1株嗜熱性羽毛降解菌的分離鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)

劉艷海+姚大偉+劉建新+楊德吉

摘要：為從環(huán)境中得到1株嗜熱高效角蛋白降解菌，用以羽毛粉為唯一碳源、氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。經(jīng)篩選得到1株嗜熱降解羽毛角蛋白的Y6菌株，通過對(duì)該菌株菌落、菌體形態(tài)特征、生理生化特性測定和16S rRNA分析，使用美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLAST進(jìn)行16S rRNA的相似性比對(duì)。相似性比對(duì)結(jié)果顯示，Y6菌株與地衣芽孢桿菌Xmb047（Bacillus licheniformis Xmb047）的同源性99%，初步認(rèn)定該菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），命名為Y6（GenBank登陸號(hào)KY082766）。采用該菌降解完整羽毛，發(fā)酵72 h后，完整羽毛僅剩下羽軸，羽枝被完全降解，說明Y6菌株有著較強(qiáng)的羽毛降解能力；用不同濃度硫酸銨溶液鹽析發(fā)酵產(chǎn)物上清液，篩選出硫酸銨濃度為70%時(shí)，分離的粗酶液總活性最高。酶活性試驗(yàn)表明，Y6所產(chǎn)蛋白酶最適反應(yīng)溫度為70 ℃，最適pH值為8.0，F(xiàn)e3+、Zn2+對(duì)蛋白酶活性有較強(qiáng)的抑制作用，陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）、金屬蛋白酶抑制劑乙二胺四乙酸（EDTA）能較強(qiáng)地抑制蛋白酶活性，表明該蛋白酶屬于金屬蛋白酶。

關(guān)鍵詞：嗜熱性角蛋白降解菌；角蛋白酶；羽毛角蛋白；地衣芽孢桿菌Y6；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0232-06

近年來，家禽產(chǎn)品的生產(chǎn)和消費(fèi)呈全球化增長。羽毛是家禽屠宰后產(chǎn)生的廢棄物，且產(chǎn)量巨大，我國羽毛產(chǎn)量約為100萬t/年[1]。大量羽毛的廢棄不僅造成資源的巨大浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。羽毛粉中各類氨基酸齊全，含必需氨基酸，特別是含硫氨基酸含量較高。因此對(duì)這類資源加以充分利用將是蛋白飼料非常重要的補(bǔ)充[2]。

雖然角蛋白類廢棄物富含氨基酸，是飼料蛋白潛在而巨大的來源，但消化率非常低。如果能提高角蛋白類廢棄物的利用率，不但可為養(yǎng)殖業(yè)提供大量的飼料蛋白，而且能帶動(dòng)所有角蛋白類廢棄物的收集和加工產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展，從而對(duì)這些廢棄物的資源化利用和減排有積極的意義，減輕對(duì)環(huán)境造成的污染[3-4]。

筆者所在研究室已經(jīng)從某些特別動(dòng)物的胃腸道中分離得到100多株能降解角蛋白的微生物，如蘇云金芽孢桿菌NJY1，短小芽孢桿菌NJK4、NJQ2和蠟樣芽孢桿菌NJQ3等，在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)和中試試驗(yàn)中都表明，它們單獨(dú)或聯(lián)合進(jìn)行固體發(fā)酵，羽毛粉的降解率能達(dá)到80%，降解產(chǎn)物體外消化率達(dá)85%[5-6]。但是，這些微生物的應(yīng)用也有缺點(diǎn)：最佳發(fā)酵溫度在37 ℃，降解速度較慢，正常1個(gè)周期需要6～7 d才能充分降解。因此，對(duì)于規(guī)?；a(chǎn)，設(shè)備周轉(zhuǎn)慢、投資量大，這是制約菌株工業(yè)化發(fā)酵的重要條件[7]。為了分離1株高效耐高溫的羽毛角蛋白降解菌，筆者從云南騰沖熱泉水中取樣，經(jīng)過富集培養(yǎng)，采用以羽毛粉為唯一碳源、氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，以期為進(jìn)一步研究羽毛粉的微生物發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣品采集

