，與按照花型、葉型特征的分類結(jié)果基本一致；繡球品種史歐尼、夢幻藍(lán)親緣關(guān)系相對最近，在繡球花種間分類中具有較高的靈敏性；38個繡球品種分為4個亞群，第1亞群包含19個繡球品種，第2亞群包含2個繡球品種，第3亞群包含16個圓錐繡球品種，第4亞群包含1個圓錐繡球品種。繡球和圓錐繡球在葉片、花形態(tài)方面差異明顯，繡球葉片倒卵形，先端聚尖，基部鈍圓，具粗齒，葉柄粗，葉片較厚，圓錐繡球葉片紙質(zhì)，橢圓形，先端漸尖或聚尖，基部圓或?qū)捫ㄐ?，密生小鋸齒，上面無毛或疏被糙伏毛，葉片較薄；繡球花序近球形或花序頂端平，而圓錐繡球花序為圓錐形聚傘花序。試驗結(jié)果表明，繡球品種之間的聚類結(jié)果與花序形態(tài)特征存在明顯差異，呈近球形聚傘花序品種與花序頂端平頭狀花序品種相間分布的特點，如變?nèi)~繡球（pop7）、南丁格爾繡球（pop14）、塔貝（pop17）3個繡球品種，花序為頂端平狀花序，但聚類結(jié)果并未單獨(dú)聚在一起，而是與近球形花序品種聚在一起，可能與這3個品種屬于山繡球（繡球變種）有關(guān)，具體原因還須進(jìn)一步研究。

38個繡球花品種遺傳多樣性分析表明，繡球花多態(tài)位點比率為92.42%，與大菊品種的92.5%[33]基本一致，遺傳多樣性高于紅花檵木品種的72.9%[23]，但略低于李艷香的研究結(jié)論[34]，這可能與試驗材料不同有關(guān)；繡球品種的多態(tài)位點比率為79.55%，圓錐繡球品種的多態(tài)位點比率為67.42%，介于紅花檵木品種之間，遠(yuǎn)低于大菊品種；38個繡球花品種的遺傳距離介于0～0.769 1，平均值為0.373 5，遺傳一致度介于0.463 4～1.000 0之間，平均值為0.696 2，遺傳距離和遺傳一致度跨度較大，這可能有2個方面的原因：一是繡球花資源分布廣泛，種類較多，分布區(qū)域跨不同氣候帶，適應(yīng)性廣，本身具有很好的遺傳基礎(chǔ)；二是繡球花新品種培育多采用雜交方式，有利于品種或種之間的基因交流；繡球、圓錐繡球2個種的基因多樣性為0.375 8，種內(nèi)變異占75.20%，存在一定的種間變異，但種內(nèi)變異起主導(dǎo)作用，開展種內(nèi)雜交更有利于獲得雜交后代。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱霽琪. 繡球?qū)?個種植物鋁吸收特性的研究[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[2]種楠. 櫟葉繡球（Hydrangea quercifolia）對鉛、銅脅迫的生理響應(yīng)及鉛在其體內(nèi)的積累特性研究[D]. 南昌：江西財經(jīng)大學(xué)，2013.

[3]辛雅芬，石玉波. 高溫對八仙花生理指標(biāo)的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（11）：5204-5206.

[4]彭盡暉，陳海霞，龔雯，等. 鋁脅迫對八仙花離體植株質(zhì)膜透性與抗氧化系統(tǒng)的影響[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，39（1）：42-44.

[5]孫強(qiáng)，虞秀明，姚紅軍. 繡球?qū)倨贩N資源收集及扦插生根能力比較[J]. 北方園藝，2016（11）：71-73.

[6]郭玉敏，黃銀. 不同配比基質(zhì)對3個八仙花品種根系生長的影響[J]. 林業(yè)實用技術(shù)，2013（3）：52-53.

[7]黎雯茜，胡春梅，蔡信歡，等. 基質(zhì)和激素對八仙花嫩枝扦插生根的影響[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（15）：159-160.

