朱姍穎++康啟鑫++武亞楠++陳奕蓄++王文兵++何華綱

摘要：苜蓿尺蠖核型多角體病毒（AcMNPV）芋螺毒素類似多肽（CTL）具有酚氧化酶抑制劑活性，在農業(yè)害蟲的生物防治領域具有潛在的應用價值。為了揭示桿狀病毒ctl基因的進化特點，對桿狀病毒CTLs進行多序列比對分析和分類研究。結果表明，桿狀病毒CTLs可分為Ⅰ型、Ⅱ型，2種類型的CTLs都具有相同的二硫鍵骨架，但涉及昆蟲酚氧化酶抑制劑活性的酪氨酸殘基在2種類型CTLs中的數(shù)目、位置明顯不同；另外，Ⅰ型CTLs、Ⅱ型CTLs的理化性質也存在明顯差異，疏水性氨基酸平均含量分別為29.7%、21.3%，凈電荷平均值分別為-3.56、+0.507，等電點平均值分別為3.86、7.32。由此推測，Ⅰ型CTLs、Ⅱ型CTLs在功能上可能存在著重要分化。

關鍵詞：桿狀病毒；ctl基因；分類；進化

中圖分類號：Q753 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0022-05

芋螺毒素（conotoxin）是由海洋軟體動物芋螺分泌的一類用于自衛(wèi)和捕食的活性多肽，一般由10～30個氨基酸殘基組成，富含半胱氨酸（C）。芋螺毒素能特異性地作用于鉀、鈉、鈣等離子通道、細胞膜上的各種神經遞質、激素的受體，從而干擾細胞或神經中的信號傳遞，在治療慢性疼痛、急性疼痛、神經保護等方面具有廣泛的應用前景。根據保守的信號肽序列，芋螺毒素可分為A、M、O、I、P、S、T等超家族；進一步依據其半胱氨酸骨架及藥理活性，又可分為α、μ、ω、δ、Ψ、σ、λ、κ、γ等家族[1]。

1992年，Eldridge等從苜蓿尺蠖核型多角體病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus，簡稱AcMNPV）中鑒定了1個基因，該基因編碼的蛋白質序列與ω-芋螺毒素具有一定的相似性且具有相同的二硫鍵骨架（C1—C2—C3C4—C5—C6），因此將其命名為類芋螺毒素基因（conotoxin-like，簡稱ctl）[2]。但Eldridge等通過體內、體外試驗都未能證明桿狀病毒ctl基因的任何功能[2-3]。曹青等發(fā)現(xiàn)，AcMNPV CTL不僅對金黃色葡萄球菌、微球菌等具有顯著的抗菌活性，還可對酚氧化酶起到抑制作用，能阻止昆蟲血液的黑化[4-5]。本研究從GenBank數(shù)據庫中收集已知的桿狀病毒ctl基因，對其編碼的CTLs進行較全面系統(tǒng)的進化分析，在此基礎上對桿狀病毒ctl基因進行分類，以期為該基因的功能研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1基因序列和蛋白質序列的獲取

以AcMNPV ctl基因（GenBank登錄號：L22858）作為種子序列，在GenBank數(shù)據庫中進行BLAST，獲取桿狀病毒ctl基因序列，使用DNAStar軟件進一步推導出對應的蛋白質序列。芋螺毒素ω-MⅦA、虎紋蜘蛛毒素HWTX-X、家蠅酚氧化酶抑制劑MdPOI等抑制劑半胱氨酸結（inhibitor cystine knot，簡稱ICK）家族（也稱knottin家族）成員的氨基酸序列從KNOTTIN數(shù)據庫（http：//knottin.cbs.cnrs.fr）中獲得。

1.2多序列比對分析

使用SignalP 3.0軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0）預測桿狀病毒CTL蛋白質的信號肽，進而根據信號肽的位置，推導CTL成熟肽。使用ClustalW軟件（http：//www.genome.jp/tools/clustalw）對桿狀病毒CTL成熟肽進行多序列比對分析，并采用同樣的方法對ICK家族進行多序列比對分析。

