孫錦霞，黃 鐘，王 瑞，翁林軍，李亞旭

1)深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳518060；2)聊城大學(xué)藥學(xué)院，山東聊城252059；3)同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海200092

【生物工程 / Bioengineering】

巨噬細(xì)胞中FBW7沉默對其殺菌能力的抑制

孫錦霞1，黃 鐘1，王 瑞2，翁林軍3，李亞旭3

1)深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳518060；2)聊城大學(xué)藥學(xué)院，山東聊城252059；3)同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海200092

采用小干擾核糖核酸(siRNA)介導(dǎo)Hela細(xì)胞、原代巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中FBW7基因沉默，研究其對NF-κB信號通路、細(xì)胞因子表達(dá)、巨噬細(xì)胞吞噬和殺傷細(xì)菌能力的影響．通過流式細(xì)胞術(shù)、抗生素保護(hù)試驗(yàn)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和報(bào)告基因的研究方法，發(fā)現(xiàn)FBW7沉默不具有調(diào)控RAW264.7細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力，但能顯著抑制原代巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的殺菌能力及一氧化氮合成酶(nitricoxidesynthase,iNOS)表達(dá)，抑制Hela中NF-κB報(bào)告基因活性，降低Hela細(xì)胞中TNFα、IL-1β和IL-6， 以及原代巨噬細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞中MCP-1和IL-1β表達(dá)．結(jié)果表明，F(xiàn)BW7沉默可通過影響NF-κB活性抑制巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的殺傷能力．

小干擾核糖核酸；RAW264.7細(xì)胞；巨噬細(xì)胞；殺菌活性；一氧化氮合成酶；NF-κB信號通路；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

盡管目前已有大量抗生素被應(yīng)用于臨床，細(xì)菌性感染仍威脅著人類的健康[1]．巨噬細(xì)胞是固有免疫應(yīng)答中的主要效應(yīng)細(xì)胞，在感染早期發(fā)揮主導(dǎo)作用[2-3]．一方面，巨噬細(xì)胞借助其表面的模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)識別感染部位的病原微生物，發(fā)揮非特異性吞噬殺傷作用．另一方面，巨噬細(xì)胞通過激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等一系列信號通路，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子(如TNFα、IL-1β和IL-6 )、趨化因子(如MCP-1和MIP-1α)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(nitric oxide，NO)等的表達(dá)釋放，募集更多的免疫細(xì)胞至感染部位，從而擴(kuò)大局部抗感染免疫反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受損傷．E3泛素連接酶FBW7在炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等生理病理進(jìn)程中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[4]．RAW264.7細(xì)胞是小鼠白血病單核巨噬細(xì)胞系，具有高效的脫氧核糖核苷酸(deoxyribonucleic acid，DNA)轉(zhuǎn)染和核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)干擾效率，被廣泛用于研究巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、吞噬殺傷細(xì)菌能力及調(diào)控機(jī)制．本研究探討小干擾核糖核酸(small inferfering RNA，siRNA)介導(dǎo)的FBW7沉默對巨噬細(xì)胞殺傷細(xì)菌能力、NF-κB活性及下游細(xì)胞因子表達(dá)的作用，以闡明E3泛素連接酶FBW7對細(xì)菌殺傷能力的調(diào)節(jié)作用及調(diào)控機(jī)制．

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM(dulbecco’smodifiedeaglemedium) 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶購自美國Gibco公司；慶大霉素購自美國MerckMillipore公司；2×臺盼藍(lán)染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000和RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司；Trans-EZ轉(zhuǎn)染試劑購自上海麒盟生物科技有限公司；FugenHD轉(zhuǎn)染試劑購自美國Roche公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；TNFα細(xì)胞因子購自美國PeproTech公司；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和巰基乙酸鹽培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄和PCR相關(guān)試劑購自日本Takara公司；乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)、Triton-X100、無水乙醇、異丙醇、LB(luria-bertani)培養(yǎng)基等化學(xué)試劑購自上海生工生物工程股份有限公司；Nanodrop微量分光光度計(jì)購自美國Thermo公司；熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司．

