湯賓，李玉軍，趙燕，黃麗華，黃妤，張學(xué)文

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

十字花科植物17個(gè)物種PIN3基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

湯賓，李玉軍，趙燕，黃麗華，黃妤，張學(xué)文*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

為了探明十字花科植物不同物種PIN3基因之間的進(jìn)化差異，運(yùn)用Brassica Database數(shù)據(jù)庫(kù)及十字花科基因數(shù)據(jù)庫(kù)在線平臺(tái)，對(duì)擬南芥(Arabidopsis thaliala)、紅花薺菜(Capsella rubella)、蕪青(Brassica rapa)、油菜(Brassica napus)、甘藍(lán)(Brassica oleracea)等17個(gè)已完成基因組測(cè)序的十字花科物種的18個(gè)(油菜含有2個(gè))PIN3同源性基因進(jìn)行分析，并對(duì)其推導(dǎo)的編碼蛋白(PIN3)進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，18個(gè)PIN3序列間的相似性為86.74%，PIN3推導(dǎo)蛋白之間的相似度為90.93%，蛋白等電點(diǎn)約為7.15～9.44，蕪青PIN3等電點(diǎn)明顯偏高。PIN3的氨基酸比對(duì)分析結(jié)果表明，在多個(gè)糖基化位點(diǎn)出現(xiàn)具有種屬差異性和符合進(jìn)化關(guān)系的氨基酸替換現(xiàn)象，鹽芥屬植物中條葉藍(lán)芥(Thellugiella parvula)PIN3在更多的位點(diǎn)出現(xiàn)氨基酸的替換，這可能是導(dǎo)致十字花科不同種屬PIN3蛋白的功能和活性出現(xiàn)差異的原因。

十字花科；PIN3基因；系統(tǒng)進(jìn)化

十字花科(Brassicaceae)因其分布范圍廣、種類繁多、結(jié)實(shí)量大、生長(zhǎng)周期短和培養(yǎng)體系成熟等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各類植物學(xué)的研究[1]。目前十字花科植物中已有 17個(gè)種的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，這給其分子水平的研究提供了充足的資料。

PIN是植物中獨(dú)有的蛋白質(zhì)家族，參與植物體內(nèi)生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸，作為植物進(jìn)化研究的指標(biāo)有較好的參考價(jià)值[2]。PIN(PIN-FORMED)基因家族共有8個(gè)成員[3]。研究[4-6]表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)PIN蛋白負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素在胞內(nèi)的平衡及其代謝活動(dòng)，而質(zhì)膜上PIN的不對(duì)稱分布參與了局部生長(zhǎng)素濃度梯度的建立和維持，進(jìn)而調(diào)控植物胚胎發(fā)育、器官發(fā)育、向性運(yùn)動(dòng)。

擬南芥中 PIN3主要參與諸多信號(hào)響應(yīng)的細(xì)胞間生長(zhǎng)素橫向的極性運(yùn)輸[7]。PIN3介導(dǎo)生長(zhǎng)素向重力作用方向的極性運(yùn)輸導(dǎo)致局部生長(zhǎng)素的不對(duì)稱分布[8-9]；植物向光性反應(yīng)也與局部PIN3的不對(duì)稱極性分布有關(guān)，光信號(hào)通過(guò)對(duì) PIN3的調(diào)控導(dǎo)致避光側(cè)生長(zhǎng)素的累積，表現(xiàn)出向光生長(zhǎng)的特點(diǎn)[10]。關(guān)于 PIN3的研究在整個(gè)植物發(fā)育事件調(diào)控機(jī)理的研究中有著重要的地位[11-12]。PIN3蛋白在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸中起著重要作用。本研究中，對(duì)十字花科17個(gè)已完成基因組測(cè)序物種的18個(gè)(油菜含有2個(gè))PIN3同源性基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，有助于從分子水平了解十字花科植物間 PIN3基因的進(jìn)化差異，為十字花科植物的生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸研究提供理論依據(jù)。

1 工具與方法

1.1 生物信息學(xué)工具

1.1.1 所用數(shù)據(jù)庫(kù)

