米志寬，符兆英，王愛紅 ，王 磊，李 飛，鄭 軍，雷 星，任清泉

1.延安大學醫(yī)學院(延安 716000)， 2. 延安大學附屬醫(yī)院(延安 716000)

乳漿大戟抑制原代人胃癌多藥耐藥細胞增殖和誘導凋亡研究*

米志寬1，符兆英1，王愛紅1△，王 磊2，李 飛2，鄭 軍2，雷 星2，任清泉2

1.延安大學醫(yī)學院(延安 716000)， 2. 延安大學附屬醫(yī)院(延安 716000)

目的：研究乳漿大戟抑制原代培養(yǎng)多藥耐藥人胃癌細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用。方法：制備人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細胞，用不同稀釋度的乳漿大戟提取液處理人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細胞，MTT實驗觀察細胞生長抑制現(xiàn)象，吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察凋亡細胞的核形態(tài)改變并測定凋亡指數(shù)，流式細胞術檢測細胞凋亡率；以不加乳漿大戟提取液的細胞作對照。結果：乳漿大戟對人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細胞有增殖抑制作用，該作用有時間和濃度依賴性。乳漿大戟處理后的人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細胞，熒光顯微鏡下觀察可見細胞核固縮、染色不均勻和核碎片等細胞凋亡的形態(tài)學改變，凋亡形態(tài)顯示的凋亡指數(shù)和流式細胞術顯示的凋亡率均明顯上升，均有時間和濃度依賴性；以上作用與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。結論：乳漿大戟提取液具有抑制人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用。

胃癌(Gastric cancer)是中國常見的惡性腫瘤之一，分別居我國農(nóng)村和城市惡性腫瘤發(fā)病率的第一位和第二位[1-3]。早期胃癌以手術治療為主，中晚期則以化療為主要治療手段。但由于腫瘤細胞往往對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性(Multidrug resistance, MDR)，而使得療效不佳[4-6]。本文研究了乳漿大戟(Euphorbia esula Linn)抑制人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細胞增殖和誘導人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細胞凋亡的作用，旨在尋找一種對抗或逆轉(zhuǎn)人胃癌多藥耐藥的中藥材。

材料與方法

1 實驗材料 RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰酶購自Gibco公司，噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和碘化丙啶(PI)購自Sigma公司，細胞培養(yǎng)板為丹麥Cyclone公司產(chǎn)品，流式細胞儀為美國貝克曼公司產(chǎn)品，熒光顯微鏡和倒置顯微鏡均為日本OLYMPUS產(chǎn)品。酶標檢測儀為美國Bio-Rad產(chǎn)品。

2 人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細胞制備 取手術切除的多藥耐藥人胃癌組織新鮮標本，制備單細胞懸液，調(diào)整單細胞懸液至活細胞濃度為5×108/L，用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，加100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，在37℃、5% CO2和飽和濕度的無菌條件下常規(guī)培養(yǎng)，加入終濃度為0.5μg/ml 的阿霉素以選擇并維持耐藥細胞；每2～3天更換新鮮培養(yǎng)液1次；細胞生長接近鋪滿瓶底時進行傳代培養(yǎng)；取處于指數(shù)生長期的細胞用于實驗。

3 細胞生長抑制實驗 將乳漿大戟原液用含10% FBS的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液稀釋成不同稀釋度：20、40、 80 、 160 、 320、 640 μg/ml。取對數(shù)生長期的多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細胞，用0.25%胰酶消化，用含10% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)液制成濃度為1×104/ml的單細胞懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔0.1 ml，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。觀察細胞生長良好，棄去舊培養(yǎng)液，將不同濃度的乳漿大戟稀釋液按每孔0.2 ml加入培養(yǎng)孔，每個濃度設6個復孔，并設正常細胞對照(不加乳漿大戟的細胞孔，每孔加0.2 ml 10% FBS RPMI-1640細胞培養(yǎng)液)，在37℃、5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)。

培養(yǎng)24 h和48 h后的細胞，分別加入5% MTT溶液20μl/孔，終濃度5mg/ml，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去各細胞孔的上清液，每孔加入100 μl DMSO，緩慢振蕩10 min，使結晶充分溶解，用酶標檢測儀在570 nm波長處讀取A值。以只含10% FBS 的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液的孔調(diào)零，取6個復孔的算術平均值，按以下公式計算細胞生長抑制率：抑制率%=(正常細胞對照孔的平均A值-乳漿大戟處理孔的平均A值)/正常細胞對照孔的平均A值×100%。