樣品采集自云南騰沖熱泉水。

1.2培養(yǎng)基

營養(yǎng)培養(yǎng)基：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母提取物，10.0 g氯化鈉，補(bǔ)足蒸餾水至1 000 mL，pH值7.0；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母提取物，10.0 g氯化鈉，15.0 g 瓊脂粉，補(bǔ)足蒸餾水至1 000 mL，pH值7.0；篩選培養(yǎng)基：15.0 g羽毛粉，0.5 g NaCl，0.01 g CaCl2，0.4 g MgSO4·7H2O，0.35 g KH2PO4，0.7 g K2HPO4，15.0 g瓊脂粉，補(bǔ)足蒸餾水至1 000 mL，pH值7.0；種子培養(yǎng)基：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母提取物，10.0 g氯化鈉，補(bǔ)足蒸餾水至1 000 mL，pH值7.5；發(fā)酵培養(yǎng)基：15.0 g羽毛粉，0.5 g NaCl，0.01 g CaCl2，0.4 g MgSO4·7H2O，0.35 g KH2PO4，0.7 g K2HPO4，補(bǔ)足蒸餾水至1 000 mL，pH值7.5。

1.3增殖培養(yǎng)

量取1 mL采集的樣品于營養(yǎng)培養(yǎng)基中，55 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。

1.4篩選

取營養(yǎng)培養(yǎng)基中的菌液100 μL，涂布于篩選培養(yǎng)基平板，55 ℃培養(yǎng)24 h。挑選生長良好的單菌落，重新劃線篩選培養(yǎng)基平板，純培養(yǎng)，保種備用。

1.5細(xì)菌鑒定

1.5.1菌落及菌體形態(tài)觀察將分離純化的菌株劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，55 ℃培養(yǎng)24 h。肉眼觀察菌落的形狀、顏色、表面質(zhì)地以及菌落邊緣。經(jīng)革蘭氏染色后于光學(xué)顯微鏡及電鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.5.2菌株生長溫度范圍測定將100 μL純培養(yǎng)得到的菌液接種到裝有3 mL營養(yǎng)培養(yǎng)基的試管中，分別于35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃水浴培養(yǎng)12 h。通過測定培養(yǎng)液中的D600 nm來確定其生長溫度范圍及最適生長溫度。

1.5.3菌株生長pH值范圍測定將純培養(yǎng)得到的100 μL菌液分別接種到pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、90、9.5、10.0的3 mL營養(yǎng)培養(yǎng)基中，55 ℃培養(yǎng)12 h。通過測定培養(yǎng)液中的D600 nm來確定其生長pH值范圍及最適生長pH值。

1.5.4生理生化特性的鑒定參照文獻(xiàn)[8]對(duì)該菌株的生理生化特性進(jìn)行鑒定。

1.5.516S rRNA分析吸取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液，98 ℃金屬浴10 min，金屬浴后，將溶液于13 000 r/min離心3 min，吸取5 μL作為PCR擴(kuò)增模板。采用16S rRNA基因的通用引物[9]配成 50 μL 體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。上游引物（1492R）：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，下游引物（8F）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的基因序列進(jìn)行同源性比較。

1.5.6系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建與分析用BLASTn程序在GenBank中進(jìn)行相似性對(duì)比，選取相似性較大的序列用Mega 5.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用鄰接法（Neighbor-Joining，簡稱N-J）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[8]。

1.6羽毛降解能力測定

將篩選得到的純化菌株分別接種至種子培養(yǎng)基中，55 ℃、150 r/min培養(yǎng)過夜。將種子液分別接種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，55 ℃、150 r/min培養(yǎng)，觀察羽毛降解情況。