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

用DMEM培養(yǎng)基(含有體積分?jǐn)?shù)為10% 的胎牛血清)培養(yǎng)Hela細(xì)胞、原代腹腔巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞．給8～12周C57BL/6小鼠注射3mL體積分?jǐn)?shù)為3%的巰基乙酸鹽培養(yǎng)基，3d后腹腔注射5mLPBS(phosphatebuffersolution)緩沖液，提取腹腔巨噬細(xì)胞，CO2培養(yǎng)箱中貼壁2h后，換為新鮮培養(yǎng)基，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)．本研究所用siRNA序列為：鼠siFBW7： 5′-ACCUUCUCU-GGAGAGA-GAAAUGCTT-3′；人siFBW7： 5′-GGCA-CUCUAUGUGCUUUCAUUC-3′．

上述siRNA由上海吉瑪公司合成后，經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞和原代巨噬細(xì)胞，或經(jīng)FugenHD轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使用Trans-EZ轉(zhuǎn)染試劑．

1.3 吞噬和抗生素保護(hù)試驗(yàn)

LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)可表達(dá)綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的大腸桿菌(escherichiacoli，E.coli)至對數(shù)生長期， 光密度D(600)值約為0.4～0.6，加入1mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside，IPTG)，25 ℃培養(yǎng)過夜，誘導(dǎo)GFP表達(dá)，獲得GFP標(biāo)記的E.coli，此時(shí)菌液濃度約為1×106mL-1．離心收集細(xì)菌，然后PBS清洗2遍，DMEM培養(yǎng)基(含有體積分?jǐn)?shù)為10% 的胎牛血清)稀釋至所需濃度．吞噬實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)量n(E.coli)∶n(RAW264.7)=8∶1，APA實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)量比n(E.coli)∶n(原代巨噬細(xì)胞RAW264.7)=4∶1，加入稀釋后的E.coli， 1 800r/min離心10min．37 ℃共培養(yǎng)2h后PBS清洗2遍，然后加入DMEM培養(yǎng)基(含有體積分?jǐn)?shù)為10% 的胎牛血清和10mg/mL慶大霉素)培養(yǎng)30min，以殺傷細(xì)胞表面的E.coli． 吞噬試驗(yàn)換為臺盼藍(lán)染色液，孵育10min以淬滅細(xì)胞表面熒光，然后直接收集細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測，并用FlowJo軟件分析GFP陽性率．APA試驗(yàn)需要換為DMEM培養(yǎng)基(含有體積分?jǐn)?shù)為10% 的胎牛血清和5mg/mL慶大霉素)繼續(xù)共培養(yǎng)4h，最后加入胰酶(含有體積分?jǐn)?shù)為0.5%的EDTA和體積分?jǐn)?shù)為0.025%的Triton-X100)裂解細(xì)菌．裂解液經(jīng)梯度稀釋后涂于LB固體培養(yǎng)皿，第2天統(tǒng)計(jì)所長出單克隆數(shù)目．

1.4RNA提取和RT-PCR

細(xì)胞經(jīng)Trizol裂解提取總mRNA后，將不同樣品的mRNA含量調(diào)整一致后反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid，cDNA)，于-20 ℃保存，用于后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)．本研究所用引物序列見表1.

