曾秋梅 梁杏秋 王曉琴 盧 鶴

(華僑大學化工學院；華僑大學油脂及天然產(chǎn)物研究所，廈門 361021)

RP-HPLC-DAD法測定茶葉籽油酚類化合物

曾秋梅 梁杏秋 王曉琴 盧 鶴

(華僑大學化工學院；華僑大學油脂及天然產(chǎn)物研究所，廈門 361021)

建立同時分離、檢測茶葉籽油中酚類化合物組分和含量的高效液相色譜法。比較了流動相組成的影響，選擇合適的乙酸加入量，建立最優(yōu)梯度洗脫條件。結(jié)果表明，14種酚類物質(zhì)在該條件下能夠得到較好的分離，各物質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。運用該方法從茶葉籽油中共檢測到13種酚類化合物，包括5種酚酸、3種黃酮類和5種兒茶素類，含量分別為46.8、21.72、40.16 μg/g；其酚酸類主要為肉桂酸和咖啡酸，黃酮類主要為山奈酚、槲皮素和蘆丁，兒茶素類主要為兒茶素。該方法準確、可靠，適用于茶葉籽油中酚類化合物分析。

茶葉籽油 酚類化合物 高效液相色譜法

茶葉籽油，是從山茶科山茶屬茶樹(CamelliasinensisO.Ktze)種子中獲得的一種新資源食品，其不飽脂肪酸質(zhì)量分數(shù)高達85%以上[1]，卻具有較高的氧化穩(wěn)定性[2]，茶葉籽油的抗氧化作用機理引起了研究人員的關(guān)注。劉靂等[3]通過萃取茶葉籽油中酚類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)隨著多酚物質(zhì)的減少，油脂氧化穩(wěn)定性相應(yīng)降低；而在精煉茶葉籽油中按不同溶度添加萃取物，發(fā)現(xiàn)極性酚類物質(zhì)的添加量與油脂氧化穩(wěn)定性存在量效關(guān)系。Wang等[4]萃取28種茶葉籽油甲醇提取物，測定其自由基清除(DPPH)能力為91.0～2 164.5 μmolTE/100 g，抗氧化能力指數(shù)(ORAC)為251.0～1 209.5 μmolTE/100 g，證明茶葉籽油極性提取物具有強抗氧化能力。

然而，茶葉籽油分析報道目前主要集中于脂肪酸及甾醇等非極性物質(zhì)的組成[5]，對酚類化合物鑒定分析報道極為有限。Fazel等[6]采用高效液相色譜技術(shù)對伊朗茶葉籽油進行分析，其中檢測到?jīng)]食子兒茶素、兒茶素、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和兒茶素沒食子酸酯8種兒茶素類酚類化合物。可見，茶葉籽油因與茶葉同源，含有獨特的脂溶性茶多酚，具有重要的開發(fā)價值。茶多酚對人體具有特殊的生理功能，能通過抑制氧化酶系和激活抗氧化酶系來調(diào)節(jié)生物體內(nèi)自由基的平衡；同時茶多酚也能主動清除無機和脂質(zhì)自由基，絡(luò)合誘導氧化的金屬離子，起到抗氧化作用[7-8]。然而，我國茶區(qū)茶葉籽油酚類化合物資料極為有限，研究報道主要還集中在總酚含量測定[9]，對其組分的研究鮮見報道。

本試驗參考不同植物油中酚類物質(zhì)的研究方法[10-11]，采用反相高效液相色譜法-二極管(RP-HPLC-DAD)技術(shù)結(jié)合14種標準品化合物對茶葉籽油酚類化合物進行定性定量分析，探索我國茶葉籽油酚類化合物組成，為其鑒偽及深度開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

茶葉籽原料采自陜西省茶園。采摘后置于室溫通風處自然風干，脫殼、壓榨(冷榨法)沉淀得到茶葉籽毛油。

沒食子酸、羥基酪醇、4-羥基苯乙酸、咖啡酸、苯甲酸、肉桂酸、蘆?。喊⒗≡噭┕荆粌翰杷?、表兒茶素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)：美國Sigma公司。正己烷(分析純)、甲醇(分析純)、乙酸(色譜純)：國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水為自制超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

島津LC-20型高效液相色譜儀、WondaSil反相C18分析型色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)：日本島津公司； TGL-16M臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Simplicity型超純水系統(tǒng)：德國默克密理博公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