1.7粗酶的制備

從羽毛粉培養(yǎng)基平板挑選單個(gè)菌落接種至種子培養(yǎng)基上，55 ℃搖床培養(yǎng)過夜。按照10%的接種量接種羽毛粉發(fā)酵培養(yǎng)基，在55 ℃的條件下，在搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)72 h，取發(fā)酵液，于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液。

去上述上清液分別加入硫酸銨，使硫酸銨飽和度分別達(dá)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，室溫下靜置 24 h，8 000 r/min離心20 min棄去上清液，沉淀用0.2 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶解至原體積的1/10。隨后對(duì)蛋白酶活性進(jìn)行測定。選擇合適的硫酸銨濃度，鹽析后沉淀采用 1/10 原體積的0.2 mol/L PBS溶解，裝入透析袋中，然后置于4 ℃，用去離子水透析24 h，透析袋中即為粗酶液。

1.8粗酶蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.8.1蛋白酶活性的測定參照Folin試劑顯色法[10]，略有改動(dòng)。取上述粗酶液1 mL，置于60 ℃水浴中預(yù)熱2 min，再加入經(jīng)同樣預(yù)熱的1 mL 2%酪蛋白溶液，精確保溫30 min；時(shí)間到后，立即加入2 mL 0.4 mol三氯乙酸以終止反應(yīng)，繼續(xù)置于水浴中保溫20 min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心。取1 mL離心后的上清液，加入5 mL 0.4 mol/L碳酸鈉溶液、1 mL已稀釋的福林試劑，搖勻，40 ℃保溫發(fā)色20 min后進(jìn)行吸光度（D660 nm）測定。酶活單位：在40 ℃下1 min水解酪蛋白產(chǎn)生 1 μg 酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活性單位。

1.8.2溫度對(duì)酶活性的影響將粗酶液、酪蛋白混合后的反應(yīng)液分別置于40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴中反應(yīng) 30 min，測定蛋白酶活性。

1.8.3酶的熱穩(wěn)定性以酪蛋白為底物，將粗酶液置于不同溫度（50、60、70、80、90、100 ℃）中水浴處理，每20 min測定蛋白酶活性，研究不同溫度對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性的影響。

1.8.4酶的最適作用pH值采用不同pH值6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的Tris-鹽酸緩沖液和pH值9.4、10.0的硼砂-氫氧化鈉緩沖液配制2%酪蛋白底物，測定粗酶液的最適作用pH值。

1.8.5激活劑、抑制劑等不同試劑對(duì)酶活性的影響為研究激活劑、抑制劑對(duì)酶活性的影響，向酶液中加入不同的抑制劑、激活劑、表面活性劑、還原劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tween-80、苯甲基磺酰氟（PMSF）、TritonX-100、異丙醇、甘油和二甲基亞砜（DMSO）等，使各種試劑終濃度為5%，60 ℃下作用30 min，分析殘余酶活性。以去離子水代替修飾劑，在相同條件下測定酶活性，將此酶活性視為100%。

1.8.6金屬離子對(duì)酶活性的影響分別將含有0.1 mol/L [JP3]Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+、Fe2+、Fe3+的200 μL 0.05 mol/L、pH值7.5的Tirs-HCl緩沖液與1.8 mL粗酶液混合，使反應(yīng)體系中金屬離子的濃度達(dá)到10 mmol/L，60 ℃作用30 min，分析殘余酶活性。以去離子水代替代替修飾劑，在相同條件下測定酶活性，將此酶活性視為100%。

2結(jié)果與分析

2.1菌株篩選

在以羽毛為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基上，經(jīng)過多次傳代，分離到純的菌株，命名為Y6。

2.2菌體、菌落形態(tài)特征

Y6為革蘭氏陽性芽孢桿菌（圖1），大小約（0.5～2.5）μm×（1.2～10.0）μm，電子顯微鏡測量其大小為0.5 μm×2.0 μm（圖2）。Y6在普通營養(yǎng)瓊脂平板上，于 55 ℃ 恒溫培養(yǎng)12 h，菌落呈乳白色，圓盤狀，邊緣整齊或不整齊，表面光滑，有微皺褶突起，不透明（圖3）。