表1 RT-qPCR所用引物

上述引物經(jīng)上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，按DNA聚合酶說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，或按SYBR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線檢驗(yàn)，目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物與看家基因β-actin比較，經(jīng)2-ΔΔct方法計(jì)算出該基因信使核糖核酸(messengerribonucleicacid，mRNA)的相對表達(dá)量．

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1FBW7沉默不影響細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬能力

為檢測FBW7沉默對RAW264.7細(xì)胞殺菌能力的調(diào)控作用，本研究首先檢測其對RAW264.7細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力的影響．siNC(negativecontrol)和siFBW7轉(zhuǎn)染72h，裂解細(xì)胞并提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后PCR檢測FBW7表達(dá)的變化．同時(shí)按細(xì)胞數(shù)量n(E.coli)∶n(RAW264.7)=8∶1加入GFP標(biāo)記的E.coli， 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測FBW7沉默對RAW264.7細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力的影響，結(jié)果如圖1．siFBW7轉(zhuǎn)染72h可以顯著沉默RAW264.7細(xì)胞FBW7mRNA水平表達(dá)，如圖1(a)和(b) ．但是，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)BW7沉默對RAW264.7細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力沒有影響，如圖1(c)、(d)和(e)．

2.2FBW7沉默會抑制殺菌能力和iNOS表達(dá)

siFBW7轉(zhuǎn)染腹腔原代巨噬細(xì)胞72h，裂解細(xì)胞并提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后PCR檢測FBW7mRNA水平表達(dá)的變化．此外，siFBW7轉(zhuǎn)染72h后，按細(xì)胞數(shù)量n(E.coli)∶n(原代巨噬細(xì)胞)=4∶1加入GFP標(biāo)記的E.coli， 通過抗生素保護(hù)試驗(yàn)檢測FBW7沉默對原代巨噬細(xì)胞殺菌能力的影響，結(jié)果如圖2． siFBW7轉(zhuǎn)染72h可以顯著沉默原代巨噬細(xì)胞中FBW7mRNA水平表達(dá)，如圖2(a)和(b)，并且FBW7沉默顯著抑制了原代巨噬細(xì)胞的殺傷細(xì)菌能力，如圖2(c)和(d)．

總之，只有嚴(yán)格遵守紀(jì)律，堅(jiān)決執(zhí)行，才能夠做成事情。根本的東西搞清楚了，努力方向有了，工作方法有了，思想指導(dǎo)行動(dòng)，執(zhí)行才更有力。

圖1 FBW7沉默對RAW264.7吞噬細(xì)菌能力的影響Fig.1 Effect of FBW7 silence on uptaking activity of RAW264.7

圖2 FBW7沉默對巨噬細(xì)胞殺傷細(xì)菌能力的影響Fig.2 Effect of FBW7 silence on bactericidal activity of macrophage

此外，通過抗生素保護(hù)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究RAW264.7細(xì)胞中FBW7沉默對其殺菌能力的影響．結(jié)果表明，與原代巨噬細(xì)胞結(jié)論一致，RAW264.7中FBW7沉默也顯著抑制了其殺傷細(xì)菌的能力，如圖2(e)和(f)．

已知NO在吞噬細(xì)胞殺傷細(xì)菌過程中的重要作用，本研究進(jìn)一步檢測了FBW7沉默對iNOS表達(dá)的調(diào)節(jié)作用．siFBW7分別轉(zhuǎn)染原代巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞72h，加入LPS(1μg/mL)刺激細(xì)胞4h，裂解細(xì)胞并提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后PCR檢測iNOS表達(dá)變化．結(jié)果表明，F(xiàn)BW7沉默顯著抑制原代巨噬細(xì)胞和RAW264.7中iNOS表達(dá)，如圖2(g)和(h)．

2.3Hela細(xì)胞中FBW7沉默可抑制NF-κB活性

已知iNOS是NF-κB信號通路的靶基因，為研究siFBW7與NF-κB的關(guān)系，本研究通過報(bào)告基因的方法揭示siFBW7對NF-κB的調(diào)控作用．首先，Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染siFBW7 48h，裂解細(xì)胞并提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后PCR檢測FBW7表達(dá)的變化．然后，轉(zhuǎn)染NF-κB-luciferase和Renilla質(zhì)粒于Hela細(xì)胞，24h后加入TNFα(10ng/mL)刺激4h，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒裂解細(xì)胞并收集上清，分別檢測Luciferase和Renilla活性，結(jié)果如圖3．其中，siFBW7轉(zhuǎn)染72h可顯著沉默F(xiàn)BW7表達(dá)，見圖3(a)和(b)，Hela細(xì)胞中FBW7沉默顯著抑制NF-κB活性，見圖3(c)．

