吳嘉韻++吳森++戴超輝++吳圣龍++包文斌

摘要：為了揭示DLG5基因在機體抵抗大腸桿菌刺激過程中發(fā)揮的功能，本試驗利用產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（F18ab、F18ac和K88ac）侵染豬腸上皮細胞系（IPEC-J2）模擬個體的致病過程，用實時熒光定量檢測DLG5基因在感染前后的表達變化情況，在細胞水平上探討DLG5基因表達水平與產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗性的關系。結果表明，3種大腸桿菌的菌清和菌體刺激IPEC-J2后，DLG5基因表達水平均發(fā)生顯著或極顯著上調；并且由F18ab和K88ac這2種菌體刺激后DLG5基因表達水平上調的程度要極顯著高于F18ac菌體刺激后的表達水平。[JP3]本研究結果提示，豬DLG5基因表達和大腸桿菌的抗性具有密切關系，可能與其在一定程度上能夠促進腸道屏障的結構穩(wěn)定和功能發(fā)揮有關。

關鍵詞：豬；DLG5基因；產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌；抗病育種；表達水平；腸上皮細胞

中圖分類號： S828文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0127-03

仔豬斷奶前后腹瀉是規(guī)?；i場最常見的疾病。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli，簡稱ETEC）是引起斷奶前后腹瀉的主要病原菌。仔豬斷奶后，小腸的形態(tài)和功能都發(fā)生相應的變化[1]。此外，斷奶期間消化酶的活性降低，影響腸黏膜的修復和結構的完整性[2]，導致大量致病性大腸桿菌的入侵從而引起疾病，因此仔豬腸道黏膜結構完整性是抵抗產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌等外來病原菌侵襲的基本保障[3]，同時是維持腸道屏障相關基因（蛋白）表達對腹瀉的抗性具有的重要調控作用[4]。

DLG5（discs large homologs 5）基因位于10號染色體q23，全長約79 kb，含32個具有編碼功能的外顯子，其編碼的蛋白是膜結合相關的鳥苷酸激酶（membrane-associated guanylate kinase，MAGUK）家族成員之一，主要參與細胞內(nèi)的信號傳導并起到構建細胞骨架的作用[5]。有相關研究證明，DLG5基因還具有穩(wěn)定頂端蛋白復合體的功能，與上皮細胞的完整性和極性的保持有關[6]。課題組前期篩選出miR-192和 miR-215可能是調控斷奶仔豬抗F18大腸桿菌感染的重要miRNAs，而DLG5基因就是兩者共同靶向調控的關鍵靶基因，結合DLG5基因的生物學功能，初步表明豬DLG5基因可能與斷奶仔豬腸道上皮的完整性以及大腸桿菌的抗性密切相關[7-8]。為進一步揭示DLG5基因在機體抵抗大腸桿菌刺激過程中發(fā)揮的功能，本試驗在細胞水平上利用產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（F18ab、F18ac和K88ac）侵染豬腸上皮細胞系（IPEC-J2），用實時熒光定量檢測DLG5基因在侵染前后的表達變化情況，分析DLG5基因的表達水平與大腸桿菌侵染的關系，為下一步探討DLG5基因的功能提供更加直接的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

豬腸上皮細胞系（IPEC-J2）和大腸桿菌（F18ab、F18ac和K88ac）由揚州大學獸醫(yī)學院畜禽病原微生物研究室惠贈；DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均購自Gibco公司（美國）；PBS磷酸緩沖液（干粉）購自北京賽因坦科技有限公司（中國，北京）；Trizol裂解液購自Invitrogen公司（美國）；反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2IPEC-J2細胞的培養(yǎng)

將IPEC-J2細胞以1×106個/孔的密度接種到3板12孔板中，用含10% FBS的完全培養(yǎng)液（DMEM與F12培養(yǎng)基 1 ∶1 混合）在恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng)至密度達到約90%。

1.3大腸桿菌菌液侵染IPEC-J2細胞

將大腸桿菌F18ab、F18ac和K88ac分別接種至LB培養(yǎng)液，在恒溫搖床（37 ℃，200 r/min）中搖菌12 h，離心（4 000 r/min，10 min），分別收集菌清和菌體。向“1.2”步驟中2板12孔板的每個培養(yǎng)孔（處理孔和培養(yǎng)孔各設3個重復）各加200 μL上清液和800 μL培養(yǎng)液，放于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）分別孵育4、8 h后收集細胞用于提取總RNA。

1.4大腸桿菌菌體侵染IPEC-J2細胞

將上一步驟中收集的菌體用PBS緩沖液洗滌并離心（重復3次）。用細胞培養(yǎng)液將細菌稀釋至1.0×109 CFU/mL，每個培養(yǎng)孔（處理孔和培養(yǎng)孔各設3個重復）加入1.0 mL細菌懸液，于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）孵育4 h后收集細胞用于提取總RNA。

1.5引物設計及合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中DLG5基因序列（登錄號：XM_005671132.1），利用Oligo 7.0軟件設計Real-time PCR引物，為避免基因組DNA污染，引物跨外顯子設計；以GAPDH基因作為內(nèi)參，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息見表1。

