程勇++任道全++陳根元++矯繼峰++王帥

摘要：為研究苦馬豆素對家兔睪丸生精細胞周期的影響，進一步探討瘋草的中毒機理，將24只雄性家兔隨機分為對照組和試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，試驗組分別按照Ⅰ組15%（苦馬豆素含量30 mg/kg）、Ⅱ組30%（苦馬豆素含量60 mg/kg）、Ⅲ組45%（苦馬豆素含量90 mg/kg）的比例添加瘋草小花棘豆，對照組僅飼喂苜蓿干草，試驗期70 d。分別于攻毒后第14、第35、第70天每次每組隨機采集2只家兔的睪丸，通過流式細胞儀測定生精細胞凋亡率和細胞周期的變化。結果顯示，從第35天開始，試驗組家兔生精細胞凋亡率均極顯著升高（P<0.01），其中單倍體細胞和二倍體細胞凋亡率均極顯著升高（P<0.01），但四倍體細胞數(shù)量無顯著變化。與對照組相比，中毒家兔睪丸生精細胞數(shù)量在G0/G1期升高，在S期降低，而且G1期與S期細胞數(shù)量呈顯著負相關。說明苦馬豆素可導致家兔睪丸組織生精細胞凋亡，且呈現(xiàn)出一定的時間-劑量效應。

關鍵詞：苦馬豆素；家兔；生精細胞；細胞凋亡；細胞周期；時間-劑量效應

中圖分類號： S816.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0138-03

瘋草是豆科黃芪屬和棘豆屬有毒植物的總稱，是西北地區(qū)草原畜牧業(yè)危害最嚴重的有毒植物[1]，具有根系發(fā)達、返青早、抗逆性強、繁殖系數(shù)高等特點，極易成為草原中的優(yōu)勢種[2]。新疆維吾爾自治區(qū)每年因采食瘋草中毒的放牧家畜約100萬只（頭），其中超過50%的中毒家畜死亡[3]。苦馬豆素（swainsonine，SW）是一種多羥基吲哚里西啶生物堿，國內外研究表明其是瘋草的主要毒性成分[4]，中毒家畜主要表現(xiàn)為繁殖系統(tǒng)和神經系統(tǒng)損傷，其中睪丸、卵巢、腦組織等器官均出現(xiàn)細胞空泡變性、細胞核萎縮等病理變化[5]。王帥等研究發(fā)現(xiàn)，SW可導致中毒家兔睪丸萎縮、精子數(shù)量與活性降低，最終導致雄性動物生精功能障礙[6]。張樑檢測了SW對大鼠大腦皮質神經細胞的毒性作用，發(fā)現(xiàn)SW 可導致神經細胞核濃縮，DNA 片段化，最終導致細胞凋亡[7]。目前有關SW對細胞凋亡影響的試驗主要集中于其對癌細胞和神經細胞的作用上，對生精細胞的凋亡及其機制未見報道。本試驗通過制備亞慢性瘋草中毒家兔模型，探討苦馬豆素對家兔生精細胞周期的影響，為家畜瘋草中毒的防治提供基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料、試劑與儀器

1.1.1材料

瘋草樣品為采自新疆維吾爾自治區(qū)策勒縣恰哈鄉(xiāng)的小花棘豆（Oxytropis glabra DC）風干樣，由塔里木大學動物科學學院草業(yè)科學教研室鑒定。

1.1.2試劑

Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒，美國BD 公司；DNA-Perp Stain 細胞周期試劑盒，美國Beckman Coulter公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.3儀器