圖3 FBW7沉默對NF-κB報(bào)告基因活性的影響Fig.3 Effect of FBW7 silence on NF-κB report gene activity

2.4FBW7沉默顯著抑制細(xì)胞因子的表達(dá)

為明確FBW7沉默對NF-κB活性的抑制作用，檢測了其下游其他靶基因的表達(dá)變化．siFBW7 轉(zhuǎn)染Hela72h，加入TNFα(10ng/mL)刺激4h．隨后裂解細(xì)胞并提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后PCR檢測細(xì)胞因子表達(dá)的變化，結(jié)果如圖4(a)至(c)．FBW7沉默顯著抑制Hela細(xì)胞中TNFα、IL-1β和IL-6的表達(dá)．

為研究siFBW7在巨噬細(xì)胞中對NF-κB下游其他靶基因的表達(dá)，siFBW7轉(zhuǎn)染原代巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞72h，分別加入LPS(1μg/mL)刺激4h，通過PCR檢測細(xì)胞因子表達(dá)的變化，結(jié)果如圖4(d)至(g)．FBW7沉默顯著抑制原代巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中MCP-1、IL-1β的表達(dá)．

圖4 FBW7沉默對Hela和巨噬細(xì)胞中促炎因子表達(dá)的影響Fig.4 Effect of FBW7 silence on cytokines expression in Hela and macrophage

3 討 論

巨噬細(xì)胞的非特異性吞噬殺傷作用在清除感染的病原菌過程中發(fā)揮著重要作用，關(guān)于巨噬細(xì)胞殺菌機(jī)制的研究目前已有很多，主要包括溶酶體途徑殺菌、抗菌肽、ROS和NO等．iNOS是NF-κB信號通路的一個(gè)靶基因，其產(chǎn)物NO不僅可以抑制細(xì)菌的DNA復(fù)制，也能通過影響氧化作用加速DNA損傷，最終發(fā)揮抗菌活性[5-7]．本研究首次證明FBW7沉默可以顯著下調(diào)RAW264.7細(xì)胞對E.Coli的殺傷能力和殺菌過程至關(guān)重要因子iNOS的表達(dá)，且對RAW264.7吞噬細(xì)菌的能力沒有影響．提示FBW7可能在巨噬細(xì)胞抵抗細(xì)菌性感染中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，為臨床上細(xì)菌感染藥物研發(fā)提供了新的靶點(diǎn)，但其具體的分子調(diào)節(jié)機(jī)制尚待深入研究．

FBW7通過泛素化降解多種原癌蛋白發(fā)揮抑癌作用，如c-Myc[8-9]、cyclinE[8-9]、Notch1[10-11]、KLF5[12]和KLF2[13]等，其突變與腫瘤發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)．研究表明，F(xiàn)BW7與NF-κB信號通路可以相互調(diào)節(jié)，如FBW7通過泛素化降解NF-κB2調(diào)節(jié)NF-κB的活性[14-15]，而NF-κB1作為FBW7的上游，抑制其表達(dá)及其底物c-Myc的降解[16]．此外，F(xiàn)BW7通過下調(diào)C/EBPδ抑制巨噬細(xì)胞中TLR4基因表達(dá)[17]，從而抑制LPS介導(dǎo)的炎癥信號，腹腔注射siFBW7α后可以上調(diào)腹腔巨噬細(xì)胞中p65、iNOS和IL-6等本底水平的表達(dá)．因此，F(xiàn)BW7在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用．