4 吖啶橙染色測定凋亡指數(shù) 將人胃癌原代培養(yǎng)細胞在10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中37℃、5% CO2和飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)。對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×104/ml，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔2 ml，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，加入用10% FBS RPMI-1640細胞培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的乳漿大戟稀釋液：40、80、160 μg/ml，每孔4 ml，并設立不含乳漿大戟的對照組。37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)24、48 h和72 h后分別收獲細胞。將細胞以1%福爾馬林固定，用吖啶橙染色，熒光顯微鏡高倍鏡下觀察細胞形態(tài)并計數(shù)凋亡細胞。細胞體積縮小、細胞核濃染、固縮和染色體邊緣化者為凋亡細胞。隨機取5個視野，每個視野計數(shù)400個細胞，記錄其中的凋亡細胞數(shù)。按以下公式計算凋亡指數(shù)：凋亡指數(shù)=(凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 對數(shù)生長期的人胃癌多藥耐藥細胞原代培養(yǎng)，用0.25%的胰酶消化，制備單細胞懸液，用含10% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)液配成1×104/ml濃度，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔2 ml，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，加入用10% FBS RPMI-1640細胞培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的乳漿大戟稀釋液：40、 80、 160 μg/ml，每孔4 ml，并設立不含乳漿大戟的對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每個濃度和未加乳漿大戟的對照分別收集106個細胞，1000 r/min離心7 min，棄上清，用PBS洗2遍。加入500 μl 4℃預冷的70%乙醇在4℃固定1 h，1000 r/min離心7 min，棄上清，用PBS洗2遍，3 ml PBS重懸細胞。每管加入PI溶液1 ml，充分混勻，避光室溫靜置30 min后，上流式細胞儀檢測，取3次的平均值計算細胞凋亡率。

結 果

1 MTT實驗顯示的乳漿大戟對多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細胞的增殖抑制作用 不同濃度的乳漿大戟稀釋液處理人胃癌多藥耐藥細胞原代培養(yǎng)后，MTT檢測結果顯示，乳漿大戟稀釋液明顯地抑制了多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細胞的增殖活性，而且隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 乳漿大戟對多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細胞增殖活力抑制作用的MTT檢測結果

注：與對照組比較，*P<0.05；與前一濃度比較，△P<0.05；與24 h抑制率比較，▲P<0.05

2 凋亡形態(tài)顯示的乳漿大戟誘導多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細胞凋亡指數(shù)升高的情況 乳漿大戟稀釋液處理后的人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細胞，經(jīng)吖啶橙染色，熒光顯微鏡下觀察凋亡形態(tài)，可見細胞核固縮、染色不均勻、邊緣化和核碎片、以及熒光增強等細胞凋亡變化的形態(tài)學改變，計數(shù)凋亡細胞和計算凋亡指數(shù)的結果顯示，乳漿大戟誘導多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細胞的凋亡指數(shù)隨藥物濃度的增加和作用時間的延長而呈現(xiàn)明顯的升高趨勢，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 乳漿大戟處理多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細胞后的凋亡指數(shù)±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P<0.01

3 流式細胞術檢測顯示的乳漿大戟誘導多藥耐藥人胃癌細胞凋亡率上升的情況 人胃癌多藥耐藥原代培養(yǎng)細胞經(jīng)梯度濃度的乳漿大戟稀釋液處理24 h、48 h和72 h后，作流式細胞儀檢測凋亡情況，可見各藥物濃度組誘導人胃癌原代培養(yǎng)細胞的凋亡率與未加藥對照組之間差異顯著，細胞凋亡率隨藥物濃度的增加和藥物作用時間的延長而升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，見表3。

表3 乳漿大戟處理多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細胞流式細胞儀檢測的凋亡率±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P<0.01

討 論

腫瘤的發(fā)生是由細胞增殖和細胞凋亡失去平衡所導致；抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡，是抗腫瘤治療的的一個重要研究領域和很有希望的研究領域。用中藥抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡是多年來和近年來國內(nèi)抗腫瘤研究的熱點之一[7-8]。細胞凋亡在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用，化學藥物雖可誘導胃癌細胞凋亡，但容易出現(xiàn)多藥耐藥，并且不良反應較重。

