核酶的發(fā)現及其在基因治療中的應用

周耕民， 刁勇， 李三暑

(華僑大學 生物醫(yī)學學院， 福建 泉州 362021)

核酶的發(fā)現及其在基因治療中的應用

周耕民， 刁勇， 李三暑

(華僑大學 生物醫(yī)學學院， 福建 泉州 362021)

核酶是具有催化功能的結構性RNA分子，且大多數核酶具有剪切RNAs的功能，可以利用它們剪切信使RNA(mRNAs)調節(jié)基因表達，從而作為基因治療的新手段.闡述核酶的發(fā)現歷程，以及其在艾滋病、肝炎、腫瘤和生殖道系統(tǒng)感染等基因治療的研究進展.最后，分析核酶在基因治療中的技術優(yōu)勢及存在問題，并對核酶領域包括更多核酶晶體結構的確立、酶切機理的理解、核酶新的生物學功能的發(fā)現等研究進行展望. 關鍵詞： 核酶； 非編碼RNA； 基因治療； 基因表達； 剪切RNA

1 核酶的發(fā)現

核酶是具有催化功能的RNA分子[1]，在生物界中執(zhí)行著非常重要的生物功能，如核糖體RNA(rRNA)和RNase P分別可以合成氨基酸和加工tRNA的前體[2-3].迄今為止，已證實自然發(fā)生的核酶種類有14 類.由于大多核酶具有剪切RNA的功能，可利用其對靶標RNA進行切割，從而控制基因的表達.核酶的研究已有30多年的歷史.在1980-1990年的10 a間共發(fā)現了7類，分別是Group Ⅰ[4]，Group Ⅱ[5]，Rnase P[3]，Hammerhead[6]，Hairpin[7-8]，HDV[9]，Neurospora VS[10]；在1991-2013年的近25 a間僅發(fā)現了3 類，分別是GIRI[11]，ribosomal RNA[12]，glmS[13].在2014-2015年的兩年間，Breaker實驗室發(fā)現了4 類自我剪切的核酶，分別是Twister[14]，Twister Sister[15]，Hatchet[15-16]，Pistol[15，17]，并且Steitz實驗室和另外幾個實驗室根據這些發(fā)現，確立其中兩類核酶的晶體結構[18-19].

大多數核酶具有自我剪切的功能，因此，大多數核酶是通過它們的剪切產物被發(fā)現的.如Group Ⅰ內含子就是從26S rRNA前體的“隱藏的剪切”產物中被發(fā)現的[4]；Neurospora VS核酶是在線粒體RNA的剪切條帶中被發(fā)現的[10]；當病毒采用滾環(huán)復制策略進行復制時，有的核酶作為病毒RNA的一部分發(fā)生剪切，把多聚的病毒RNA剪切成單位長度的病毒個體，因而被觀察到[20]，如Hammerhead和Hairpin核酶就是在煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA(satellite RNA of tobacco ringspot virus)的復制中被觀察到的[6-8]；HDV核酶也是在肝病病毒的復制中被發(fā)現的[9].另外，glmS核酶是在發(fā)現核糖開關的過程中被意外發(fā)現的，它既是一個核酶，也是一個核糖開關[13].由此可見，這些發(fā)現帶有比較大的偶然性，經常是在RNA放射性標記、PAGE膠分離和純化的過程中通過剪切產物被偶然發(fā)現的.

最近，Breaker實驗室發(fā)現4類自我剪切的核酶[14-17].先是通過生物信息學發(fā)現許多結構性的RNA，但由于單從RNA二級結構上很難判斷它們是否具有核酶的功能，因此，又結合包括合成、放射性標記、膠分離等生物化學方法檢測到核酶.這種方法雖然費時費力，但發(fā)現方法顯然有很大提高.

2 核酶在基因治療中的應用

由于核酶具有切割RNA的功能，可以利用它們來切割目標RNA，降低基因的表達.Sarver等[21]把加工過的錘頭狀核酶的催化鏈部分與底物部分的HIV-1 GAG RNA相混合，發(fā)現這個核酶能切割目標GAG RNA，且在細胞內也能切割.這一實驗證明利用核酶來開發(fā)抗人類免疫缺陷病毒(HIV)的基因治療是可行的.此后，核酶已經應用于許多疾病包括艾滋病、肝炎、腫瘤和生殖道系統(tǒng)感染等的基因治療研究中[21-31].

