經(jīng)NAs治療顯效慢乙肝患者PBMC中HBX基因檢測及臨床意義

宋亦然 李鴿 張航 王潔 蔣艷明 康艷華 高依丹 張彬彬 陳公英

310053 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(宋亦然)；310053 杭州師范大學附屬醫(yī)院(李鴿、王潔、蔣艷明、陳公英)；310053 杭州師范大學(張航、康艷華、高依丹、張彬彬、陳公英)

·病毒病診斷與治療·

經(jīng)NAs治療顯效慢乙肝患者PBMC中HBX基因檢測及臨床意義

宋亦然 李鴿 張航 王潔 蔣艷明 康艷華 高依丹 張彬彬 陳公英

310053 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(宋亦然)；310053 杭州師范大學附屬醫(yī)院(李鴿、王潔、蔣艷明、陳公英)；310053 杭州師范大學(張航、康艷華、高依丹、張彬彬、陳公英)

目的 檢測分析核苷(酸)類似物(Nucleoside analogues, NAs)治療后血清HBV DNA陰轉(zhuǎn)的慢乙肝(Chronic hepatitis B, CHB)患者外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中HBX基因，研究其臨床意義。方法 對60例經(jīng)抗病毒治療后血清HBV DNA陰轉(zhuǎn)的慢乙肝患者，其中有部分病情進展為乙肝后肝硬化(HBV-related liver cirrhosis)及肝細胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)，采用實時熒光定量PCR檢測其PBMC中HBX基因，并分析其序列特點及臨床意義。結(jié)果 60例患者中PBMC樣品檢測出HBX基因片段的有37例，檢出率61.67%(37/60)；三組人群中，HCC、乙肝后肝硬化患者PBMC中HBX基因檢出率明顯高于CHB患者(P=0.000,P=0.010)；通過直接測序法，在2例HCC患者及1例CHB患者中，檢測到HBX蛋白突變體蛋白HBX△120、HBX△129、HBX△131截短體；發(fā)現(xiàn)A389T/G391A、T380C兩個熱點突變，且HCC患者中A389T/G391A突變發(fā)生率明顯高于CHB患者(P=0.021)；對于HBeAg(-)的肝硬化、HCC患者，T380C突變發(fā)生率高于HBeAg(+)患者(P=0.035)。結(jié)論 經(jīng)NAs治療后血清HBV DNA陰轉(zhuǎn)的患者中，肝硬化、HCC患者的PBMC有更高的HBX檢出率；HCC患者A389T/G391A雙突變發(fā)生率高于CHB患者；HBeAg(-)的肝硬化、HCC患者T380C突變發(fā)生率高于HBeAg(+)患者。

Fund programs: Zhejiang Science and Technology Agency(2014C37081); Science and Technology Bureau of Hangzhou(20120533Q09)

在我國肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)的發(fā)生與慢性HBV感染密切相關，其機制迄今尚未充分闡明。研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染所致HCC患者的血清中存在著高頻自發(fā)的HBX突變體，可在癌組織中高表達[1]，提示HBX基因突變可能是HBV感染所致HCC發(fā)生的機制之一。此外，Zhang等在檢測外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)內(nèi)preS/S基因變異時發(fā)現(xiàn)，PBMC中能檢測到HBV RNA和HBV cccDNA，可間接反映肝細胞內(nèi)HBV DNA的存在[2,3]，是對血清HBX基因檢測的重要補充。相關文獻報道HBV整合入宿主細胞過程中，HBX的整合是最關鍵的一步，HBV相關的HCC患者中定期檢查發(fā)現(xiàn)HBX檢出率最高，表明HBX在HCC過程中發(fā)揮重要作用[4]。HBX基因頻繁整合于宿主基因組，引起染色體的不穩(wěn)定性缺失和插入突變的發(fā)生，導致HBX截短體的出現(xiàn)，對其反式激活功能發(fā)生影響[5,6]，表明HBX基因的突變與HCC的發(fā)生密切相關[7]。因此，本研究檢測臨床上經(jīng)NAs治療后血清HBV DNA陰轉(zhuǎn)的慢乙肝(Chronic hepatitis B, CHB)、乙肝后肝硬化及HCC患者PBMC中HBX基因突變易發(fā)位點，分析3組患者的突變特點及臨床意義，對CHB的進展及預后提供早期預警指標。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究共收集2015年2月至2015年8月于杭州師范大學附屬醫(yī)院住院的CHB、乙肝后肝硬化及HCC患者全血共60份，診斷標準符合中華醫(yī)學會肝病學分會、感染病學分會2011 年修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》(更新版)?；颊呷朐汉筮M行血常規(guī)、血液生物化學指標、病毒學指標、肝膽脾B超檢查。排除合并其他肝炎病毒感染、其他類型肝硬化等患者。

1.2 試劑與儀器 Super real premix(SYBR Green) 熒光定量預混試劑、DH5α化學感受態(tài)細胞、TBE電泳緩沖液、DNA green核酸染料、Marker購自北京天根生化科技有限公司；淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物有限公司；AxyPreP基因組DNA小量抽提試劑盒、AxyPreP DNA凝膠回收試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；E.Z.N.A.TM質(zhì)粒小提試劑盒購自美國Omega公司；PMD18-T載體購自大連寶生物工程有限公司；ABI 7500熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystem公司。