腫瘤多藥耐藥指腫瘤細胞一旦對一種化療藥產(chǎn)生耐藥，就會對多種化療藥產(chǎn)生交叉耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤耐藥有多種機制，包括細胞膜P-糖蛋白過度表達使藥物外排增加、藥物在細胞內(nèi)的滅活降解增加、抑制細胞凋亡、減弱化療藥物的毒性、降低腫瘤細胞對化療藥物的敏感性等[9-13]。腫瘤多藥耐藥研究在多年來一直被重視，逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥目前仍然是國內(nèi)外抗腫瘤研究的一個熱點。中藥毒副作用小，易被患者接受，在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥上具有一些優(yōu)勢[14-15]。比西藥在治療多藥耐藥胃癌方面更具有潛在的前景。

乳漿大戟(英文名稱Leafy Spurge)在多種植物類書籍和中藥材書籍中均有記載[16-17]，是大戟科大戟屬的一種植物。根據(jù)中國植物志[16]，乳漿大戟又稱貓眼草、乳漿草和華北大戟等。乳漿大戟是一種多年生草本植物，根圓柱狀，20 cm以上長，直徑約4mm，褐色或黑褐色。莖單生或叢生，30～60 cm高，主干直徑約4mm。葉長2～7 cm，寬4～7mm，線形，先端尖，基部楔形，無葉柄。雄花多枚，苞片寬線形；雌花1枚，子房柄明顯伸出總苞之外。蒴果三棱狀球形，直徑5～6mm。種子卵球狀，長約3mm，直徑約2mm，成熟時黃褐色。乳漿大戟分布于全國大部分地區(qū)，在陜北地區(qū)比較多見。乳漿大戟地上全草可作為藥用，味苦辛、性微寒、有毒，歸胃、肝、脾、肺經(jīng)，有散結、拔毒、逐水、消腫、祛痰、鎮(zhèn)咳之功效具拔毒止癢之效[17]。

已發(fā)現(xiàn)乳漿大戟提取物具有抑制體外培養(yǎng)的惡性腫瘤傳代細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用[3,18-20]。本實驗中，我們研究了乳漿大戟對多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細胞增殖和凋亡的作用：用MTT實驗研究了乳漿大戟對人胃癌原代培養(yǎng)細胞的增殖抑制或細胞毒作用、用吖啶橙染色熒光顯微鏡凋亡細胞核形態(tài)觀察研究了乳漿大戟對人胃癌原代培養(yǎng)細胞凋亡指數(shù)的影響，用流式細胞術研究了乳漿大戟誘導人胃癌原代培養(yǎng)細胞凋亡的凋亡率。研究結果發(fā)現(xiàn)，乳漿大戟具有明顯的抑制多藥耐藥人胃癌原代培養(yǎng)細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用，該研究為利用乳漿大戟逆轉(zhuǎn)人胃癌多藥耐藥或進行胃癌輔助治療打下了一定的基礎。

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(收稿：2016-10-18)

Euphorbia esula inhibition of primary culture multi-resistant gastric cancer cell proliferation and induce the apoptosis of research

Mi Zhikuan, Fu Zhaoying, Wang Aihong, et al.

Yan’an University Medical College(Yan’an 716000)

Objective: To study the Euphorbia esula by inhibiting the generation of cultivating multi-resistant gastric cancer cell proliferation and induce cell apoptosis. Methods: For the preparation of human gastric cancer multi-resistant primary cells, diluted with different degrees of Euphorbia esula extract processing people primitive culture cell, stomach multi-resistant determined by MTT experiment to observe the cell growth inhibition phenomenon, acridine orange staining fluorescence microscope determination of observing the nuclear morphological changes of apoptotic cells and apoptotic index, rate of flow cytometry to detect cell apoptosis. Results: Euphorbia esula on gastric cancer multi-resistant primitive culture cell proliferation inhibition, which had the time and the concentration dependence. Euphorbia esula multi-drug resistance of cancer of the stomach after processing the original generation of cultured cells, apoptosis index and apoptosis rate of rise, had the time and the concentration dependence. The above changes were statistically significant (P<0.05,P<0.01). Conclusions: Euphorbia esula extract could inhibit people primitive cultivating multi-resistant gastric cancer cell proliferation and induce cell apoptosis.

Stomach neoplasms/pathology @Euphorbia esula Drug tolerance Apoptosis Drug resistance,multiple Cell prliferation Primary cell cultare

*陜西省延安市科技項目(2014HM-05)

胃腫瘤/病理學 @乳漿大戟 藥物耐受性 細胞凋亡 抗藥性，多藥 細胞增殖 原代細胞培養(yǎng)

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.006

△通訊作者