2.1 核酶在抗艾滋病中的應用

艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征，是由于HIV(human immunodeficiency virus)病毒侵入人體并強烈破壞體內的免疫系統(tǒng)，引發(fā)各種嚴重的并發(fā)癥.在艾滋病的基因治療研究方面，有針對艾滋病HIV基因的RNA靶標，如Gag[21]，LTR[22]，Pol[23]，Tat[24，32]，Tar[25]，Nef[26]，Env[27，33]；HIV 受體的RNA靶標，如CD4和共受體CCR5[34].雖然靶標不同，但效果都很好，比如靶標Gag mRNA的錘頭狀核酶不僅可以顯著降低Gag mRNA和它編碼的p24抗原，還降低了HIV-1 前病毒DNA 100 倍以上[21].

另外，為了提高酶切的效率，有的科學家還構建了靶標同一基因的不同位點的核酶.Bai等[34]構建能夠在3個位點切割CCR5 mRNA的三聯(lián)體核酶，并將它轉導至CD34+造血祖細胞中，與未經轉導的對照組相比，實驗組感染HIV的比率下降70%.在靶標HIV不同基因的核酶中，靶標Tat的錘頭狀核酶已用于治療艾滋病的臨床一期(10個HIV病人)和二期(74個HIV病人)的實驗[35].試驗結果表明，核酶在艾滋病的基因治療方面有良好的應用前景.

2.2 核酶在抗肝炎中的應用

在乙肝(HBV)、丙肝(HCV)的基因治療研究方面，Welch等[36]用發(fā)夾狀核酶靶向切割pgRNA(pregenomic RNA)和乙肝表面抗原(HBsAg)RNA，通過逆轉錄病毒導入Hub7細胞與HBV共表達后，病毒顆粒減少66%～83%；Tan等[37]將加工過的錘頭狀核酶轉導至PLC/PRF5細胞，特異性地抑制了80%的HBsAg的表達.Dai等[38]用錘頭狀核酶靶標HBV的3個不同靶點，大大降低HBsAg RNA的表達.這3個實驗靶標HBsAg RNA，效果都很好，表明用核酶進行乙肝基因治療是可行的.

賈戰(zhàn)生等[39]用錘頭狀核酶靶向切割丙肝病毒的兩個非編碼區(qū)，發(fā)現核酶能抑制報告基因的表達.Ryu等[40]利用group Ⅰ內含子靶向切割HCV的IRES(核糖體內結合位點)RNA，并導入白喉毒素A基因(diphtheria toxin A)，從而使被HCV病毒感染的細胞發(fā)生凋亡.張文軍等[41-42]、李小英等[43]利用核糖核酸酶P(RNase P)靶標HCV的5′UTR (untranslated region)，可減少HCV RNA約1 000倍.由此說明，用核酶靶標非編碼RNA進行丙肝的基因治療是可行的.

2.3 核酶在抗生殖道系統(tǒng)感染中的應用

據報道，高危人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染與子宮頸癌有密切的聯(lián)系，超過90%的宮頸癌患者被感染了HPV.因此，防治HPV很可能有助于預防宮頸癌，但到目前為止仍沒有治療HPV的有效方法.利用核酶和寡核苷酸來抑制HPV基因的表達成為治療HPV的新方法[44]，主要靶標為E6 mRNA和E7 mRNA.Lu等[45]設計針對編碼HPV-16 E6與E7轉錄產物開放閱讀框(ORF)的特異性核酶，即Rz110與Rz558，并利用腺相關病毒(AAV)作載體轉導至受體細胞，發(fā)現靶標RNA水平明顯降低.Liu等[46]通過分析HPV-6b和11E1 mRNA的同源序列，設計可同時剪切HPV-6b與11E1 mRNA的通用核酶Rz1198；然后，由體外實驗證明Rz1198能夠特異性切割靶標mRNA，降低HPV DNA復制所必須的E1蛋白質的表達.