2.3生長溫度范圍及生長pH值范圍

將菌株置于不同溫度、pH值下培養(yǎng)，12 h后使用分光光度計(jì)測定菌液的D600 nm，以空白營養(yǎng)培養(yǎng)基作為對(duì)照。如圖4所示，培養(yǎng)溫度對(duì)Y6菌株的生長有著明顯的影響，在所選溫度范圍內(nèi)，菌體密度隨溫度的差異而變化，當(dāng)培養(yǎng)溫度低于37 ℃時(shí)，菌體生長緩慢；當(dāng)培養(yǎng)溫度在45～60 ℃之間時(shí)，菌體生長情況較好，且菌體的最適培養(yǎng)溫度為55 ℃，屬于嗜熱菌。如圖5所示，在pH值7.0～9.0時(shí)，菌體生物量較大，最適生長pH值為7.5。本試驗(yàn)結(jié)果與晏愛芬等分離的嗜熱地衣性芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）NHH4最適生長溫度一致[11]，同時(shí)兩者都具有較寬的反應(yīng)溫度范圍。

2.4Y6菌株的生理生化特性

由表1可見，Y6菌株甲基紅試驗(yàn)呈陽性，伏-普（V-P）試驗(yàn)呈陽性，吲哚試驗(yàn)呈陰性；能利用丙二酸鹽、檸檬酸鹽；能水解酪蛋白、淀粉，不能水解明膠；葡萄糖產(chǎn)氣呈陰性，能利用麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇；不能利用山梨醇、纖維二糖、半乳糖；反硝化作用呈陰性；硝酸鹽還原作用呈陽性；亞硝酸鹽還原作用呈陽性。由形態(tài)觀察及生理生化特征結(jié)果可以初步確定該菌株為芽孢桿菌屬。

2.5細(xì)菌16S rRNA基因分析

本研究分離的Y6菌株16S rRNA基因擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示，該菌基因約為1 400 bp（圖6）。該基因的GenBank登錄號(hào)為KY082766。使用美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLAST進(jìn)行16S rRNA的相似性比對(duì)，結(jié)果顯示，該基因與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）strain Xmb047（GenBank登錄號(hào)：KT986173）的同源性99%。利用Mega5.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖7所示，Y6菌株與地衣芽孢桿菌屬地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）PF1-3.1（GenBank登錄號(hào)：KT720020）的親緣關(guān)系最近，同源性較高。結(jié)合細(xì)菌形態(tài)學(xué)及生理生化特性鑒定，初步認(rèn)定該菌株為地衣芽孢桿菌，命名為Y6。

2.6羽毛降解效果

如圖8所示，與對(duì)照組相比，36 h時(shí)試驗(yàn)組小羽開始掉落；隨著時(shí)間的推移，試驗(yàn)組羽毛上的小羽逐漸降解，大約 72 h 時(shí)，小羽完全降解，僅剩下羽柄，而對(duì)照組的羽毛基本沒有變化。由此可知，Y6有較強(qiáng)的羽毛降解能力。

2.7硫酸銨飽和度對(duì)酶提取的影響

由圖9可以看出，隨著硫酸銨濃度的不斷增加，沉淀的蛋白酶活性也不斷增強(qiáng)（呈線性正相關(guān)），當(dāng)硫酸銨濃度達(dá)70%時(shí)，沉淀中的蛋白酶活性占總蛋白酶活性的100%。為獲得較大的回收率，本試驗(yàn)采用70%的硫酸銨鹽析沉淀蛋白酶。

