趙冀，周超，李宏敏

（四川省人民醫(yī)院 1.器官移植中心，2.消化內(nèi)科，3.腫瘤科，四川 成都 610072）

肝細(xì)胞癌患者CNTN1檢測(cè)的臨床意義

趙冀1，周超2，李宏敏3

（四川省人民醫(yī)院 1.器官移植中心，2.消化內(nèi)科，3.腫瘤科，四川 成都 610072）

目的 檢測(cè)肝細(xì)胞癌（HCC）患者腫瘤組織中接觸蛋白1（CNTN1）的表達(dá)水平，及其對(duì)患者疾病預(yù)后價(jià)值的分析。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和Western blot檢測(cè)25例新鮮HCC樣本，以及鄰近非腫瘤組織中CNTN1 mRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)135例石蠟包埋HCC樣本與鄰近非腫瘤組織中CNTN1的蛋白表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析其表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系，采用RNAi技術(shù)干擾肝癌細(xì)胞系HepG2 CNTN1的表達(dá)，對(duì)其進(jìn)行腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力檢測(cè)。結(jié)果25例新鮮HCC樣本qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與鄰近非腫瘤組織相比，HCC組織中CNTN1 mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)法結(jié)果證實(shí)62.22%（84/135）HCC樣本為CNTN1陽(yáng)性，高于鄰近非腫瘤組織17.78%（24/135）（P＜0.05）。Kaplan–Meier生存分析表明，CNTN1陽(yáng)性HCC患者無(wú)疾病生存率和總生存率低于陰性患者。CNTN1表達(dá)與HCC患者腫瘤轉(zhuǎn)移、乙型肝炎病毒感染、淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移分期及腫瘤直徑相關(guān)（P＜0.05）。RNAi實(shí)驗(yàn)表明，干擾CNTN1表達(dá)后HepG2細(xì)胞活力下降（P＜0.05）。多重變量分析表明，CNTN1表達(dá)是HCC患者無(wú)疾病生存期和總生存期的獨(dú)立標(biāo)志物（P＜0.05）。結(jié)論HCC患者腫瘤組織中CNTN1蛋白表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)與腫瘤惡性狀態(tài)密切相關(guān)，參與肝細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，可以作為HCC患者疾病預(yù)后的獨(dú)立標(biāo)志物。

接觸蛋白1；肝細(xì)胞癌；預(yù)后；生物標(biāo)志物

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在全球常發(fā)惡性腫瘤中排第5位，在腫瘤病死率排第3位[1]。我國(guó)乙肝患者數(shù)量較多，導(dǎo)致肝細(xì)胞癌高發(fā)[2]。術(shù)后復(fù)發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致HCC患者疾病預(yù)后不良的主要因素[3]。接觸蛋白 1（contactin 1，CNTN1）是免疫球蛋白超家族成員，屬于糖基磷脂酰肌醇錨定的神經(jīng)細(xì)胞黏附分子。報(bào)道表明，CNTN1在胃癌、肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，且與上述腫瘤患者疾病發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-6]。目前CNTN1在肝細(xì)胞癌中研究報(bào)道較少，本研究旨在檢測(cè)HCC組織中CNTN1的表達(dá)水平及其對(duì)患者疾病預(yù)后價(jià)值的分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月-2012年12月四川省人民醫(yī)院收治的135例肝細(xì)胞癌患者，取其石蠟樣本及相應(yīng)的臨近非腫瘤組織樣本（距離腫瘤組織＞2 cm）。25例新鮮樣本采集后液氮浸泡，分別用于提取總RNA和蛋白。本研究納入患者均通過(guò)病理檢查確診，臨床樣本采集及后續(xù)研究均獲得患者同意和本院醫(yī)學(xué)倫理審查。通過(guò)病歷獲取患者一般資料。

1.2 細(xì)胞及RNAi實(shí)驗(yàn)

人肝癌細(xì)胞（human hepatocellular carcinoma cell，HepG2）購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所，常規(guī)方法培養(yǎng)[7]。分為正常組與RNAi組，RNAi組干擾前將HepG2按2×105個(gè)/孔，鋪6孔板，換無(wú)血清改良培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合度達(dá)40%時(shí)進(jìn)行干擾。根據(jù)Lipofectamine說(shuō)明書將siRNA duplex-Lipofectamine RNAi MAX加入培養(yǎng)基。孵育4 h后，換成含10%胎牛血清培養(yǎng)基，干擾后測(cè)定細(xì)胞活力。CNTN1靶標(biāo)siRNA和陰性對(duì)照siRNA購(gòu)自上?；蛑委熡邢薰尽iRNA正向引物：5'-GAUGGAAAGUGAGGAAGACAGUAAU-3'，反向引物：5'-AUUACUGUCU UCCUCACUUUCCAUC-3'；陰性對(duì)照RNA正向引物：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'， 反 向引物：5'-AUUACUGUCUUCCUCACUUUCCAUC-3'。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