稱取羥基酪醇對照品10 mg、咖啡酸對照品20 mg、表沒食子兒茶素沒食子酸酯 6 mg、蘆丁3 mg，分別用10 mL色譜純甲醇溶解并定容；稱取沒食子酸、4-羥基苯乙酸、肉桂酸、苯甲酸、兒茶素對照品各50 mg，分別用10 mL色譜純甲醇溶解并定容；稱取表沒食子兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、山奈酚各5 mg，用10 mL色譜純甲醇溶解并定容；分別移取1.0 mL上述單酚標準溶液，用甲醇定容至50 mL，得多酚混合標品儲備液，各標準品儲備液置于-20 ℃下冷藏備用。用0.45 μm微孔濾膜過濾，用于色譜定性和定量分析。

1.2.2 樣品前處理

參考橄欖油[12-13]和山茶油[3,14-15]的處理方法，并通過不斷摸索和優(yōu)化最終確定茶葉籽油酚類化合物前處理方法。稱取茶葉籽油50 g，加入50 mL甲醇溶液振蕩萃取，靜置分層后，將甲醇層分離出來，提取重復4次，收集甲醇提取液，分別用50 mL正己烷洗滌3次，以除去脂溶性物質(zhì)；棄去正己烷萃取層，將收集到的甲醇粗提液于35 ℃下真空旋蒸除去溶劑，再用甲醇溶液(色譜純)洗滌溶解殘液，分別定容至5 mL。預試驗結(jié)果顯示茶葉籽油中4-羥基苯乙酸、表沒食子兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯4個組分含量較低，故除上述操作之外，在對這4種組分進行定量時，樣品最終定容至500 μL。每個樣品重復3次。所有樣品過0.45 μm濾膜，置于-20 ℃下待測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：WondaSil反相C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-乙腈-乙酸(5∶5∶0.1)(A)，0.2%乙酸水溶液(B)，總流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，紫外檢測波長280 nm，進樣體積10 μL。采用多級線性梯度洗脫程序，0.01～5 min，90%(B)；5.01～10 min，90%～80%(B)；10.01～20 min，80%～75%(B)；20.01～35 min，75%～0(B)；35.01 min～40 min，0%(B)；40.01～45 min，0～90%(B)。每次進樣前平衡10 min。

1.2.4 線性關(guān)系考察

將配制好的混合對照品溶液，按1.2.3色譜條件進樣分析。每個樣重復進樣3次，以對照品的質(zhì)量濃度X(mg/L)對峰面積Y進行線性回歸分析。

1.2.5 色譜峰定性、定量

在相同色譜條件下，首先將14種單體酚分別進樣，確定各單體酚的保留時間和出峰順序；再對不同濃度的混合標準品溶液進行測試，以峰面積Y為縱坐標，質(zhì)量濃度X為橫坐標,計算得到14個標準曲線回歸方程。將茶葉籽油提取物按照同樣色譜條件進行測試，得到未知組分色譜圖。將已知純物質(zhì)和未知物峰的保留時間進行比較，初步定性鑒定出未知物；然后向油多酚提取樣品中分別加入這14種單體酚進行測試，將得到的色譜圖與原未知組分色譜圖進行比較，根據(jù)峰高是否增加來驗證各個組分，完成茶葉籽油提取物中酚類化合物的定性。根據(jù)1.2.4中14種標準品的線性回歸方程計算茶葉籽油提取物中鑒定出的酚類化合物含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

用甲醇-水和乙腈-水作流動相進行洗脫，發(fā)現(xiàn)酚類化合物的色譜峰出現(xiàn)嚴重拖尾現(xiàn)象，這是由于多酚物質(zhì)化學結(jié)構(gòu)上的酚羥基在中性溶液中易發(fā)生解離，停留在固定相表面，從而不易實現(xiàn)物質(zhì)間完全分離[16]。而加入酸把流動相的pH值降低，可以抑制酚羥基的解離，酚類化合物變成疏水締合物，明顯提高分離度和改變峰形；但如果洗脫液的酸值太高，則易損壞色譜柱降低柱效[16-17]。參考趙清潔[18]利用HPLC分析多酚的方法，考察了流動相中有機相的組分和配比(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選用甲醇-乙腈-乙酸(5∶5∶0.1)和0.2%乙酸水溶液作流動相，分離效果較好，因此，本試驗采用甲醇-乙腈-乙酸(5∶5∶0.1)和0.2%乙酸水溶液作為流動相進行試驗。

注：a. 甲醇+0.2%乙酸水溶液，b. 甲醇-乙腈(5∶5)+0.2%乙酸水溶液，c. 甲醇-乙腈-乙酸(5∶5∶0.1)+0.2%乙酸水溶液。圖1 采用不同流動相分離混標的色譜圖

