木霉菌可濕性粉劑藥效的提高技術

田連生+陳菲

摘要：為提高木霉菌可濕性粉劑防效和藥效速度，對影響木霉分生孢子萌發(fā)的不同因子進行研究。結果表明，蛋白胨、酵母粉和乳糖、蔗糖等對木霉孢子萌發(fā)均有顯著的促進作用，溫度25～30 ℃、pH值 4～6和飽和濕度環(huán)境是孢子萌發(fā)的適宜條件。木霉孢子在水中萌發(fā)率很低，光照對孢子萌發(fā)無顯著影響；孢子萌發(fā)率和萌發(fā)速率是影響木霉可濕性粉劑生防效果和藥效速度的主要原因。室內離體防效試驗結果也證明，添加0.4%蛋白胨和乳糖，調節(jié)pH值至5，3 d時對黃瓜灰霉病防效可達85.6%，而未作處理的藥液7 d防效才達84.2%。本研究結果也對該產(chǎn)品的生產(chǎn)和田間應用提出了改進建議。

關鍵詞：木霉菌；分生孢子；萌發(fā)條件；萌發(fā)率；可濕性粉劑；影響因子；生防效果；室內離體防效

中圖分類號： S476文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0097-03

生物農(nóng)藥特別是活體生物農(nóng)藥對農(nóng)作物病害的防治作用，除與其代謝產(chǎn)物有關外，還與活體微生物的生物學特性有更加密切的關系。一般生物農(nóng)藥具有藥效緩慢、易受環(huán)境因素制約、防效不穩(wěn)定等缺點，這些都不利于活體微生物農(nóng)藥的使用和推廣。木霉菌（Thichoderma spp.）由于具有多重的生防機制和良好的防治效果越來越受到人們的重視。目前，已有商業(yè)化產(chǎn)品——木霉菌可濕性粉劑出售。木霉分生孢子為木霉可濕性粉劑的有效成分，其孢子生物學特性及孢子萌發(fā)條件是影響木霉菌發(fā)揮其生防作用的首要條件。因為木霉菌對植物病原菌的生防機制主要是競爭、重寄生和抗生素作用[1-5]。而前2個影響因子均與木霉分生孢子萌發(fā)有著密切關系。因此，研究木霉分生孢子萌發(fā)相關影響因子[6-8]，提高其孢子萌發(fā)率和萌發(fā)速度，就可提高木霉菌可濕性粉劑的防治效果和藥效速度。本研究結果無論是對廠家生產(chǎn)產(chǎn)品，還是農(nóng)民在田間應用該生物農(nóng)藥防治農(nóng)作物病害均具有重要的指導意義。

1材料與方法

1.1供試材料

木霉菌可濕性粉劑（2億個/g），山東泰諾藥業(yè)有限公司；50%多菌靈可濕性粉劑，日本住友化學株式會社；灰葡萄孢菌（Botrytis cinera），由筆者所在實驗室從感染灰霉病的黃瓜上分離、純化得到。

1.2不同氮源對孢子萌發(fā)的影響

將一定量的木霉菌可濕性粉劑加入0.4%蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉浸膏等有機氮源溶液中，制成100萬個/mL孢子懸浮液；以同樣方法配制NH4NO3、（NH4）2SO4等無機氮源的孢子懸浮液。分別取上述懸浮液0.05 mL滴于載玻片上，置于28 ℃恒溫箱中保濕培養(yǎng)12、24 h，觀察分生孢子萌發(fā)情況，每處理重復3次，計算孢子萌發(fā)率，同時用無菌水制成相同濃度的孢子懸浮液作空白對照。孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子平均數(shù)/（ 萌發(fā)孢子平均數(shù)+未萌發(fā)孢子平均數(shù)）×100%。

1.3不同碳源對孢子萌發(fā)的影響

將木霉可濕性粉劑分別用0.4%葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉溶液稀釋成100萬個/mL孢子懸浮液。按“1.2”節(jié)方法進行處理，計算孢子萌發(fā)率。

[HTK]1.4溫度對孢子萌發(fā)的影響[HT]

取一定量木霉可濕性粉劑，分別用0.4%蛋白胨溶液和無菌水稀釋為含孢子濃度100萬個/mL的懸浮液，各取 0.05 mL 滴于萌發(fā)載玻片上，分別置于10、20、25、28、30、40 ℃ 不同溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，鏡檢孢子萌發(fā)情況，每處理重復3次，計算孢子萌發(fā)率。

1.5相對濕度對孢子萌發(fā)的影響

將木霉可濕性粉劑用0.4%蛋白胨溶液配制成孢子濃度為100萬個/mL 懸浮液，取 0.05 mL滴于載玻片上快速風干，置于人工氣候箱中，分別在80%、90%、95%、100%相對濕度下作孢子萌發(fā)試驗，每處理重復3次，培養(yǎng)24 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況，計算孢子萌發(fā)率。