1.6細胞總RNA提取和cDNA合成

利用Trizol法提取各孔板細胞總RNA，提取步驟嚴格按照Trizol Reagent說明書操作，并以1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整程度，使用ND-1000核酸/蛋白濃度測定儀測定濃度及純度，產(chǎn)物-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA合成反應體系（10 μL）為：5×qRT SuperMix Ⅱ 2 μL，總RNA 500 ng，RNase free ddH2O補足至10 μL。反應條[JP3]件為：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7實時熒光定量

實時熒光定量反應體系為：模板cDNA 2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，2×SYBR Premix ExTapTM Ⅱ 10 μL，50×ROXReference Dye Ⅱ 0.4 μL，RNase free ddH2O補足至總體積20 μL。擴增程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。擴增結束后進行熔解曲線的分析，具體程序為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。每個樣本設置3個重復。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

相對定量的結果采用2-ΔΔCt法進行分析處理，并利用SPSS 17.0軟件一般線性模型（general linear model，GLM）的Univariate統(tǒng)計方法分析不同菌體刺激的差異顯著性，數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示。

2結果與分析

2.1總RNA的純度與完整性檢測

提取的細胞總RNA經(jīng)1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，呈現(xiàn)清晰的28S、18S、5S共3條帶，無DNA污染條帶及明顯降解，NanoDrop ND-1000核酸/蛋白濃度測定儀檢測RNA純度，樣本的D260 nm/D280 nm為1.8～1.9，說明RNA提取的完整性和純度較高，可用于后續(xù)試驗。

2.2熒光定量PCR的擴增曲線與熔解曲線

根據(jù)熒光值的變化，系統(tǒng)自動生成反應循環(huán)數(shù)與檢測熒光量變化的擴增反應動力學曲線，而擴增產(chǎn)物的特異性由熔解曲線可以判斷。由圖1可知，DLG5基因成功實現(xiàn)擴增，且qPCR產(chǎn)物只有1個特異峰，無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物生成。

2.3大腸桿菌菌清刺激IPEC-J2細胞4 h和8 h后DLG5基因的表達水平

分別以未經(jīng)大腸桿菌刺激處理的對照組表達水平為1，將3種大腸桿菌菌清侵染4 h和8 h后細胞中DLG5基因 mRNA 的表達水平進行均一化處理。由圖2可知，F(xiàn)18ab和K88ac菌清刺激豬腸上皮細胞4 h后，DLG5基因表達水平均發(fā)生顯著上調（P<0.05），F(xiàn)18ac菌清刺激4 h后，DLG5基因表達水平發(fā)生極顯著上調（P<0.01），但是3種菌清刺激4 h后DLG5基因相對表達水平無顯著差異（P>0.05）。3種大腸桿菌菌清刺激豬腸上皮細胞8 h后，DLG5基因表達水平均發(fā)生極顯著上調（P<0.01），且3種大腸桿菌菌清處理8 h后細胞中DLG5基因相對表達水平都沒有顯著差異（P>0.05）。結果還顯示，3種大腸桿菌菌清刺激處理8 h后DLG5基因表達[CM（25]水平上調的程度均極顯著高于處理4[KG*3]h后的上調程度 （P<0.01）。

2.4DLG5基因在大腸桿菌菌體刺激IPEC-J2后的表達水平

以未經(jīng)大腸桿菌刺激處理的對照組表達水平為1，對3種大腸桿菌刺激處理的細胞中DLG5基因mRNA的表達水平進行均一化處理。由圖3可知，3種大腸桿菌刺激IPEC-J2后，DLG5基因表達水平均發(fā)生極顯著上調（P<0.01），差異倍數(shù)分別為4、2、4倍；并且F18ab和K88ac這2種菌體刺激后DLG5基因表達水平上調的程度要極顯著高于F18ac菌體刺激后的表達水平（P<0.01），但是F18ab和K88ac這2種菌體刺激后DLG5基因表達水平無顯著差異（P>0.05）。