2.2 色譜條件的選擇

選用不同比例的甲醇-乙腈-乙酸(5∶5∶0.1)進行等度洗脫，發(fā)現(xiàn)混合標準品中的各組分無法均勻分離開，這是由于標品之間極性相差較大，故采用梯度洗脫。選擇甲醇-乙腈-乙酸(5∶5∶0.1)(A)，0.2%乙酸水溶液(B)為流動相，參考相關(guān)文獻[18-20]，進行多次試驗比較，探索適合茶葉籽油酚類化合物分析的梯度洗脫方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如表1所示的洗脫條件下14種對照品能得到最佳的分離效果。同時根據(jù)文獻[18]和多次試驗比較，最終確定流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，紫外檢測波長280 nm，進樣體積10 μL條件下，14種酚類化合物間分離效果達到最好，色譜圖如圖2所示。同時，為了確保每次分析的色譜峰保留時間、峰形及分離效果的準確性，每次分析結(jié)束后，用同樣的梯度洗脫方法清洗2次色譜柱。

表1 梯度洗脫程序

注：1.沒食子酸；2.羥基酪醇；3.表沒食子兒茶素；4.4-羥基苯乙酸；5.兒茶素；6.表兒茶素；7.咖啡酸；8.表沒食子兒茶素沒食子酸酯；9.表兒茶素沒食子酸酯；10.苯甲酸；11.肉桂酸；12.蘆??；13.槲皮素；14.山奈酚。下同。圖2 14種多酚化合物標準品HPLC色譜圖

2.3 線性關(guān)系

將14種單體酚按照優(yōu)化后的色譜條件分別進樣，確定各單體酚的保留時間和出峰順序，對不同濃度的混合標準品溶液進行測試。分別以各個對照品溶液的質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標，相應(yīng)峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸分析，根據(jù)信噪比S/N=3，測得各組分最低檢測濃度。各個單體酚的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、線性范圍和檢出限如表2所示。由表2可見，在線性范圍內(nèi)各標準品溶液濃度與峰面積相關(guān)性良好。

表2 標準品的線性回歸方程

2.4 方法的精密度(重復性)

取同一混合標準品溶液，按照優(yōu)化后的色譜條件進行分析，平行測定6次，各峰面積的相對標準偏差(RSD)在0.2%～10.8%之間，保留時間的RSD在0.1%～2.1%之間，表明該方法具有較好的精密度(重復性)。

2.5 茶葉籽油中酚類化合物組成分析

稱取茶葉籽油50.0 g樣品3份，按照1.2.1方法進行前處理，利用已確定的HPLC條件對油提取物中多酚化合物進行分析，色譜圖如圖3所示。按照1.2.5定性定量方法，比較各未知峰和已知單體酚的保留時間以及加標試驗，最終確定樣品中各個組分，將每種物質(zhì)所得面積根據(jù)線性方程計算出相應(yīng)含量，分析結(jié)果見表3。其中由于表沒食子兒茶素、4-羥基苯乙酸、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯4種組分在茶葉籽油中含量較低，導致色譜響應(yīng)水平低，因此在對這4個組分進行定量分析時采取將樣品提取液濃縮定容至500 μL，以提高響應(yīng)水平。所選定的14種單體酚作為對照品主要是根據(jù)前人的研究結(jié)果進行的[10-11]。從茶葉籽油中鑒定出13個酚類化合物，包括沒食子酸、苯甲酸、咖啡酸、4-羥基苯乙酸、反式肉桂酸、表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、蘆丁、槲皮素及山奈酚。

圖3 茶葉籽油樣品中酚類化合物HPLC圖

表3 茶葉籽油提取物中酚類化合物組分和含量(n=3)

如表3定量結(jié)果顯示，在13種酚類化合物中山奈酚的含量最高，其次是兒茶素、咖啡酸，表沒食子酸兒茶素(EGC)的含量最低。從HPLC分析中得到，茶葉籽油總酚含量為106.98 μg/g。根據(jù)化學結(jié)構(gòu)劃分，這13種酚類化合物可分為酚酸類、兒茶素類及黃酮類3大類化合物。茶葉籽油中酚酸類化合物總量為46.8 μg/g，其中肉桂酸的含量最高，4-羥基苯乙酸最低。由于化學結(jié)構(gòu)上，4-羥基苯乙酸比肉桂酸側(cè)鏈短，并且側(cè)鏈上比肉桂酸多一個羥基，所以4-羥基苯乙酸的極性更大，因此不易溶于油相。兒茶素類化合物在茶葉籽油中總含量為21.72 μg/g，其中兒茶素含量最高，表沒食子兒茶素最低。如圖3所示，兒茶素類化合物中表沒食子兒茶素最先被洗脫，其結(jié)構(gòu)上比兒茶素多1個羥基，極性更大，更難溶于油相，檢測到的含量較低。兒茶素類EGCG在茶葉中含量豐富[21]，在茶葉籽油中亦比較高，這是由于兩者之間存在同源關(guān)系。在茶葉籽油中檢測到3種黃酮類化合物，分別是山奈酚、槲皮素及蘆丁，總量為40.16 μg/g，其中山奈酚的含量最高，其化學結(jié)構(gòu)上比槲皮素、蘆丁所含的羥基少，極性更弱，使其更易溶于油相且更遲洗脫分離。