1.3系統(tǒng)進化樹的構建

應用MEGA 4.0軟件通過鄰接（N-J）法構建系統(tǒng)進化樹。

1.4蛋白質理化性質分析

用DNAStar軟件統(tǒng)計桿狀病毒CTL成熟肽、ICK家族成員的疏水性氨基酸含量，并計算凈電荷、等電點（pI）。

2結果與分析

2.1桿狀病毒ctl基因的分布

以AcMNPV ctl基因為種子，在GenBank數(shù)據庫中進行BLAST分析。結果顯示，在全基因組已測序的50多個桿狀病毒中，有22個桿狀病毒含有ctl基因，約占40%。在這些桿狀病毒中，ctl基因的數(shù)目一般為1～2個。例如，AcMNPV、豆天蛾核型多角體病毒（Clanis bilineata NPV，簡稱ClbiNPV）等16種NPVs和棉鈴蟲顆粒體病毒（Helicoverpa armigera granulosisvirus，簡稱HearGV）、八字地老虎顆粒體病毒（Xestia c-nigrum GV，簡稱XecnGV）等2種GVs都只有1個ctl基因（表1）；蓖麻蠶核型多角體病毒（Samia cynthia NPV，簡稱SacyNPV）、柞蠶核型多角體病毒（Antheraea pernyi NPV，簡稱AnpeNPV）等6種NPVs均有2個ctl基因（表2），而家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori NPV，簡稱BmNPV）等桿狀病毒中則沒有該基因。在桿狀病毒中，ctl基因序列一致性在74%～100%之間，推導的蛋白質CTLs的氨基酸序列一致性為 40%～78%。對不同桿狀病毒CTLs進行信號肽的預測分析，發(fā)現(xiàn)所有CTLs的N端都有1段信號肽序列，其氨基酸組成的保守性較低，而成熟肽的氨基酸序列保守性較高。

2.2桿狀病毒CTLs的分類

對預測的桿狀病毒CTLs成熟肽序列進行多序列比對分析，可將桿狀病毒CTLs分為2種類型，分別命名為Ⅰ型CTLs、Ⅱ型CTLs（圖1）。Ⅰ型CTLs的前體肽都含有53個氨基酸殘基（aa），預測的成熟肽均為30個氨基酸，成熟肽的氨基酸組成相當保守，為ACA（/S）E（/D）TGAVCV（/I）HN（/S/D）DECCSGACSPV（/I）FNYCLPQ（/E/D），包括AcMNPV等4種NPVs編碼的CTLs，及SacyNPV、AnpeNPV等含有2個ctl基因的NPVs所編碼的CTL-1（表1、表2）。

Ⅱ型CTLs的前體肽含有48～68個氨基酸，長度變異主要位于信號肽部分，而成熟肽大部分為29個氨基酸，個別為35、32個氨基酸，成熟肽的氨基酸組成較為保守，為CTE（/D）T（/D）GR（/K）NCK（/Q）Y（/T）S（/N）Y（/A/D/N）ECCSG（/N）ACSAA（/V/L）FG（/K）F（/Y）CLH（/K/P）R，包括ClbiNPV等11種NPVs、HearGV等2種GVs編碼的CTLs及含有2個ctl基因的NPVs所編碼的CTL-2（表1、表2）。

采用CTLs成熟肽的氨基酸序列對桿狀病毒進行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)所有編碼Ⅰ型CTLs的桿狀病毒聚于1支，而所有編碼Ⅱ型CTLs的桿狀病毒聚于另1支（圖2）。