3討論

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）是引起斷奶前后仔豬腹瀉和水腫的主要病原菌，菌體表面特異菌毛按黏附素（菌毛）性質可將E.coli分為F18、K88、K99、F41、987P等，ETEC通過表面菌毛黏附于仔豬小腸黏膜上皮細胞上的刷狀緣受體，定居并大量繁殖，同時產(chǎn)生腸毒素，刺激小腸黏膜細胞，破壞腸上皮細胞結構，最后引起仔豬腹瀉、脫水甚至死亡[9，11]。大量研究報道認為DLG5基因是人炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的候選易感基因，而IBD的特征之一為腸上皮屏障功能受損[5，12]。DLG5蛋白廣泛分布于機體心臟、肝臟、腸道上皮等組織[13]，能與其他蛋白互作形成蛋白復合物，再與多種信號轉導蛋白連結，在維持上皮細胞結構、信號傳遞和維持細胞骨架等過程中發(fā)揮重要作用[14]。因此，當機體腸道受到外源感染時，DLG5的較高水平表達可能會在一定程度上緩解腸道組織細胞的增殖和凋亡，降低病原的侵染速率。結合本次試驗結果，3種大腸桿菌的菌清或菌體刺激IPEC-J2后，細胞中DLG5基因的相對表達均顯著上調，且用菌清刺激IPEC-J2細胞的時間越久，DLG5基因的相對表達水平越高，進一步證實了DLG5在一定程度上能夠促進腸道屏障的結構穩(wěn)定和功能發(fā)揮，并且在大腸桿菌侵襲仔豬腸道中發(fā)揮了重要的調控作用。本次試驗結果還顯示，F(xiàn)18ab和K88ac這2種菌體刺激引起DLG5基因表達上調的程度均極顯著高于F18ac（P<0.01），這從一定程度上說明了不同種類的大腸桿菌對機體的侵襲能力可能存在差異，F(xiàn)18ab和K88ac這2種大腸桿菌對小腸上皮細胞的侵襲能力要強于F18ac。此外，大腸桿菌菌體刺激4 h后和菌清刺激8 h后的引起的DLG5基因表達都極顯著上調（P<0.01），菌體引起的差異倍數(shù)分別為4、2、4倍，而菌清引起的差異倍數(shù)均為2倍，由此可見大腸桿菌菌體對小腸上皮細胞的侵襲能力要強于大腸桿菌菌清。

體外模擬個體的致病過程，特別是以宿主細胞為素材進行相關研究是驗證基因功能的重要手段。為了在細胞水平揭示DLG5基因在機體抵抗大腸桿菌刺激過程中發(fā)揮的功能，本研究利用3種大腸桿菌的菌清和菌體刺激IPEC-J2細胞，通過分析刺激前后細胞中DLG5基因的表達變化，初步證實了DLG5基因在大腸桿菌刺激過程中確實發(fā)揮了一定的調控作用；但考慮到離體培養(yǎng)的豬腸上皮細胞系并不能完全模擬體內(nèi)腸道組織的生長環(huán)境，所以本研究只能初步說明DLG5基因的表達和大腸桿菌的抗性具有密切關系，DLG5基因在大腸桿菌刺激過程中的調控作用及其機制還有待進一步研究。下一步還將利用基因敲除和干擾技術，結合轉錄組分析和轉基因動物模型制備等手段，在動物模型上進行大腸桿菌體外攻毒試驗，并在群體水平中進行系統(tǒng)分析驗證，以期為豬抗大腸桿菌病分子選育工作提供指導和依據(jù)。

參考文獻：

[1]Cabrera R A，Usry J L，Arrellano C，et al. Effects of creep feeding and supplemental glutamine or glutamine plus glutamate （Aminogut） on pre- and post-weaning growth performance and intestinal health of piglets[J]. Journal of Animal Science and Biotechnology，2013，4（1）：29.

[2]Godlewski M M，Bierla J B，Strzalkowski A，et al. A novel cytometric approach to study intestinal mucosa rebuilding in weaned pigs fed with dietary nucleotides[J]. Livestock Science，2009，123（2）：215-220.

[3]謝天宇，胡紅蓮，高民. 腸黏膜免疫屏障及其保護措施[J]. 動物營養(yǎng)學報，2014，26（5）：1157-1163.

[4]張影超，王希彪，崔世泉，等. 腸上皮緊密連接蛋白mRNA的表達與仔豬斷奶腹瀉關系的研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（9）：221-224.

[5]馮贇，鄭萍. DLG5與克羅恩病相關性的研究進展[J]. 國際消化病雜志，2008，28（4）：277-279.

[6]Friedrichs F，Stoll M. Role of discs large homolog 5[J]. World Journal of Gastroenterology，2006，12（23）：3651-3656.

[7]Ye L，Su X M，Wu Z C，et al. Analysis of differential miRNA expression in the duodenum of Escherichia coli F18-sensitive and -resistant weaned piglets[J]. PLoS One，2012，7（8）：e43741.

[8]吳正常，殷學梅，孫麗，等. 豬miR-192/-215的組織表達譜及其關鍵靶基因分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2015，48（11）：2251-2261.

[9]葉蘭，潘章源，黃雪根，等. 蘇太豬抗F18+大腸桿菌病基礎群FUT1基因多態(tài)性及其與生長發(fā)育的關聯(lián)分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（4）：158-161.

[10]張培晏，劉峻. 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌菌毛的研究進展[J]. 四川畜牧獸醫(yī)，2016，43（1）：32-34.

[11]陳傳榮，韓敏敏，張乃嘉，等. 腹瀉仔豬源致病性大腸桿菌生物膜與耐藥性及毒力的相關性[J]. 微生物學通報，2016，43（10）：2234-2241.

[12]黃盛秋，徐輝. 克羅恩病易感基因研究進展[J]. 西南軍醫(yī)，2013，15（2）：188-191.

[13]Shah G，Brugada R，Gonzalez O，et al. The cloning，genomic organization and tissue expression profile of the human DLG5 gene[J]. BMC Genomics，2002，3（1）：6.

[14]Stoll M，Corneliussen B，Costello C M，et al. Genetic variation in DLG5 is associated with inflammatory bowel disease[J]. Nature Genetics，2004，36（5）：476-480.