Zheng等[47]、饒智國等[48-49]構建具有特異性靶向HPV-16 E6和E7轉錄產物的錘頭狀核酶——Rz170，并將其轉染至HPV-16陽性宮頸癌細胞CaSKi.結果表明，E6 mRNA，E7 mRNA和蛋白質的表達顯著降低，c-myc和BCL-2蛋白質也表達下調，而p53和Rb蛋白質的表達上調；受體細胞在體外和體內實驗中的生長均受抑制，凋亡的比率上升，并增強了對化療和放療的敏感度.因此，核酶具有治療宮頸癌的潛力并可與化療或放療進行聯(lián)合治療.

2.4 核酶在抗白血病中的應用

慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一種干細胞來源的白血病，其腫瘤細胞含有費城(Philadelphia)染色體和相關的癌蛋白BCR-ABL1[50].P210蛋白是由BCR-ABL融合基因編碼的，具有異常蛋白酪氨酸激酶活性，是造成 CML的重要因素.為了提高酶切效率,Leopold等[51]合成針對BCR-ABL mRNA的多元核酶(multi-unit ribozyme)，并用脂質體或葉酸-聚賴氨酸(folic acid-polylysine)作載體將核酶轉染至用BCR-ABL融合基因轉化的鼠成髓細胞(32D 細胞).結果表明，該核酶可降低BCR-ABL mRNA達1 000倍.另外，通過優(yōu)化靶標的結合位點也能提高酶切效率.付輝等[52]用構建靶標文庫和逆轉錄相結合的方法篩選靶標跨膜糖蛋白(glycophorin A，GPA)的最佳mRNA結合位點，并用白血病細胞株K562細胞進行驗證，發(fā)現最好的結合位點可下調GPA的基因表達90%.

為了提高酶切的特異性，Kuwabara等[53]構建帶有能識別目標序列(BCR-ABL mRNA)的感應臂(sensor arms)的新核酶.只有在目標序列存在的情況下，它才能與Mg2+結合形成正確的三維空間結構并具活力.該新核酶Maxizyme不但在體外(invitro)，而且在培養(yǎng)的細胞包括源于病人的帶費城染色體的BV173細胞中具有高特異性和酶切活力.Tanabe等[54]進一步將轉導了抗BCR-ABL 核酶后的CML細胞接種到NOD/SCID (非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷)小鼠體內，與對照組相比，實驗組的小鼠在14周后仍然健康存活.由此可見，Maxizyme可完全抑制CML細胞在小鼠體內的浸潤(infiltration).

為了提高轉染效率，Soda等[55]利用VSV-假型慢病毒載體(lentiviral vectors)構建針對ELA2型BCR-ABL mRNA的特異性核酶并轉染至CML細胞.結果顯示，CML細胞中的BCR-ABL mRNA的水平明顯降低，細胞凋亡率升高.為了研究核酶在體外凈化骨髓的作用，吳勇等[56]設計了抗BCR-ABL基因的核酶，轉導至CML和正常骨髓細胞，并檢測核酶對原代CML細胞的影響.結果表明，核酶能顯著抑制腫瘤生長和原代CML細胞中P210融合蛋白的表達，但不影響正常造血祖細胞的生長.在緩解模型中，核酶抑制了K562細胞的增殖和BCR-ABL mRNA的表達，但不影響ABL mRNA的表達.因此，抗BCR-ABL核酶可用于凈化骨髓白血病細胞.

3 核酶在基因治療中的技術優(yōu)勢及面臨的問題

核酶是具有催化功能的RNA分子，大多數具有剪切RNA的功能，在腫瘤和病毒性疾病的基因治療方面極具應用潛力.它的技術優(yōu)勢有如下4點:1) 核酶能夠促使靶基因失活且讓其無法恢復，因為mRNA被剪切之后就無法翻譯出全長的肽鏈，而且它的穩(wěn)定性可能也會降低；2) 核酶能夠在體外進行循環(huán)使用[57]，核酶剪切mRNA后，可以脫離mRNA并找到下一個目標mRNA；3) 核酶直接剪切目標RNA，而不需要像CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，siRNA(small interfering RNA)或microRNA (miRNA)那樣需要由蛋白酶來剪切目標RNA；4) 常用于基因治療的核酶如錘頭狀和發(fā)夾狀核酶分子量比較小，免疫原性弱[57].