采用Trizol方法提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度后，取2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。采用SYBR green染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 檢測(cè)，CNTN1 正向引物：5'-CCTAGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3'，反向引物：5'-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3'。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因?yàn)閮?nèi)參，GAPDH 正向引物：5'-CCTAGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3'，反向引 物 ：5'-GCCAGTAGA GGCAGGGATGATGTTC-3'。擴(kuò)增條件及計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[8]。

1.4 Western blot檢測(cè)

常規(guī)方法提取組織總蛋白，二喹啉甲酸方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量后，進(jìn)行凝膠電泳，上樣20μg/孔，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯薄膜上后，3%脫脂奶封閉2 h，分布孵育抗人CNTN1和GAPDH一抗，4℃孵育過(guò)夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）洗膜，孵育二抗后顯影。采用Quantity one軟件對(duì)條帶亮度進(jìn)行分析。

1.5 免疫組織化學(xué)法

采用常規(guī)方法制備5 μm厚的石蠟切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)法染色，在10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）熱激30 min介導(dǎo)抗原復(fù)性，采用抗CNTN1單克隆抗體孵育，4℃過(guò)夜。洗滌后孵育二抗，加顯色液后進(jìn)行曝光。根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行判定，總分0～3分，0分為無(wú)染色，1分為弱染色，2分為中度染色，3分為強(qiáng)染色。

1.6 細(xì)胞活力檢測(cè)

取1.2中干擾后的HepG2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，按1×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60%時(shí)，換為無(wú)血清的達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM），分別培養(yǎng)8、24、48和 72 h后，按照 Presto blue cell viability rgnt試劑盒（南京科佰生物科技有限公司）加入Presto Blue試劑，二氧化碳CO2培養(yǎng)箱37℃孵育10 min，取出96孔板酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用獨(dú)立t檢驗(yàn)或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析；計(jì)數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗(yàn)；總生產(chǎn)率與無(wú)疾病生存率的評(píng)估用Kaplan-Meier檢驗(yàn)，兩組生存曲線的比較用Log-rank檢驗(yàn)，多重變量分析用Cox比例危險(xiǎn)模型進(jìn)行，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組與RNAi組不同時(shí)間細(xì)胞活力的比較

正常組與RNAi組在8、24、48和72 h細(xì)胞活力比較，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.841，P=0.000）；②正常組與RNAi組細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（除8 h時(shí)間）（F=91.561，P=0.000）。③正常組和RNAi組細(xì)胞活力變化趨勢(shì)有差異（F=15.215，P=0.000）。見(jiàn)表 1 和圖 1。

2.2 CNTN1 mRNA和蛋白的比較

圖1 HepG2細(xì)胞活力

采用qRT-PCR檢測(cè)25對(duì)肝細(xì)胞癌樣本和臨近非腫瘤組織樣本，肝細(xì)胞癌CNTN1 mRNA表達(dá)量為（7.22±1.85），與非腫瘤組織（2.81±1.42）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=0.236，P=0.003）；Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，肝細(xì)胞癌CNTN1蛋白表達(dá)量為（1.32±0.61），與非腫瘤組織（0.83±0.50）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.416，P=0.003），肝細(xì)胞癌高于與非腫瘤組織。見(jiàn)圖2、3。

表1 兩組不同時(shí)間細(xì)胞活力比較 （±s）

表1 兩組不同時(shí)間細(xì)胞活力比較 （±s）

注：?與正常組比較，P＜0.05

組別72 h正常組 470.00±13.64 820.00±23.64 1320.00±39.69 2120.00±43.64 RNAi組 468.00±13.89 482.00±25.67? 760.00±30.64? 96.00±33.56?8 h 24 h 48 h

圖2 CNTN1 mRNA和蛋白的表達(dá)

2.3 CNTN1表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)135例HCC樣本CNTN1蛋白的表達(dá)，62.22%（84/135）HCC 樣本為CNTN1陽(yáng)性，高于臨近非腫瘤組織的17.78%（24/135）（χ2=55.556，P=0.005）。CNTN1 表達(dá)與 HCC 患者腫瘤轉(zhuǎn)移、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（tumor node metastasis，TNM）分期及腫瘤直徑相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表2和圖4。

2.4 CNTN1表達(dá)與HCC患者疾病預(yù)后的關(guān)系

圖3 CNTN1蛋白的表達(dá)