FAC Scam 型流式細胞儀，美國BD 公司；5810 R型高速冷凍離心機，德國Eppendorff公司。

1.2試驗動物分組與處理

雄性家兔24只，體質量（2.0±0.1） kg/只，平均分為對照組和3個試驗組，分籠飼養(yǎng)。對照組僅飼喂青苜蓿干草，試驗組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別飼喂摻入小花棘豆15%、30%、45%（按氣相色譜法計算苦馬豆素含量分別為30、60、90 mg/kg[8]）的混合干草，試驗期70 d。試驗第14、第35、第70天各組分別剖殺2只家兔取睪丸，將家兔睪丸組織剪成1～2 mm大小，置于5 mL PBS液（pH值7.4）中，渦旋振蕩3 min后使用400目尼龍濾網過濾，1 500 r/min離心5 min后棄去上清，再置于 5 mL PBS液中混勻。相同條件下重復3次即得到單細胞懸液，用于細胞周期比例和細胞凋亡率的檢測。

1.3苦馬豆素對家兔生精細胞周期的影響

使用PBS沖洗單細胞懸液1～2 次，加入質量濃度為0125%的胰蛋白酶消化2 min，含血清培養(yǎng)液終止消化后棄去上清，PBS 漂洗3次后收集細胞于離心管中；4 ℃、2 000 r/min 離心10 min后棄去上清，加入1 mL 75%乙醇 4 ℃ 固定過夜；然后4 ℃、2 000 r/min條件下離心10 min后棄去上清，PBS 漂洗3次后再于4 ℃、2 000 r/min條件下離心10 min，將細胞重懸于200 μL PBS液中，加入 5 μL RnaseA，37 ℃反應1 h，再加入 10 μL Triton-X-100 和 5 μL PI，4 ℃下避光孵育 30 min，1 h 內使用流式細胞儀檢測。

1.4苦馬豆素致家兔生精細胞凋亡率的測定

使用PBS沖洗單細胞懸液1～2 次，加入質量濃度為0125%的胰蛋白酶消化2 min，含血清培養(yǎng)液終止消化后棄去上清，PBS 漂洗3次后收集細胞于離心管中；4 ℃、2 000 r/min 離心10 min后棄去上清，加入1 mL PBS重懸細胞，使用250目尼龍濾網過濾；然后4 ℃、2 000 r/min條件下離心10 min后棄去上清，將細胞重懸于200 μL Binding Buffer中，加入 10 μL AnnexinV-FITC和 5 μL PI，4 ℃下避光孵育 30 min，1 h 內上機檢測。

1.5數(shù)據分析

使用SPSS 16.0中One-Way ANOVA進行單因素方差分析及Duncans多重比較，檢驗誤差為5%和1%。

2結果與分析

2.1苦馬豆素對家兔性行為的影響

試驗初期攻毒家兔與對照家兔行為均表現(xiàn)正常，攻毒第14 天時攻毒家兔出現(xiàn)精神沉郁、被毛豎立、反應遲鈍等現(xiàn)象；與雌兔接觸時，對照家兔的性反應時間短于攻毒家兔，爬跨次數(shù)也多于攻毒家兔。隨著攻毒時間的延長，攻毒家兔均出現(xiàn)喜臥、嗜睡等典型中毒癥狀[5]，與雌兔接觸時基本無正常的性行為表現(xiàn)。說明苦馬豆素可顯著影響雄性家兔的性行為。

2.2苦馬豆素對家兔睪丸生精細胞周期的影響

由圖1可知，苦馬豆素攻毒家兔睪丸生精細胞與對照家兔相比，G0/G1期細胞數(shù)量逐漸升高，S期細胞數(shù)量逐漸降低，而且G1期與S期細胞數(shù)量呈顯著的負相關關系，其中高劑量攻毒組家兔的變化最為明顯。

2.3苦馬豆素對家兔睪丸生精細胞凋亡率的影響

家兔睪丸生精細胞主要分為單倍體細胞、二倍體細胞和四倍體細胞。由圖2可知，與對照組相比，第14 天時試驗組家兔單倍體細胞凋亡率均顯著高于對照家兔（P<005），但僅試驗Ⅲ組家兔生精細胞凋亡率顯著高于對照（P<0.05）。第35天時試驗組單倍體細胞凋亡率和生精細胞凋亡率均極顯著高于對照（P<0.01），但二倍體細胞凋亡率均顯著高于對照家兔（P<0.05）。第70 天時試驗組單倍體細胞凋亡率、二倍體細胞凋亡率和生精細胞凋亡率均極顯著高于對照家兔（P<0.01），但整個試驗期內四倍體細胞凋亡率與對照差異不顯著（P>0.05）。