2.3Ⅰ型、Ⅱ型CTLs成熟肽的保守位點

多序列比對分析表明，在Ⅰ型CTLs、Ⅱ型CTLs的成熟肽中均含有6個高度保守的半胱氨酸殘基（C），二硫鍵骨架為C1—C2—C3C4—C5—C6。酪氨酸（Y）是涉及昆蟲酚氧化酶抑制劑活性的關鍵位點，因此本研究對2類CTLs中的酪氨酸的分布進行統(tǒng)計分析。結果顯示，Ⅰ型CTLs都有1個保守的酪氨酸殘基，位于C5～C6之間；在Ⅱ型CTLs中，除了茶小卷葉蛾核型多角體病毒（Adoxophyes honmai NPV，簡稱 AdhoNPV）、棉褐帶卷蛾核型多角體病毒（Adoxophyes orana NPV，簡稱AdorNPV）的CTL缺乏酪氨酸殘基，ChchNPV CTL、OrleNPV CTL-2只有1個酪氨酸殘基之外，其余CTLs在C2～C3之間都有2個保守的酪氨酸殘基。除了這2個保守的酪氨酸殘基，黎豆夜蛾核型多角體病毒（Anticarsia gemmatalis NPV，簡稱AgNPV）、HearGV、XecnGV的CTLs還有1個酪氨酸殘基，其位置與Ⅰ型CTLs中的一致。此外，在HearGV CTL、黃杉毒蛾核型多角體病毒（Orgyia pseudotsugata MNPV，簡稱 OpMNPV）CTL-2的C1之前還有1個額外的酪氨酸殘基（圖1）。

2.4Ⅰ型、Ⅱ型CTLs成熟肽的理化性質

本研究對Ⅰ型、Ⅱ型CTLs的凈電荷、等電點、疏水性氨基酸含量等理化性質進行了比較分析，表3結果顯示，Ⅰ型CTL在pH值7.0時凈電荷范圍為-4.10～-3.10（平均值為-3.56），等電點（pI）范圍為3.69～3.96（平均值為 3.86），疏水性氨基酸占26.7%～30.0%（平均值為 29.7%）；而Ⅱ型CTLs在pH值7.0時凈電荷為-0.11～+1.89（平均值為+0.507），pI值為6.88～8.01（平均值為7.32），疏水性氨基酸占17.2%～28.6%（平均值為 21.3%）。本結果表明，桿狀病毒Ⅰ型、Ⅱ型CTLs的理化性質存在明顯差異，這暗示2類CTLs在功能上可能存在分化。

注：括號內數(shù)據為平均值。AcCTL為苜蓿尺蠖核型多角體病毒CTL；ClbiCTL為豆天蛾核型多角體病毒CTL；SacyCTL-1、SacyCTL-2為蓖麻蠶核型多角體病毒CTL-1、CTL-2；AhIAAI為千穗谷（Amaranthus hypochondriacus）α-淀粉酶抑制劑；GsGUR為匙羹藤（Gymnema sylvestre）甜味抑制蛋白gurmarin；MjTI1為紫茉莉（Mirabilis jalapa）胰蛋白酶抑制劑；AsAST-A為海洋生物Asteropus simplex抗菌肽；MVⅡA為芋螺毒素ω-MVⅡA；AlALO1為長臂天牛（Acrocinus longimanus）抗菌肽；MdPOI為家蠅（Musca domestica）酚氧化酶抑制劑；PaAMP1為美洲商陸（Phytolacca americana）抗菌肽；HWTX-X為虎紋蜘蛛（Ornithoctonus huwena）毒素Huwentoxin-X。

2.5桿狀病毒CTLs與ICK家族的比較分析

桿狀病毒CTLs屬于抑制劑半胱氨酸結（inhibitor cystine knot，簡稱ICK）家族，多序列分析表明，桿狀病毒CTLs與芋螺毒素ω-MⅦA、虎紋蜘蛛毒素HWTX-X、紫茉莉胰蛋白酶抑制劑MjTI1、匙羹藤甜味抑制蛋白GsGUR、美洲商陸抗菌肽PaAMP1、家蠅酚氧化酶抑制劑MdPOI等具有相同的二硫鍵骨架，但氨基酸序列一致性較低，僅為16.7%～33.3%（圖3）。