表2 患者臨床病理特征與HCC樣本CNTN1表達(dá)的關(guān)系

圖4 HCC樣本中CNTN1的表達(dá)（免疫組織化學(xué)法×400）

為進(jìn)一步探討HCC樣本中CNTN1表達(dá)與患者疾病預(yù)后的關(guān)系，采用Kaplan-Meier生存曲線分析其表達(dá)與患者隨訪總生存率及無(wú)疾病生存期的關(guān)系。CNTN1陽(yáng)性HCC患者的總生存期（19.96±9.39）個(gè)月低于陰性患者[（31.27±11.45）個(gè)月]（P=0.006）。此外CNTN1陽(yáng)性HCC患者的無(wú)疾病生存期（13.61±8.63）個(gè)月低于陰性患者[（24.51±10.41）個(gè)月]（P=0.003）。多重變量分析表明，CNTN1表達(dá)是HCC 患者總生存期[HR=2.383（95%CI：1.262，4.503）P=0.003]和無(wú)疾病生存期[HR=2.356（95%CI：1.370，4.049）P=0.003]的獨(dú)立預(yù)后因素。見(jiàn)圖5。

圖5 HCC患者CNTN1表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線分析

3 討論

CNTN1與多種細(xì)胞表面蛋白相互作用，可能參與多種細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]，其作為神經(jīng)系統(tǒng)黏附分子，也參與腫瘤細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3信號(hào)通路。研究表明，CNTN1參與多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)，CNTN1基因敲除后能導(dǎo)致肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制，增加負(fù)瘤小鼠的存活率[10]。CNTN1的腫瘤調(diào)節(jié)作用在多數(shù)人類惡性腫瘤中均有報(bào)道，而其在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用研究較少。

本研究表明，HCC樣本中CNTN1 mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)。RNAi實(shí)驗(yàn)表明，HepG2細(xì)胞在干擾CNTN1表達(dá)后，細(xì)胞活力下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CNTN1表達(dá)上調(diào)與HCC患者腫瘤轉(zhuǎn)移、HBV感染、TNM分期及腫瘤直徑相關(guān)。此外，免疫組織化學(xué)法染色證實(shí)CNTN1陽(yáng)性患者的總生存率和無(wú)疾病生存率低于CNTN1陰性患者，CNTN1表達(dá)是HCC患者疾病預(yù)后不良獨(dú)立標(biāo)志物。

盡管文獻(xiàn)和本研究數(shù)據(jù)均證實(shí)CNTN1能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，但是其中的調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不清楚，筆者推測(cè)CNTN1可能通過(guò)激活A(yù)kt途徑促進(jìn)HCC發(fā)展。YAN等[6]采用A549細(xì)胞證實(shí)，CNTN1能使E-鈣黏著糖蛋白表達(dá)下調(diào)，且Akt激活在CNTN1下調(diào)E-鈣黏著糖蛋白表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)有研究表明，HCC腫瘤中PI3K-Akt-mTOR信號(hào)途徑異常[11-13]。ZHOU等[14]研究表明，上述通路異常常導(dǎo)致HCC患者疾病預(yù)后不良。

本研究結(jié)果證實(shí)，HCC患者腫瘤組織中CNTN1蛋白表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)與腫瘤惡性狀態(tài)相關(guān)，參與肝細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，可以作為HCC患者疾病預(yù)后的獨(dú)立標(biāo)志物。

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（童穎丹 編輯）

Feasibility of contactin 1 as a novel prognostic marker for hepatocellular carcinoma

Ji Zhao1,Chao Zhou2,Hong-min Li3
(1.Organ Transplantion Center;2.Department of Gastroenterology;3.Department of Oncology,Sichuan Provincial People's Hospital,Chengdu,Sichuan 610072,China)

ObjectiveTo evaluate the feasibility of contactin 1 (CNTN1)as a novel prognostic marker for epithelial hepatocellular carcinoma.MethodsqRT-PCR and Western blot were performed to assess the mRNA and protein levels of CNTN1 in 25 matched fresh HCC specimens.The clinical and prognostic significance of CNTN1 in 135 cases of HCC was determined by immunohistochemistry.The correlations between CNTN1 expression and clinicopathological characteristics were analyzed.The expression of CNTN1 in HepG2 cells was interfered by RNAi technique,then the invasive and metastatic abilities of the HepG2 cells were determined.ResultsCNTN1 expression in the fresh HCC tissues was higher than that in the paracancerous tissues at both mRNA and protein levels(P＜0.05).Notably,immunohistochemical results revealed that CNTN1 expression significantly increased in the HCC compared to the adjacent tissues (62.22%vs 17.78%,P＜0.05).The vitality of HepG2 cells was significantly decreased after RNA interference (P＜0.05).Furthermore,positive CNTN1 expression was associated with tumor size,HBV infection,metastasis,and tumor-node-metastasis stage (P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis showed that high CNTN1 was correlated with reduced overall survival(OS)rate(P＜0.05)and disease-free survival(DFS)rate(P＜0.05).Multivariate analysis identified CNTN1 as an independent poor prognostic factor of OS and DFS in HCC patients (P＜0.05).ConclusionsOur resultssuggest that CNTN1 expression is up-regulated in HCC and closely correlated with the invasion and metastasis of HCC.It can be served as an independent unfavorable prognostic marker for HCC.

contactin 1;hepatocellular carcinoma;prognosis,biomarker

R735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.010

1005-8982（2017）12-0050-05

2016-06-29