陳鳳英　江歡　吳巧珠

【摘要】 目的 研究凋亡抑制基因survivin與稽留流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。方法 30例稽留流產(chǎn)排除胚胎染色體異常者為研究組， 正常早孕要求行人工流產(chǎn)患者30例為對(duì)照組。根據(jù)免疫組化結(jié)果分析survivin在稽留流產(chǎn)及正常早孕患者絨毛、蛻膜survivin表達(dá)情況以及兩組患者細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中survivin陽(yáng)性表達(dá)情況。結(jié)果 survivin主要在細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、部分容貌間質(zhì)細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞等位置， 呈核/漿表達(dá)， 在子宮內(nèi)膜腺體中也較為常見(jiàn)， 呈胞漿陽(yáng)性狀態(tài)。研究組患者絨毛survivin表達(dá)為（160.28±21.34）， 蛻膜survivin表達(dá)為（167.52±16.78）， 均顯著高于對(duì)照組患者， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中， 研究組患者survivin陽(yáng)性表達(dá)分別為（6.42±3.16）%和（4.93±3.68）%， 均低于對(duì)照組患者， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 在稽留流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制中， 凋亡抑制基因survivin具有較大的相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 凋亡抑制基因survivin；稽留流產(chǎn)；發(fā)病機(jī)制；相關(guān)性研究

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.18.035

稽留流產(chǎn)也叫做過(guò)期流產(chǎn)， 指的是胎兒或胚胎死亡后， 在宮內(nèi)未及時(shí)排出。近年來(lái)， 稽留流產(chǎn)的發(fā)病幾率整逐漸上升， 對(duì)孕產(chǎn)婦的身心健康、家庭穩(wěn)定等， 都造成了不良的影響。目前， 對(duì)于稽留流產(chǎn)的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全清除， 相關(guān)研究認(rèn)為， 稽留流產(chǎn)的發(fā)病， 可能與凋亡抑制基因survivin存在一定的關(guān)系。基于此， 本文選擇稽留流產(chǎn)排除胚胎染色體異常者30例及正常早孕要求行人工流產(chǎn)患者30例作為研究對(duì)象， 研究了凋亡抑制基因survivin與稽留流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性問(wèn)題?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2015年1月～2016年12月稽留流產(chǎn)排除胚胎染色體異常者30例作為研究組， 停經(jīng)時(shí)間6～10周， 平均時(shí)間（8.6±2.2）周， 年齡20～35歲， 平均年齡（27.9±3.3）歲，

尿人絨毛膜促性腺激素（HCG）呈陽(yáng)性， B超檢查無(wú)胎心搏動(dòng)， 根據(jù)婦產(chǎn)科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢查， 診斷患者均為稽留流產(chǎn)患者。選擇同期正常早孕要求行人工流產(chǎn)患者30例作為對(duì)照組， 停經(jīng)時(shí)間6～10周， 平均時(shí)間（8.3±1.9）周， 年齡21～37歲， 平均年齡（28.1±2.7）歲， 尿HCG呈陽(yáng)性， B超顯示有胎心搏動(dòng)。兩組患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 方法 稽留流產(chǎn)患者排胎后及正常早孕者行人工流產(chǎn)后， 分別選取絨毛組織各分成3小份， 注意避開(kāi)出血、壞死及鈣化部位。1份置于4%多聚甲醛中保存固定， 待制備石蠟切片行免疫組化檢查， 其余2份用以后續(xù)實(shí)驗(yàn)的mRNA及western blot檢測(cè)。采用免疫組化法觀察survivin在兩組患者絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞上的表達(dá)， 首先進(jìn)行石蠟包埋， 常規(guī)HE染色， 石蠟切片依次二甲苯、梯度酒精脫蠟至水， 置于檸檬酸鹽緩沖液中放于微波爐， 中火煮沸15 min， 待其自然冷卻后， 將切片取出， 以0.1 M的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2 min×3次[1]。加3%過(guò)氧化氫， 封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶， 室溫10 min， 0.1 M的PBS洗

2 min×3次。滴加一抗小鼠抗人單克隆抗體（1：200）4℃， 過(guò)夜。室溫復(fù)溫40 min， 0.1 M的PBS洗2 min×3次。滴加聚合物輔助劑， 室溫20 min， 0.1 M的PBS洗2 min×3次。滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔/小鼠免疫球蛋白（Ig）G多聚體， 室溫30 min，