從擬南芥 TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.arabidopsis.org/)獲得AtPIN3基因序列；ExPASy (http：//au.expasy.org/tools/peptident.html/)數(shù)據(jù)庫(kù)、PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//prosite.expasy.org/) 、 DOE Joint Genome Institute (http：//jgi.doe.gov/)等用于分析比對(duì)。

1.1.2 本地化分析平臺(tái)

由 http：//www.megasoftware.net/下載分子進(jìn)化遺傳分析軟件 MEGA 6.0、多序列比對(duì)軟件Clustalw、分子生物學(xué)應(yīng)用軟件DNAMAN、Fasttree等用于后續(xù)序列分析。

1.1.3 在線分析平臺(tái)

DNA與蛋白序列分析與格式化處理在線工具包(http：//www.bio-soft.net/sms/)；PROTTER(http：//wlab.ethz.ch/protter/start/)跨膜預(yù)測(cè)在線軟件；十字花科基因數(shù)據(jù)庫(kù)在線比對(duì)(http：//brassicadb.org/brad/blastPage.php)。

1.2 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

運(yùn)用Clustal W對(duì)從數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的17個(gè)物種共18個(gè)PIN3蛋白進(jìn)行多重比對(duì)；采用本地化分析平臺(tái)Mega 6.0軟件以鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。為保證系統(tǒng)樹的質(zhì)量，將Bootstrap值統(tǒng)一設(shè)置為1 000[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 十字花科植物PIN3基因的鑒定及序列分析

從擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得擬南芥PIN3基因序列(AT1G70940)，在數(shù)據(jù)庫(kù) Brassica Database和DOE Joint Genome Institute中進(jìn)行檢索，并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的PIN3序列進(jìn)行對(duì)比，獲得十字花科17個(gè)物種共18個(gè)PIN3基因序列及相關(guān)信息。甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)中有2個(gè)PIN3基因，呈現(xiàn)基因進(jìn)化的擴(kuò)展趨勢(shì)。這 18個(gè) PIN3基因在cDNA序列上具有較高的一致性，相似性為86.74%，而其序列的細(xì)微差異可能正是十字花科各PIN3蛋白的功能和活性區(qū)別的關(guān)鍵。

在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系上，所列 PIN3序列整體上進(jìn)化方向分為2類：蕓薹屬作物歸為1類；另1類包括薺屬、鼠耳芥屬、鹽芥屬等，此類聚類關(guān)系較為復(fù)雜，分支較多，其中阿拉伯巖芥(Aethionema arabicum)和 Brassica rapafpsc 單獨(dú)成支(圖 1)。

圖1 十字花科PIN3基因序列同源比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹Fig.1 The unrooted neighbor joining phylogenetic tree of PIN3 gene in Brassicaceae specie

2.2 十字花科植物PIN3基因信息比對(duì)及跨膜分析

通過(guò) BRAD十字花科基因數(shù)據(jù)庫(kù)在線平臺(tái)獲得十字花科17個(gè)物種共18個(gè)PIN3基因內(nèi)含子數(shù)目[14]。從表1可知，琴葉擬南芥(Arabidopsis lyrata)PIN3基因中只有3個(gè)內(nèi)含子，這可能與其進(jìn)化程度較低相關(guān)。而與其同源性極高、親緣關(guān)系也很近的擬南芥的內(nèi)含子數(shù)目只有5個(gè)。薺屬類的Capsella grandiflora、Capsella rubella、Capsella bursa–pastoris內(nèi)含子數(shù)目都為6個(gè)，而內(nèi)含子數(shù)目最多(9個(gè))的 Aethionema arabicum在進(jìn)化方向上差異最大。這可能是在進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)化方向上的距離增大所致[15]。