關(guān)于FBW7與細(xì)菌感染或巨噬細(xì)胞殺菌能力之間的關(guān)系尚未證明．本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BW7沉默顯著抑制NF-κB活性，且下調(diào)Hela和巨噬細(xì)胞中NF-κB信號通路靶基因TNFα、IL-1β、IL-6、MCP-1和iNOS的表達(dá)．因此，F(xiàn)BW7沉默可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路活性抑制巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的殺傷能力．但關(guān)于FBW7調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證．此外，F(xiàn)BW7對巨噬細(xì)胞殺菌能力的影響或機(jī)體抵御細(xì)菌感染的調(diào)控作用及分子機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，或使用FBW7敲除小鼠及建立膿毒癥模型進(jìn)行深入研究．總之，本研究結(jié)果從另一角度證明了FBW7在炎癥反應(yīng)中的重要作用，為深入研究FBW7對膿毒癥的調(diào)控奠定了基礎(chǔ)．

結(jié) 語

膿毒癥是臨床上常見的一種并發(fā)癥，細(xì)菌性感染為主要誘因．巨噬細(xì)胞作為抗感染過程中的關(guān)鍵性免疫細(xì)胞，在固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用．巨噬細(xì)胞中FBW7沉默可能通調(diào)節(jié)NF-κB活性而抑制其殺傷細(xì)菌的能力，后續(xù)仍需深入研究FBW7對殺菌活性及NF-κB活性調(diào)控的分子機(jī)制．

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【中文責(zé)編：晨 兮；英文責(zé)編：艾 琳】

2016-11-05；Revised：2017-02-28；Accepted：2017-05-07

Professor Huang Zhong. E-mail: zhuang809@126.com

The anti-bactericidal effects ofFBW7 silence in macrophage

Sun Jinxia1, Huang Zhong1, Wang Rui2, Weng Linjun3, and Li Yaxu3

1) Health Science Center, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China 2) College of Pharmacy, Liaocheng University, Liaocheng 252059, Shandong Province, P.R.China 3) School of Life Science and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, P.R.China

SiRNA-mediatedFBW7silenceinHela,primarymacrophageandRAW264.7wereperformedtoassaytheroleofFBW7onNF-κBactivity,cytokinesexpressionandphagocytosisandbactericidalactivityofmacrophage.Flowcytometry(FCM),antibioticprotectionassay(APA),realtimequantitativepolymerasechainreaction(RT-qPCR)andreportgeneanalysissuggestthatFBW7silencedoesnotaffectphagocytosisofRAW264.7,butsignificantlyinhibitsbactericidalactivityandnitricoxidesynthase(iNOS)expressioninprimarymacrophageandRAW264.7,suppressesNF-κBreportgeneactivityinHela,decreasesexpressionofTNFα、IL-1β、IL-6inHelaandMCP-1、IL-1βinprimarymacrophageandRAW264.7.Thus,FBW7silencemightinhibitbactericidalactivityofmacrophagebyregulatingNF-κBactivity.

small interfering RNA (siRNA); RAW264.7; macrophage; bactericidal activity; nitric oxide synthase (iNOS); NF-κB signaling pathway; real time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)

：Sun Jinxia, Huang Zhong, Wang Rui, et al. The anti-bactericidal effects ofFBW7silenceinmacrophage[J].JournalofShenzhenUniversityScienceandEngineering, 2017, 34(4): 358-363.(inChinese)

R

A

10.3724/SP.J.1249.2017.04358

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31401217)；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014M0560672)

孫錦霞(1986—)，女，深圳大學(xué)博士后研究人員. 研究方向：免疫學(xué).E-mail：jinxia8608@126.com

Foundation：National Natural Science Foundation of China (31401217); Postdoctral Science Foundation of China (2014M0560672)

引 文：孫錦霞，黃 鐘，王 瑞，等. 巨噬細(xì)胞中FBW7沉默對其殺菌能力的抑制[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào)理工版，2017，34(4)：358-363.