Fazel等[6]從茶葉籽油中鑒定出其含有沒食子酸(GC)、兒茶素(C)、表沒食子兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)及兒茶素沒食子酸酯(CG)8種兒茶素類化合物，而本試驗僅檢測到其中6種，其主要原因可能在于茶樹品種及物質(zhì)含量存在不同之處，以及多酚物質(zhì)提取方法和檢測條件的差異。盡管茶樹品種和產(chǎn)地來源不同，但研究中茶葉籽油均見兒茶素酯型化合物，如EGCG、ECG、EGC等，這在其他植物油中鮮見有相關(guān)報道，可作為茶葉籽油鑒定的標記。

3 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化色譜分析條件，建立高效液相色譜法測定茶葉籽油提取物中酚類化合物。以甲醇-乙腈-乙酸為流動相經(jīng)反相液相色譜柱，在流速1.0 mL/min、柱溫35 ℃、紫外檢測波長280 nm條件下，對混合標準品進行分析。所有組分均得到有效分離，在0.01～0.50 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.99以上，檢出限為0.000 3～0.010 0 mg/mL，相對標準偏差為0.2%～10.8%，表明該方法準確度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均可靠。

運用該方法測定茶葉籽油樣品，共鑒定出13種酚類化合物，分別是沒食子酸、咖啡酸、表沒食子兒茶素、4-羥基苯乙酸、槲皮素、蘆丁、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、反式肉桂酸、山奈酚及苯甲酸，根據(jù)結(jié)構(gòu)劃分為酚酸類、兒茶素類和黃酮類三大類化合物。同時，定量分析表明，茶葉籽油中總酚含量為106.98 μg/g，主要以酚酸類和黃酮類化合物為主，其中山奈酚含量最高，表沒食子兒茶素最低。另外，從所檢測到的酚類化合物化學結(jié)構(gòu)上分析，化合物極性越低，苯環(huán)上所含羥基越少，苯環(huán)側(cè)鏈越長，更易溶解于油中。通過本研究進一步明確了茶葉籽油中酚類化合物的組成，這些化合物從結(jié)構(gòu)上初步解釋茶葉籽油所表現(xiàn)出來的多方面功能，并為茶葉籽油的深度開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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Determination of Phenolic Compounds inCamelliaSinensisSeed Oil by RP-High-Performance Liquid Chromatography-DAD

Zeng Qiumei Liang Xingqiu Wang Xiaoqin Lu He
(College of Chemical Engineering；Institute of Oil and Natural Product,Huaqiao University, Xiamen 361021)

The high performance liquid chromatographic (HPLC) was established for separation and determination of the components and contents of various phenolic compounds in tea seed oil. Compared the the influence of the mobile phase component, the suitable acetic acid addition was added to establish optimal gradient elute condition. Good separation was performed for 14 phenolic compounds under the optimal conditions with linearly dependent coefficient of various materials above 0.99. 13 phenolic compounds, including 5 phenolic acids, 3 flavonoids and 5 catechinic acid, were detected by the proposed method. The contents were 46.8, 21.72 and 40.16 μg/g, respectively. The maior compositions of phenolic acids were cinnamic acid and caffeic acid, major compositions of flavonoids were quercetin, kaempferol and rutin, while catechinic acid was the major catechin compounds. The method, accurate and reliable, was applicable for analysis of phenolic compound in tea seed oil. It provided a basic data of phenolic compounds of tea seed oil, providing a reference for further study.

Camelliasinensisseed oil, phenolic compounds, high-performance liquid chromatographic (HPLC)

福建省重點科技計劃(2012N0016)

2015-09-28

曾秋梅，女，1990年出生，碩士，油脂及天然活性成分開發(fā)

王曉琴，女，1977年出生，副教授，油脂及天然活性成分開發(fā)

TS225.1

A

1003-0174(2017)04-0141-06