1.6pH值對孢子萌發(fā)的影響

取木霉菌可濕性粉劑，用0.4%蛋白胨溶液稀釋為100萬個/mL 懸浮液，用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl溶液調節(jié)溶液pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9，各取 0.05 mL溶液滴于載玻片上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況，每處理重復3次，計算孢子萌發(fā)率。

1.7光照對孢子萌發(fā)的影響

用0.4%蛋白胨作營養(yǎng)液制成100萬個/mL木霉孢子懸浮液，取 0.05 mL滴于載玻片上，在光照和黑暗條件下于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h，鏡檢孢子萌發(fā)情況，每處理重復3次。

[HTK]1.8室內離體防效測定[HT]

采用離體葉片法[9]測定防效。選取健康無病的黃瓜葉片，剪下后用無菌水反復沖洗，先噴濃度為0.1億個/mL的灰霉菌孢子懸浮液，保溫培養(yǎng)1 d后再噴A（用0.4%蛋白胨和乳糖溶液把木霉可濕性粉劑稀釋成500倍液，并用0.1 mol/L HCl溶液調節(jié)pH值到5）、B（用無菌水把木霉可濕性粉劑稀釋成500倍液）、C（用等量無菌水作空白對照）3個處理藥液；葉柄用脫脂棉纏繞，滴加0.5%葡萄糖無菌液，置于培養(yǎng)皿內，于25 ℃下保溫保濕培養(yǎng)；每個處理10張葉片，重復3次，分別在培養(yǎng)后3、7 d調查葉片病情指數(shù)，并計算防治效果。其中病情指數(shù)分級標準：0級，無病斑；1級，病斑面積占整個葉面積的5%以下；2級，病斑面積占整個葉面積的 6%～10%；3級，病斑面積占整個葉面積的11%～25%；4級，病斑面積占整個葉面積的26%～50%；5級，病斑面積占整個葉面積的50%以上。病情指數(shù)=100×∑（各級病葉數(shù)×相應級數(shù)）/（調查總葉數(shù)×最高級級數(shù)）；防治效果=（對照病情指數(shù)-用藥病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

2結果與分析

2.1不同氮源對孢子萌發(fā)的影響

由圖1可見，有機氮源對木霉分生孢子萌發(fā)促進作用明顯，在蛋白胨溶液中培養(yǎng)后12 h，萌發(fā)率即可達到87.56%；培養(yǎng)后24 h，達88.62%，在牛肉膏和酵母粉溶液中培養(yǎng)也達到75.2%和79.1%。而無機氮源促進作用較弱，只有（NH4）2SO4溶液中達到46.6%，NH4NO3達到30.5%。說明有機氮源對孢子萌發(fā)有明顯的促進作用。木霉分生孢子在水中培養(yǎng)12 h沒有萌發(fā)，培養(yǎng)24 h也只有15.3%，培養(yǎng)后 152 h 萌發(fā)率僅達到80%。由此可見，木霉孢子在純水中萌發(fā)率低，萌發(fā)速度慢，這也是導致其藥效緩慢的主要原因。

2.2不同碳源對孢子萌發(fā)的影響

碳源對木霉孢子萌發(fā)促進的作用不如氮源明顯。由圖2

可知，乳糖對孢子萌發(fā)促進作用較大，培養(yǎng)后24 h，萌發(fā)率達到32.8%；蔗糖次之，為27.9%；麥芽糖和葡萄糖對孢子萌發(fā)促進作用較小，萌發(fā)率分別為19.6%和16.7%；可溶性淀粉則對孢子萌發(fā)基本無促進作用。木霉孢子在無菌水中培養(yǎng)12 h未萌發(fā)，培養(yǎng)24 h萌發(fā)率只有15.5%。

2.3溫度對孢子萌發(fā)的影響

溫度對木霉孢子萌發(fā)作用明顯。由表1可以看出，木霉孢子在10～40 ℃均可萌發(fā)。開始時，隨著溫度升高，孢子萌發(fā)率逐漸升高；但28 ℃后，孢子萌發(fā)率呈下降趨勢?？梢婃咦用劝l(fā)適宜溫度為25～30 ℃，在此溫度條件下孢子萌發(fā)率較高，且芽管生長旺盛。而在無菌水中的孢子萌發(fā)率均較低。

木霉孢子萌發(fā)需要高濕環(huán)境。由圖3可見，木霉孢子在相對濕度為80%的條件下培養(yǎng)24 h不萌發(fā)；相對濕度為90%時，孢子萌發(fā)率達到13%；相對濕度為95%時，萌發(fā)率為55.2%；而在液滴中孢子萌發(fā)率高達88.8%。表明木霉分生孢子萌發(fā)率與相對濕度呈正相關性。

2.5pH值對孢子萌發(fā)的影響

pH值對孢子萌發(fā)作用明顯（圖4），pH值為2～9范圍內，木霉孢子均能萌發(fā)，其中以pH值為5時萌發(fā)率最高，24 h

達到87.8%；適宜pH值為4～6，萌發(fā)率均達到80%以上。而當pH值<3或>7時，萌發(fā)率則明顯下降。說明木霉孢子在弱酸性條件下萌發(fā)較好，而堿性或強酸性時均不適于孢子萌發(fā)。