2.8溫度對(duì)蛋白酶活性的影響

如圖10所示，該蛋白酶在40～70 ℃之間隨溫度升高，酶活性逐漸增大，且溫度高達(dá)80 ℃時(shí)酶活性為38.38 U/mL，最適溫度為60～80 ℃；70 ℃時(shí)，酶活性最高，為50.52 U/mL；高于90 ℃時(shí)，酶活性降低迅速。結(jié)果表明， 該蛋白酶為一種高溫型蛋白酶，該酶的最適反應(yīng)溫度（70 ℃）高于Suntornsuk等報(bào)道的由B. licheniformis FK 14生產(chǎn)的熱穩(wěn)定性角蛋白酶的最適溫度60 ℃，同時(shí)，兩者都具有較寬反應(yīng)溫度范圍，在40～90 ℃ 范圍內(nèi)均能保持較高的酶反應(yīng)活性[12]。

如圖11所示所示，將粗酶液置于不同溫度中處理不同時(shí)間，用福林-酚法測定酶活性，粗酶在60～80 ℃之間，熱穩(wěn)定

性較好，可見溫度相對(duì)低的情況對(duì)粗酶破壞較輕；在高溫條件下，酶活性下降迅速，100 ℃作用20 min，粗酶活性完全喪失。結(jié)果表明，該蛋白酶具有一定的耐熱性，屬于耐熱性蛋白酶。

2.9pH值對(duì)蛋白酶活性的影響

由圖12可知，角蛋白粗酶在不同pH值緩沖體系中，60 ℃ 下用福林-酚法測定角蛋白酶活性，該酶的最適pH值為7.5～8.5，當(dāng)pH值為8.0時(shí)，酶活性達(dá)到最大值 50.24 U/mL，表明該角蛋白酶為堿性蛋白酶。Cheng等從地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）PWD-1中提取了1種蛋白酶，最適pH值為8.5[13]，比本試驗(yàn)提取的蛋白酶稍微耐堿。

2.10不同試劑對(duì)酶活性的影響

如圖13所示，EDTA、SDS、Tween-80、PMSF和TritonX-100抑制了蛋白酶的活性，其中EDTA、SDS對(duì)蛋白酶有很強(qiáng)的抑制作用，其處理分別只能達(dá)到總酶活性的34%、49%；異丙醇、甘油和DMSO對(duì)蛋白酶活性幾乎沒有影響。

2.11金屬離子對(duì)酶活性的影響

如圖14所示，在金屬離子中，Zn2+、Fe3+對(duì)蛋白酶抑制作

用最強(qiáng)，其處理的酶活性分別僅為酶總活性的21%、18%；Mn2+能大幅度增強(qiáng)蛋白酶的活性，為總酶活性的1.95倍；其余離子如Ca2+、Mg2+、Ba2+、Fe2+對(duì)蛋白酶活性影響不大。

3討論

微生物降解羽毛角蛋白和產(chǎn)角蛋白酶的過程中，目前地衣芽孢桿菌是被研究最多的，也是被認(rèn)為具有較強(qiáng)降解能力的芽孢桿菌屬。以美國北卡羅萊納州立大學(xué)的William等為代表，對(duì)地衣芽孢桿菌PWD-1（Bacillus licheniformis PWD-1）的降解能力、產(chǎn)酶特性、降解機(jī)制及分子生物學(xué)進(jìn)行深入全面的研究[14-16]，也將地衣芽孢桿菌PWD-1的角蛋白酶基因KerA轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌進(jìn)行基因工程方面的研究[17-18]。國內(nèi)外很少有嗜熱性菌株降解羽毛粉的研究，傅偉從土壤中分離出地衣芽孢桿菌ZJUQH（Bacillus licheniformis ZJUQH），并研究得出其最適發(fā)酵溫度為37 ℃[19]。本研究的菌株分離于云南騰沖熱海，是一種嗜熱性地衣芽孢桿菌。根據(jù)菌落形態(tài)、菌體形態(tài)特征、細(xì)菌生理生化特性、細(xì)菌16S rRNA基因分析，初步認(rèn)為Y6為地衣芽孢桿菌屬。Y6最適生長溫度為55 ℃，此溫度下發(fā)酵羽毛粉能抑制環(huán)境中大部分雜菌的生長，大大提高了發(fā)酵效率。