核酶的基因治療面臨的問題主要有如下5點：1) 特異性，核酶的酶鏈部分即使與靶標沒有完全配對也可能發(fā)生微弱的非特異性剪切[16]；2) RNA分子在人體內常常不穩(wěn)定，在受體細胞里容易降解；3) 酶切效率，特別是細胞體內的酶切效率.高水平的酶切效率是降低靶標RNA的關鍵；4) 可塑性，每一種核酶都有保守的核苷酸，如果保守的核苷酸越多，與之相匹配的靶標序列的可選度就越少，即可塑性小.如錘頭狀核酶只要靶標的序列含有GUC即可，因此，它的可塑性比較強；5) 載體類型和導入技術[58].

容易構建的、高表達的、穩(wěn)定性好的、轉染效率高的載體，以及高效、安全的細胞導入技術也是核酶基因治療的關鍵環(huán)節(jié).現在常用的載體有慢病毒載體、腺病毒載體、重組腺病毒載體、腺病毒相關載體(AAV)，而常用的導入技術有脂質體導入技術、電穿孔法、顯微注射等.這些方法在核酶基因治療的應用有待進一步探索和完善.

4 研究展望

核酶作為一類非常獨特的RNA分子，在生物界占有重要的生物學地位，如蛋白質的合成是由核酶執(zhí)行的.然而，核酶發(fā)現的步伐比較艱難，在剛開始的10 a里發(fā)現了7類，之后的近25 a里僅發(fā)現了3 類，而且大多是在偶然的實驗中發(fā)現的.隨著生物科技的發(fā)展，Breaker實驗室于2014-2015年共發(fā)現4 類自我剪切的核酶，大大加快了核酶發(fā)現的步伐.這些發(fā)現將推進核酶領域的研究進一步深入，包括更多核酶晶體結構的確立、酶切機理的理解和核酶新的生物學功能的發(fā)現等.

發(fā)現核酶不久，錘頭狀核酶就被應用于HIV基因治療的研究.核酶能夠促使靶基因失活且讓其無法恢復，并能夠在體外進行循環(huán)使用，這些優(yōu)勢的存在都使核酶被廣泛關注.但是核酶的應用技術還沒有完全成熟，受到諸多因素的影響，如核酶的可塑性、最佳靶位點的選擇、核酶的剪切效率、轉染的效率、在受體細胞內的穩(wěn)定性等.隨著更多新核酶的發(fā)現、核酶晶體結構的確立、剪切機理的深入了解、轉染載體技術的進步、不斷發(fā)展的陽離子脂質體導入技術和核酶化學修飾技術[59]的提高，核酶的基因治療研究將不斷深入，最終會成為疾病治療的一個重要手段.

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(責任編輯： 黃仲一 英文審校： 劉源崗)

Discovery of Ribozymes and Their Application in Gene Therapy

ZHOU Gengmin， DIAO Yong， LI Sanshu

(School of Biomedical Sciences， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China)

Ribozymes are structured RNA molecules with catalytic activities. Since most ribozymes have the ability to cleave RNAs， they could be used to cleave mRNAs and regulate gene expression， and therefore becoming new tools for gene therapy. This paper describes the discovery history of ribozymes and their applications in the therapy researches of acquired immune deficiency syndrome， hepatitis， tumor， reproductive tract infection and other diseases. Lastly， the paper analyzes the technological advantages and the existing problems of the ribozyme′s application in gene therapy, and looks into the future of researches on the establishment of more crystal structures of new ribozymes， understanding of ribozyme cleavage mechanisms, and the discovery of new biological functions of ribozymes.

ribozyme； non-coding RNA； gene therapy； gene expression； cut RNA

10.11830/ISSN.1000-5013.201704012

2017-03-30

李三暑(1972-)，男，教授，博士，主要從事核酶和核糖開關的研究.E-mail:sanshuli@126.com.

國家自然科學基金資助項目(81271691， 81371669)； 華僑大學高層次人才科研啟動項目(Z16Y0015)； 華僑大學研究生科研創(chuàng)新能力培育計劃資助項目(1511316013)

Q 7

A

1000-5013(2017)04-0509-06