2.6光照對孢子萌發(fā)的影響

連續(xù)光照24 h后，木霉孢子萌發(fā)率為87.1%；避光黑暗處理24 h后，萌發(fā)率為86.7%，2個處理無明顯區(qū)別，說明光照對木霉孢子萌發(fā)沒有明顯作用。

2.7室內離體防效試驗

由室內防治效果（表2）可以看出，碳源、氮源的加入與適宜的pH值確實可以提高木霉可濕性粉劑的防治效果和藥效速度。培養(yǎng)3 d時，A處理的防治效果已達到85.6%，與培養(yǎng)7 d的防效比較接近；而B處理在培養(yǎng)3 d時的防效只有677%，培養(yǎng)7 d時也只達到84.2%。進一步驗證了添加少量的氮源、碳源和調整藥液適宜pH值，可提高木霉可濕性粉劑的防治效果和藥效速度。

3討論與結論

本試驗就氮源、碳源、溫度、pH值、相對濕度和光照6個因素對木霉分生孢子萌發(fā)的影響進行研究，結果表明，有機氮源蛋白胨、牛肉膏和酵母粉等對孢子萌發(fā)有較好的促進作用，而無機氮源作用不大；碳源及光照對木霉孢子萌發(fā)促進作用不明顯；適宜溫度為25～30 ℃、pH值為4～6，這與木霉屬的菌落生長特性相一致。試驗結果與高克祥等的研究結論[6-7]基本一致。為了進一步驗證試驗結果，本研究還通過室內離體防效試驗，在配制木霉可濕性粉劑藥液時添加04%蛋白胨和乳糖，并調pH值至5，對黃瓜灰霉病的防效和作用速度明顯優(yōu)于純水配制的藥效。為了增加活體生物農(nóng)藥的藥效速度、提高防治效果，生產(chǎn)廠家在配制產(chǎn)品以及農(nóng)民在使用木霉菌劑時應注意以下幾點。

3.1合理添加碳氮元素

根據(jù)“2.1”“2.2”“2.5”節(jié)試驗結果，廠家在配制產(chǎn)品時可添加少量蛋白胨粉或酵母粉和蔗糖等物質，在不影響農(nóng)藥質量前提下，盡量選擇酸性助劑；農(nóng)民在噴施木霉可濕性粉劑時，也可在水中添加少量硫酸銨、蔗糖等，還可加少量食醋降低藥液pH值。

3.2選擇施藥時間

根據(jù)“2.3”“2.4”“2.6”節(jié)試驗結果，在春秋季節(jié)噴施農(nóng)藥時應選擇在氣溫較高的中午進行，這樣夜里相對濕度大，從而有利于孢子萌發(fā)；但夏季中午溫度較高，藥液很容易被蒸發(fā)而減少相對濕度，所以應在16：00后或陰天時進行噴施；在冬季溫室大棚中使用時，中午施藥不但棚內溫度高，相對濕度也大，更利于木霉孢子萌發(fā)。總之，應根據(jù)季節(jié)和天氣情況選擇適宜的時間施藥，才能提高藥效，減少環(huán)境因素對活體生物農(nóng)藥的藥效影響。

木霉菌可濕性粉劑是活體生防菌劑，研究其分生孢子萌發(fā)的影響因子，對生產(chǎn)廠家配制藥劑和農(nóng)民田間應用都具有重要的指導意義。有關木霉可濕性粉劑在植物病害防治的微生態(tài)環(huán)境及其分生孢子萌發(fā)和在植物葉面上的定殖條件等影響因子，都有待進一步深入研究。

[HS2*2][HT8.5H]參考文獻：

[1]易茜茜，丁萬隆，李勇. 木霉菌及其對植物病真菌病害的防治機制[J]. 中國農(nóng)學通報，2009，25（20）：228-231.

[2]Ahmed S A，Sanchez C P，Candela M E. Evaluartion of induction of systemic resistance in pepper plants to Phytophthora capsici using Trichoderma harzianum and its relation with capsidiol accumulation[J]. European Journal of Plant Pathology，2000，106：817-824.

[3]Papavizas G C，Lumsden R D.Biological control of soilborne fungal propagules[J]. Ann Rev Phytopathology，1980，18：389-413.

[4]陳立華，金秋，牛明，等. 棘孢木霉對水稻紋枯病病原菌立枯絲核菌生物防治的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（5）：115-117.

[5]孫勇，蔣繼宏，張海燕. 植物內生木霉的鑒定及其抑菌活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（2）：332-333.

[6]高克祥，劉小光，陳晉江，等. 木霉菌株T95生物學特性的研究[J]. 河北林果研究，1998，13（4）：359-365.

[7]紀明山，李博強，許遠，等. 綠色木霉TR-8菌株的生物學特性研究[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2004，35（3）：195-199.

[8]王芊. 木霉菌株BTW41分生孢子萌發(fā)條件研究[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2002（5）：5-6.

[9]方中達. 植病研究方法[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979.