0.1 M的PBS洗2 min×3次。DAB顯色， 鏡下控制顯色時(shí)間， 自來(lái)水洗滌中止顯色。蘇木素復(fù)染， 以鹽酸酒精分化。梯度酒精脫水、二甲苯透明， 封片[2]。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩組患者絨毛組織內(nèi)survivin mRNA的表達(dá)水平， 總RNA提取， 去基因組， RNA純度及完整性檢測(cè)， 逆轉(zhuǎn)錄， 30℃保溫10 min， 42℃保溫60 min， 72℃保溫10 min。定量PCR， 應(yīng)用相對(duì)定量比較CT值法（2-ΔΔCt法）分析PCR結(jié)果[3]。采用Western blot檢測(cè)兩組患者絨毛組織內(nèi)survivin蛋白的表達(dá)水平， 絨毛組織內(nèi)細(xì)胞總蛋白提取及定量， SDS-PAGE膠制作， 加樣電泳并轉(zhuǎn)膜封閉， 然后進(jìn)行孵育一抗及孵育二抗， 采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影， 應(yīng)用Bio-Rad Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析[4]。

1. 3 觀察指標(biāo) 觀察survivin分布情況；根據(jù)免疫組化結(jié)果分析survivin在稽留流產(chǎn)及正常早孕患者絨毛、蛻膜survivin表達(dá)情況以及兩組患者細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中survivin陽(yáng)性表達(dá)情況。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

survivin主要在細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、部分容貌間質(zhì)細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞等位置， 呈核/漿表達(dá)， 在子宮內(nèi)膜腺體中也較為常見(jiàn)， 呈胞漿陽(yáng)性狀態(tài)。研究組患者絨毛survivin表達(dá)為（160.28±21.34）， 蛻膜survivin表達(dá)為（167.52±16.78）， 均顯著高于對(duì)照組患者， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中， 研究組患者survivin陽(yáng)性表達(dá)分別為（6.42±3.16）%和（4.93±3.68）%， 均低于對(duì)照組患者， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

稽留流產(chǎn)是一種較為常見(jiàn)的疾病， 在單胎妊娠10～14周時(shí)， 發(fā)病幾率約在2%左右。相關(guān)研究表明[5]， 稽留流產(chǎn)的發(fā)病可能與胚胎染色體異常、母體免疫反應(yīng)及內(nèi)分泌疾病、感染、環(huán)境、母體精神壓力及不良生活習(xí)慣等因素相關(guān)。另外， 有研究認(rèn)為凋亡抑制基因survivin與稽留流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[6]。survivin是一種凋亡抑制蛋白， 作為抗凋亡基因具有廣泛的分布， 能夠?qū)Χ喾N刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡進(jìn)行抑制， 在細(xì)胞正常生理活動(dòng)中， 發(fā)揮著重要的作用。survivin具有較高的表達(dá)特異性， 通常只在胚胎組織、腫瘤組織中表達(dá)[7-10]。通常認(rèn)為， 在過(guò)期妊娠、子癇前期、絨癌、葡萄胎等婦科疾病當(dāng)中， survivin表達(dá)異常都具有一定的影響?；袅鳟a(chǎn)是一種早孕期病理妊娠， 其發(fā)病機(jī)制和母胎界面微環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞相關(guān)。而在母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞中， survivin則具有廣泛的表達(dá)。

survivin作為一種結(jié)構(gòu)特殊的凋亡抑制蛋白， 能夠發(fā)揮出調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂、抑制細(xì)胞凋亡等作用。survivin可在細(xì)胞漿中通過(guò)多種方式與Caspase-3、Caspase-7等進(jìn)行結(jié)合， 對(duì)凋亡過(guò)程進(jìn)行阻斷。survivin可在細(xì)胞核中與CDK4進(jìn)行結(jié)合， 從CDK4復(fù)合體中將癌基因蛋白質(zhì)P21釋放出來(lái)， P21可與線粒體Caspase-3相結(jié)合， 對(duì)其活性進(jìn)行抑制， 并對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行組織。經(jīng)本文研究結(jié)果正是， 適量的survivin能夠有效抑制凋亡， 確保滋養(yǎng)層細(xì)胞穩(wěn)定分化， 對(duì)于滋養(yǎng)層細(xì)胞胎盤血管重鑄有著較大幫助。

綜上所述， 在稽留流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制中， 凋亡抑制基因survivin具有較大的相關(guān)性， 同時(shí)對(duì)疾病具有一定的潛在的調(diào)控機(jī)制。

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[收稿日期：2017-03-16]