3結論與討論

睪丸細胞主要包括單倍體細胞（精子細胞和精子）、二倍體細胞（G0期精原細胞、次級精母細胞、支持細胞和間質細胞）以及四倍體細胞（粗線期、細線期、雙線期的初級精母細胞和 G2期的精原細胞等），另外還有一些較為分散的細胞由進[CM（25]行DNA合成的精原細胞和細線前期精母細胞組成。正常情況下，睪丸的精原細胞在促性腺激素和雄性激素作用下，依次經過精原細胞、初級精母細胞和次級精母細胞，最后轉變成為高度分化的精子。其中減數(shù)分裂前的精原細胞和精母細胞有較高的自發(fā)凋亡現(xiàn)象，但精子細胞很少發(fā)生凋亡，這是保證隨后的精子正常生長所必需的。其意義在于維持成熟精子的質量和數(shù)量，清除染色體異常的生精細胞，保持生精細胞與支持細胞數(shù)量上的平衡。其中，四倍體細胞與二倍體細胞的比率反映了精原細胞轉化為初級精母細胞的效率，單倍體細胞與四倍體細胞的比率顯示了減數(shù)分裂的效果，單倍體細胞與二倍體細胞的比率反映了精原細胞轉化為精子細胞的效率。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆中毒主要影響動物的繁殖和神經系統(tǒng)，其中雄性中毒動物表現(xiàn)為性欲低下，無配種能力。Jyothi等研究表明，睪丸生精細胞凋亡時精原細胞的凋亡比較嚴重，即多數(shù)生殖毒性物質的靶細胞是精原細胞[9]。本試驗通過流式細胞儀檢測了家兔睪丸內各種生精細胞的比例，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，苦馬豆素攻毒家兔睪丸單倍體細胞和二倍體細胞凋亡率均極顯著升高，但四倍體細胞凋亡率無明顯變化，說明苦馬豆素可顯著影響家兔減數(shù)分裂及精原細胞轉化為初級精母細胞的效率，即苦馬豆素主要影響精原細胞和次級精母細胞。

通過流式細胞儀檢測苦馬豆素攻毒對家兔睪丸生精細胞周期的影響發(fā)現(xiàn)，與對照相比，中毒家兔睪丸生精細胞G0/G1期數(shù)量增多，S期細胞數(shù)量降低。表明苦馬豆素可能抑制了S期DNA的合成與修復過程，從而使S期細胞數(shù)量降低，并抑制了S期細胞進入G2/M期，另外還對細胞進入G1期有一定的促進作用。凋亡率檢測發(fā)現(xiàn)，處于分裂增殖階段的精原細胞、精母細胞對苦馬豆素較為敏感。其原因可能為精原細胞和精母細胞分別處于有絲分裂和減數(shù)分裂期，在S期須打開DNA雙鏈以合成新的DNA，而裸露的DNA對苦馬豆素的作用較為敏感，容易產生DNA損傷[10]。當DNA損傷超過自身的修復能力時，將導致同源染色體配對、交換和分離的紊亂，從而引發(fā)細胞凋亡。本試驗結果與郭全海等的研究結論[11]一致，初步闡明了苦馬豆素對家兔睪丸生精細胞凋亡的影響機制。

本研究從細胞生物學水平探討了苦馬豆素對家兔睪丸生精細胞凋亡的影響機制，為瘋草中毒的防治提供了一定的參考。與對照組相比，中毒家兔睪丸精原細胞和次級精母細胞G0/G1期數(shù)量增多，S期細胞數(shù)量降低，表明苦馬豆素可能抑制了精原細胞和次級精母細胞S期DNA的合成與修復過程。

參考文獻：

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