在理化性質方面，AhIAAI、GsGUR、MjTI1、AsAST-A等都帶負電荷，等電點分別為6.06、4.97、4.81、3.04， 疏水性氨

基酸含量分別為9.4%、25.7%、24.3%、44.4%；而ω-MⅦA、AlALO1、MdPOI、PaAMP1、HWTX-X等都帶正電荷，等電點為8.00～8.53，疏水性氨基酸含量分別為6.7%、11.8%、23.7%、21.1%、14.3%（表3）。由此可見，不同的ICK家族成員在理化性質上存在較大差異，不過桿狀病毒Ⅰ型CTLs的凈電荷（平均值為-3.56）、等電點（平均值為3.86）與 MjTI1、AsAST-A、GsGUR等比較接近。

3討論與結論

抑制劑半胱氨酸結家族，又稱knottin家族，該家族是由富含半胱氨酸殘基的小分子蛋白質組成，廣泛存在于各種動物、植物和微生物中[6]。研究發(fā)現(xiàn)，海洋生物芋螺中的芋螺毒素屬于ICK家族。在ICK家族中，HWTX-X、Pa-AMP、MdPOI等大量成員都與芋螺毒素ω-MⅦA具有相同的二硫鍵骨架，即C1-C2-C3C4-C5-C6。這些類MⅦA（MⅦA-like）蛋白往往具有復雜的生物學功能，例如，HWTX-X是虎紋蜘蛛產生的一種神經毒素，在捕食過程中發(fā)揮作用[7]。PaAMP1是從美洲商陸種子中分離的抗菌肽，對多種真菌和革蘭氏陽性菌具有明顯的抑制活性[8]。MdPOI是從家蠅蛹中發(fā)現(xiàn)的酚氧化酶抑制劑（phenoloxidase inhibitor，簡稱POI），對家蠅幼蟲的酚氧化酶具有顯著的抑制作用[9-10]。從二硫鍵骨架看，桿狀病毒CTLs也屬于ICK家族中類MⅦA蛋白。桿狀病毒CTLs很少帶有正電荷，而帶正電荷氨基酸對芋螺毒素的鎮(zhèn)痛功能是必需的，因此，盡管最初桿狀病毒CTLs因與芋螺毒素具一定的同源性而被命名，但是桿狀病毒CTLs并不像芋螺毒素那樣具有鎮(zhèn)痛活性（筆者的相關研究數(shù)據未發(fā)表）。另外，曹青等已證實，AcMNPV CTL對金黃色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢桿菌等多種臨床致病菌的生長有顯著抑制功能，目前尚不明確抑菌活性對于桿狀病毒的生物學意義[4]。還有研究發(fā)現(xiàn)，AcMNPV CTL具有酚氧化酶抑制活性，能阻止昆蟲血液的黑化[5]。

昆蟲酚氧化酶不僅在昆蟲發(fā)育過程中具有重要的生理功能，如參與表皮的鞣化、硬化、傷口愈合等，還在昆蟲免疫防御反應中起著重要作用，它可使病原微生物表面產生黑色素沉淀，通過黑色素包囊反應來隔離和抵抗病原物，并在黑色素形成過程中產生醌及其衍生物，導致活性氧的積累，從而對病原物起到殺傷作用[11]。已有研究表明，昆蟲酚氧化酶與黑化幼蟲表現(xiàn)出的較強的桿狀病毒抗性有關[12]。Trudeau等用 AcMNPV 感染美洲棉鈴蟲時發(fā)現(xiàn)，氣管上皮細胞的感染位點上出現(xiàn)了酚氧化酶介導的黑化及包囊反應[13]。由此可見，昆蟲酚氧化酶在宿主防御桿狀病毒的過程中發(fā)揮著重要作用。昆蟲體內存在內源性酚氧化酶抑制劑，能在納摩爾（nmol）水平上高效地競爭性抑制酚氧化酶活性[9]。Cao等的研究表明，AcMNPV CTL是病毒來源的酚氧化酶抑制劑，它可能在一定程度上能抑制昆蟲宿主對桿狀病毒的防御反應[5]。