在Brassica Database和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取十字花科物種的PIN3氨基酸序列，使用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)、PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)和PROTTER在線分析平臺(tái)預(yù)測(cè)相關(guān)物種PIN3蛋白的氨基酸數(shù)量、等電點(diǎn)、分子量、磷酸化位點(diǎn)等。由表1可知，PIN3蛋白序列長(zhǎng)度為 552～649，蛋白大小為 59 764.0～ 69 998.5，等電點(diǎn)為 7.15～9.44。甘藍(lán)型油菜和水蒜芥 PIN3蛋白序列長(zhǎng)度明顯偏短，水蒜芥和亞麻薺的等電點(diǎn)偏低，而蕪青的等電點(diǎn)則明顯偏高。PIN3蛋白等電點(diǎn)的變化可能是十字花科不同物種適應(yīng)不同生活環(huán)境的結(jié)果，同時(shí)也可能與蛋白結(jié)構(gòu)和氨基酸組成相關(guān)。蕪青PIN3蛋白比對(duì)顯示其一段跨膜區(qū)域的氨基酸序列出現(xiàn)較大差異，這可能是蕪青PIN3蛋白等電點(diǎn)高達(dá)9.44的原因。等電點(diǎn)的變化可能導(dǎo)致潛在的蛋白功能和活性的變化[16-18]。

通過(guò)在線分析軟件PROTTER跨膜預(yù)測(cè)，對(duì)已獲得的17個(gè)物種共18個(gè)PIN3蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，分析并初步確立相關(guān)跨膜結(jié)構(gòu)模型(圖2)。以擬南芥、Brassica rapafpsc、蕪青、水蒜芥為例， PIN3蛋白跨膜初步分為4種模型。不同的聚類物種的跨膜次數(shù)出現(xiàn)差異，這種差異隨著親緣關(guān)系的增大愈明顯。有些物種 PIN3蛋白的羧基端出現(xiàn)在胞外，且這些物種的分布趨勢(shì)符合 PIN3蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹中的進(jìn)化關(guān)系，大致以阿拉伯巖芥為界。

表1 十字花科PIN3基因及其編碼蛋白信息Table 1 The information of PIN3 gene in Brassicaceae

圖2 十字花科PIN3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Transmembrane structure prediction of PIN3 protein in Brassicaceae

2.3 十字花科PIN3蛋白比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

PIN3蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系(圖3)與PIN3序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系相似。整體上進(jìn)化方向分為2支：蕓薹屬為1支；其他物種為另1支進(jìn)化方向。

圖3 十字花科PIN3蛋白同源比對(duì)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The unrooted neighbor joining phylogenetic tree of PIN3 protein in Brassicaceae specie

為了解十字花科PIN3蛋白的差異，對(duì)PIN3蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析(圖4)。PIN3蛋白相似度高達(dá) 90.93%，符合 ZAZIMALOVA等[19]建立的PIN蛋白結(jié)構(gòu)模式。對(duì)PIN3多次比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，在 80、83、91、128、135、245、288、492、597、603十個(gè)位置具有種屬差異性和符合進(jìn)化關(guān)系的氨基酸替換現(xiàn)象，特別是適應(yīng)極端環(huán)境的鹽芥屬中條葉藍(lán)芥(Thellugiella parvula)在更多的位點(diǎn)出現(xiàn)氨基酸的替換。

PIN3蛋白的磷酸化是產(chǎn)生和保持指定PIN3極性的關(guān)鍵，其磷酸化位點(diǎn)(T/SX2E/D)分布在親水環(huán)的保守區(qū)域。十字花科的18個(gè)PIN3蛋白氨基酸序列在M3磷酸化基序上高度保守，這與已有的PIN3磷酸化研究結(jié)果相符。其他3個(gè)推測(cè)的磷酸化位點(diǎn)上，所列 PIN3蛋白也表現(xiàn)出了高度保守性。這說(shuō)明磷酸化可能不是導(dǎo)致 PIN3蛋白功能和活性出現(xiàn)差異的原因。