[8]張詠新. 銀邊八仙花的扦插繁殖試驗[J]. 北方園藝，2012（21）：69-70.

[9]王忠武，建德鋒. 八仙花莖尖離體培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 北方園藝，2012（9）：129-130.

[10]馮潤東，孫宏剛. 八仙花組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)[J]. 北華大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，12（3）：350-352.

[11]雷亞靈，李周岐. 八仙花莖段組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報，2008，23（4）：101-103，108.

[12]任叔輝. 八仙花的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)[J]. 防護(hù)林科技，2006（1）：10-11.

[13]焦雋，梁麗君，馬輝，等. 繡球種質(zhì)資源引進(jìn)與栽培技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2016（11）：203-204.

[14]劉桂蘭，劉宏，袁麗偉，等. 都山繡球組培苗露地栽培研究[J]. 中國園藝文摘，2014（10）：30-31.

[15]周德旗，漢梅蘭，朱亞靈，等. 大花圓錐繡球繁育及栽培技術(shù)[J]. 中國園藝文摘，2014（12）：161-161，222.

[16]徐慧，劉超，鐘漢東. 不同光照強(qiáng)度對八仙花開花的影響[J]. 北方園藝，2014（1）：81-82.

[17]林麗飛，李衛(wèi)芬，胡先奇，等. 繡球花短粗根病病原線蟲的種類鑒定[J]. 植物保護(hù)，2009，35（2）：131-133.

[18]蔣新龍. 繡球花花、葉總黃酮的提取工藝和含量測定[J]. 麗水學(xué)院學(xué)報，2007，29（5）：37-41.

[19]馮衛(wèi)生，張艷麗，鄭曉珂，等. 繡球花的化學(xué)成分研究[J]. 中國藥學(xué)雜志，2011，46（8）：576-579.

[20]屈連偉. 繡球花新品種選育——種子收獲和播種[J]. 中國花卉園藝，2013（8）：30-32.

[21]海風(fēng)，屈連偉，趙興華. 繡球花人工雜交技術(shù)研究[J]. 北方園藝，2014（12）：72-74.

[22]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.

[23]董海燕，季孔庶，侯伯鑫，等. 基于ISSR標(biāo)記的紅花檵木品種親緣關(guān)系分析[J]. 園藝學(xué)報，2014，41（2）：365-374.

[24]胡仲義，林立，劉夔，等. 26個川茶花品種親緣關(guān)系的ISSR分析[J]. 植物研究，2013，33（5）：629-634.

[25]嚴(yán)華. 幾種國蘭形態(tài)學(xué)及ISSR分子鑒定[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[26]王湘瑩，何鋼，王曉明，等. 金銀花不同品種間遺傳變異的 ISSR 分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2013，33（11）：77-82.

[27]楊梅，張敏，師守國，等. 武當(dāng)木蘭種群遺傳結(jié)構(gòu)的ISSR分析[J]. 林業(yè)科學(xué)，2014，50（1）：76-81.

[28]周永剛. 崇明水仙種質(zhì)資源細(xì)胞學(xué)分析及ISSR分子鑒定[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[29]李延龍，張明，曹秀敏，等. ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在金葉女貞品種鑒定中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2008，14（22）：39，34.

[30]索志立. 利用DNAISSR分子標(biāo)記技術(shù)對芍藥屬植物栽培品種的分類鑒定方法[J]. 生物技術(shù)通報，2008（增刊1）：109-112.

[31]彭繼慶，曹福祥，許若嫻. 殼菜果ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（16）：53-59.

[32]范海艷，曹福祥，彭繼慶，等. 博白大果油茶ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2011，31（4）：97-103.

[33]繆恒彬，陳發(fā)棣，趙宏波. 85個大菊品種遺傳關(guān)系的ISSR分析[J]. 園藝學(xué)報，2007，34（5）：1243-1248.

[34]李艷香. 19個繡球?qū)俜N質(zhì)資源的SRAP分析[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.