Daquinag等對家蠅MdPOI的氨基酸序列及蛋白質結構進行解析發(fā)現(xiàn)，MdPOI成熟肽由38個氨基酸殘基組成，富含半胱氨酸、賴氨酸，其中6個半胱氨酸形成3對二硫鍵（C1—C2—C3C4—C5—C6），且在C5～C6之間的酪氨酸殘基（Y）經羥化修飾為多巴殘基，該位點與酚氧化酶抑制劑的競爭性抑制活性有重要關系[10]。本研究將桿狀病毒CTLs分為2類，即Ⅰ型CTLs、Ⅱ型CTLs，其中Ⅰ型CTLs在C5～C6之間也都有1個保守的酪氨酸殘基，目前尚不清楚該位點是否存在羥化修飾，而大部分Ⅱ型CTLs在C2～C3之間有2個保守的酪氨酸殘基。另外，與Ⅰ型CTLs類似，3個Ⅱ型CTLs（AgNPV CTL、HearGV CTL和XecnrGV CTL）在C5～C6之間還有1個酪氨酸殘基。目前尚不清楚Ⅱ型CTLs是否也具有酚氧化酶抑制活性。此外，在蛋白質疏水性、電荷特性等方面，Ⅱ型CTLs與Ⅰ型CTLs存在明顯差異，由此推測，Ⅱ型CTLs的功能可能不同于Ⅰ型CTLs，這有待進一步研究。

參考文獻：

[1]Puillandre N，Watkins M，Olivera B M. Evolution of Conus peptide genes：duplication and positive selection in the A-superfamily[J]. Journal of Molecular Evolution，2010，70（2）：190-202.

[2]Eldridge R，Li Y，Miller L K. Characterization of a baculovirus gene encoding a small conotoxinlike polypeptide[J]. Journal of Virology，1992，66（11）：6563-6571.

[3]盧玉蓉，馮樅棣，吳東，等. 含外源類蝸牛毒素基因的AcMNPV的蟲體感染性研究[J]. 中國病毒學，2004，19（3）：276-280.

[4]曹青，吳巖，劉永，等. AcMNPV類芋螺毒素多肽的抗菌活性分析[J]. 生物學雜志，2012，29（6）：29-31.

[5]Cao Q，Zhu S Y，Wu Y，et al. The effect of a small conotoxin-like ctx gene from Autographa californica nuclear polyhedrosis virus （AcMNPV） on insect hemolymph melanization[J]. Polish Journal of Microbiology，2012，61（3）：183-189.

[6]Gracy J，Le-Nguyen D，Gelly J C，et al. KNOTTIN：the knottin or inhibitor cystine knot scaffold in 2007[J]. Nucleic Acids Research，2008，36（SI）：D314-D319.

[7]Liu Z，Dai J，Dai L，et al. Function and solution structure of Huwentoxin-X，a specific blocker of N-type calcium channels，from the Chinese bird spider Ornithoctonus huwena[J]. The Journal of Biological Chemistry，2006，281（13）：8628-8635.

[8]Liu Y，Luo J，Xu C，et al. Purification，characterization，and molecular cloning of the gene of a seed-specific antimicrobial protein from pokeweed[J]. Plant Physiology，2000，122（4）：1015-1024.

[9]Tsukamoto T，Ichimaru Y，Kanegae N，et al. Identification and isolation of endogenous insect phenoloxidase inhibitors[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1992，184（1）：86-92.

[10]Daquinag A C，Nakamura S，Takao T，et al. Primary structure of a potent endogenous dopa-containing inhibitor of phenol oxidase from Musca domestica[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1995，92（7）：2964-2968.

[11]Nappi A J，Christensen B M. Melanogenesis and associated cytotoxic reactions：applications to insect innate immunity[J]. Insect Biochem Mol Biol，2005，35（5）：443-459.

[12]Reeson A F，Wilson K，Gunn A，et al. Baculovirus resistance in the noctuid Spodoptera exemptais phenotypically plastic and responds to population density[J]. Proceedings of the Royal Society B，1998，265：1787-1791.

[13]Trudeau D，Washburn J O，Volkman L E. Central role of hemocytes in Autographa californica M nucleopolyhedrovirus pathogenesis in Heliothis virescens and Helicoverpa zea[J]. Journal of Virology，2001，75（2）：996-1003.