PIN3蛋白預(yù)測(cè)的糖基化位點(diǎn)差異較大。糖基化位點(diǎn)(GlcNAc)分散于整個(gè)親水環(huán)區(qū)域，在約498位氨基酸處發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)內(nèi)吞作用的內(nèi)在化基序NPXXY[20]。在涉及糖基化作用位點(diǎn)的第91位氨基酸可分為異亮氨酸及苯丙氨酸兩大類，在系統(tǒng)樹(圖3)上也表現(xiàn)出以 Aethionema arabicum為界的明顯物種進(jìn)化差異；在245氨基酸位置，只有Brassica rapafpsc為特異性的谷氨酰胺，其在系統(tǒng)樹中單獨(dú)成支，很可能與這一糖基化差異相關(guān)。推測(cè)十字花科物種的PIN3蛋白糖基化差異與系統(tǒng)樹進(jìn)化關(guān)系聯(lián)系較為緊密，在環(huán)境壓力下，通過(guò)對(duì) PIN3功能的逐步微調(diào)，得以適應(yīng)環(huán)境，擴(kuò)大物種分布。

圖4 十字花科17 個(gè)物種的18 個(gè)PIN3蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Multiple alignment of the 18 PIN3 proteins from 17 Brassicaceae species

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)對(duì)十字花科17個(gè)物種的18個(gè)PIN3同源性基因(油菜含2個(gè)PIN3同源基因)進(jìn)行分析，依據(jù)蛋白跨膜分析結(jié)果分為4種類型，其跨膜次數(shù)差異隨親緣關(guān)系距離的增加愈明顯。其同源性比較結(jié)果表明，18個(gè)預(yù)測(cè)PIN3 cDNA序列的相似性為86.74%，PIN3推導(dǎo)蛋白之間的相似性為90.93%。各 PIN3基因內(nèi)含子數(shù)目跨度較大，Aethionema arabicum在進(jìn)化方向上單獨(dú)成支，其內(nèi)含子數(shù)目(9個(gè))也最高，其他基因內(nèi)含子數(shù)目大多為 5～7個(gè)。PIN3蛋白等電點(diǎn)大部分約為8.00，蕪青PIN3蛋白等電點(diǎn)高達(dá)9.44，分析后認(rèn)為與其一部分跨膜區(qū)域的氨基酸序列差異較大有關(guān)。PIN3的氨基酸比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，在磷酸化位點(diǎn)上 PIN3蛋白表現(xiàn)出高度的保守性，而在多個(gè)糖基化位點(diǎn)出現(xiàn)具有種屬差異性和符合進(jìn)化關(guān)系的氨基酸替換現(xiàn)象，可能通過(guò)影響PIN3的糖基化過(guò)程，導(dǎo)致PIN3蛋白的功能和活性出現(xiàn)差異。

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責(zé)任編輯：尹小紅

英文編輯：梁 和

The phylogenetic analysis of PIN3 genes in 17 species of Brassicaceae family

TANG Bin, LI Yujun, ZHAO Yan, HUANG Lihua, HUANG Yu, ZHANG Xuewen*
(College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

In order to explore the evolutionary differences between PIN3 genes in different species of Brassicaceae, the Brassica database and the Brassicaceae gene database were used. In this paper 18 PIN3 genes were identified by sequences blast in the database of 17 sequenced Brassicaceae species (there were two homologous PIN3 in Brassica napus). The phylogenetics of the genes and their predicted proteins (PIN3) were carried out by bioinformatics analysis.The results indicated that the similarity of 18 PIN3 gene sequences in the Brassicaceae species was 86.74%, while the proteins similarity was 90.93%.The PI of PIN3 protein was form 7.15 to 9.44, the PI of Brassica rapa was higher than those of others. The amino acid difference was found in several glycosylation sites of PIN3 protein with species diversity,which conformed to the amino acid substitution phenomenon and may result in difference function and activity of the protein in evolutionary relationships.

Brassicaceae; PIN3 gene; phyletic evolution

Q949.748.3

A

1007-1032(2017)04-0366-06

2017-03-17

2017-06-15

湖南省教育廳高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目(15K060)

湯賓(1991—)，男，湖南岳陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事細(xì)胞分子生物學(xué)研究，frentwu@gmail.com；*通信作者，張學(xué)文，博士，教授，主要從事植物發(fā)育分子生物學(xué)研究，xwzhang@hunau.edu.cn