角蛋白酶是一種十分重要的工業(yè)酶，廣泛應(yīng)用于飼料、肥料、洗滌劑、皮革和制藥行業(yè)。但是在我國，角蛋白酶的品種和生產(chǎn)菌株都很單一。筆者分離的蛋白酶來源于嗜熱細(xì)菌地衣芽孢桿菌Y6（Bacillus licheniformis Y6），是一種嗜熱耐堿蛋白酶，在較高的溫度范圍（40～90 ℃）和較寬泛的pH值范圍（6.5～10.0）中均能發(fā)揮作用。EDTA、SDS強(qiáng)烈抑制該蛋白酶活性，說明該酶可能是一種金屬蛋白酶。抑制劑PMSF對(duì)該蛋白酶活性影響較小，PMSF為絲氨酸酶抑制劑，可能是由于絲氨酸不是該淀粉酶的活性中心。本研究以酪蛋白為底物，測定Y6所產(chǎn)蛋白酶的活性，酪蛋白水解活性測定是評(píng)測蛋白酶活性的標(biāo)準(zhǔn)方法，與使用不溶性的角蛋白或羽毛粉角質(zhì)溶解活性測定相比，能夠提供準(zhǔn)確的結(jié)果。菌株蛋白酶生產(chǎn)力由酪蛋白水解活性估計(jì)測定結(jié)果與角質(zhì)溶解活性測定結(jié)果具有很好的相關(guān)性[20]。

角蛋白降解菌篩選的標(biāo)準(zhǔn)通常為產(chǎn)透明圈大小和觀察降解完整羽毛的能力[21]。由于Y6菌株最適生長溫度為55 ℃，該溫度下羽毛瓊脂培養(yǎng)基水分蒸發(fā)較快，透明圈還沒有完全形成，培養(yǎng)基已被蒸干，嚴(yán)重干擾試驗(yàn)結(jié)果。因此，本試驗(yàn)采用觀察降解完整羽毛的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定性分析其降解能力，72 h后完整羽毛僅剩下羽軸，該菌無法徹底降解羽軸，其發(fā)酵條件的優(yōu)化須進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

從云南騰沖熱泉水中取樣，經(jīng)過富集培養(yǎng)，以羽毛粉為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基篩選，最終獲得1株嗜熱性羽毛降解菌，進(jìn)一步通過16S rRNA測序，初步鑒定菌株Y6為地衣芽孢桿菌，暫時(shí)命名為地衣芽孢桿菌Y6（Bacillus licheniformis Y6）。在完整羽毛降解的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，36 h時(shí)試驗(yàn)組小羽開始掉落，大約72 h時(shí)，小羽完全降解，僅剩下羽柄，具有較強(qiáng)的降解羽毛的能力。

Bacillus licheniformis Y6所產(chǎn)蛋白酶是一種嗜熱耐堿蛋白酶，該酶的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值分別為70 ℃、8.0。在測定金屬離子對(duì)蛋白酶活性的影響時(shí)，結(jié)果顯示，2價(jià)金屬離子Ba2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+沒有增強(qiáng)其蛋白酶的活性，說明該酶在催化反應(yīng)過程中不需要Ba2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+金屬離子的參與，F(xiàn)e3+、Zn2+對(duì)蛋白酶活性有較強(qiáng)的抑制作用。陰離子表面活性劑SDS對(duì)蛋白酶有較強(qiáng)的抑制作用，金屬蛋白酶抑制劑EDTA能較強(qiáng)地抑制蛋白酶的活性，表明該蛋白酶可能屬于金屬蛋白酶。3種有機(jī)溶劑DMSO、異丙醇、甘油對(duì)蛋白酶活性幾乎沒有影響，表明該蛋白酶在耐有機(jī)溶劑生物催化劑方面有潛在的應(yīng)用前景，在洗滌工業(yè)生產(chǎn)中也有較大的應(yīng)用價(jià)值。

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