1.3 PBMC的分離及HBV DNA的提取 使用淋巴細胞分離液參照操作說明書對全血中的PBMC進行提??；使用AxyPreP基因組DNA小量抽提試劑盒參照說明書對PBMC中的HBV DNA進行提取。

1.4 SYBR Green熒光定量PCR 在GenBank中查取HBX基因序列，以HBX基因第382～401個堿基兩側(cè)相對保守區(qū)域設計引物和探針，正向引物序列為5′-cagcaatgtcaacgaccgacc-3′，反向引物序列為5′-aagttgcatggtgctggtg-3′，預期擴增產(chǎn)物148 bp，探針為FAM-agtacaaagacctttaaccta-MGB(序列方向5′→3′)。熒光定量PCR反應體系(20 μl)：2×Super Real Premix Plus 10 μl、正向引物(10 μmol/L)0.6 μl、反向引物(10 μmol/L)0.6 μl、DNA模板1 μl、50×ROX Reference Dye 0.4 μl、Rnase-free ddH2O 7.4 μl。實時熒光定量PCR反應條件為: 50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，40個循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

1.5 質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將PCR反應擴增產(chǎn)物20 μl經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，篩選出含有目的片段的標本，切膠回收后，連接到PMD18-T載體，連接質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌，經(jīng)氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基篩選單克隆菌株，并通過LB液體培養(yǎng)基搖菌擴增，每一份血清樣品選取5個質(zhì)粒，回收質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序。

1.6 目的DNA序列分析、對比 將測序結(jié)果(均測定優(yōu)勢序列)通過Chormas軟件及NCBI blast對比分析，以目前國內(nèi)公認B、C基因型HBX基因序列為參照序列，找出含有382～401堿基發(fā)生突變的結(jié)果，并分析其蛋白氨基酸突變模式。

1.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS16.0軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗及Fisher精確概率法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMC中目的HBX基因片段檢出情況 60例患者的PBMC樣品通過熒光定量PCR檢測后，檢出HBX基因片段的37例，檢出率61.67%；其中CHB患者檢出率26.32%(5/19)；乙肝后肝硬化患者檢出率71.43%(15/21)；HCC患者檢出率85%(17/20)。3組人群中HCC、乙肝后肝硬化患者PBMC中HBX基因檢出率明顯高于CHB患者(P=0.000, χ2=13.646;P=0.010, χ2=8.120)。見表1(卡方檢驗)。

表1 CHB、肝硬化、HCC患者PBMC中HBX基因檢出情況

表3 HBX基因熱點突變發(fā)生率

2.2 HBX基因突變情況 斷裂的HBX基因連接在細胞DNA上，轉(zhuǎn)錄成融合的蛋白稱為HBX蛋白截短體。本研究在2例HCC及1例CHB發(fā)現(xiàn)HBX截短體突變HBX△120、HBX△129、HBX△131，分別表示羧基末端第120、129、131個氨基酸截短體，見表2。

2.3 HBX基因熱點突變情況 經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)兩個熱點突變：A389T/G391A雙突變點及T380C點突變，其中在乙肝后肝硬化和HCC患者中A389T/ G391A雙突變發(fā)生率為73.33%、82.35%，T380C點突變發(fā)生率33.33%、35.29%。其中HCC患者的A389T/G391A雙突變發(fā)生率明顯高于CHB患者(P=0.021)，差異具有統(tǒng)計學意義；而肝硬化組與CHB組的A389T/G391A雙突變發(fā)生率相比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.109)。肝硬化和HCC組的T380C突變發(fā)生率與CHB組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.266，P=0.0.266)。見表3(卡方檢驗、單個頻數(shù)小于5時采用Fisher精確概率檢驗)。

表2 不同位點的突變情況

2.4 HBX基因熱點突變與HBeAg關系 32例檢出HBX基因的肝硬化、HCC患者中，HBeAg(+) 14例，HBeAg(-) 18例；HBeAg(-)和HBeAg(+)患者A389T/G391A雙突變發(fā)生率分別為88.89%、64.28%，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.095，χ2=2.789)；HBeAg(-)和HBeAg(+)患者T380C突變發(fā)生率分別為50.00%、14.28%，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.035，χ2=4.453)。見表4(卡方檢驗)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)PBMC內(nèi) HBV DNA與血清HBV相關，抗HBV治療過程中，PBMC內(nèi)HBV DNA下降緩慢[8]。本次實驗3組人群中HCC、乙肝后肝硬化患者PBMC內(nèi)HBX基因檢出率明顯高于CHB患者。另外隨著CHB進展為肝硬化、HCC，患者血清內(nèi)HBV DNA陰性而PBMC內(nèi)HBV DNA陽性所占比例顯著上升，推測由于HBV長期存在，HBV DNA可能發(fā)生整合，下一步需檢測PBMC中HBV DNA的存在形式。

表4 32例患者熱點突變與HBeAg關系

通過測序發(fā)現(xiàn)A389T/G391A、T380C兩個熱點突變，前者在HCC患者中的突變率明顯高于CHB患者；同時HBeAg(-)患者的T380C突變率高于HBeAg(+)患者。A389T/G391A雙突變點位于HBV的基本核心啟動子(Basic core promoter,BCP)區(qū)，該突變的發(fā)生會影響到該蛋白的功能，同時通過影響B(tài)CP區(qū)的功能降低前C區(qū)mRNA的轉(zhuǎn)錄，抑制HBeAg的合成引起肝細胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)A389T/G391A雙突變在HCC患者中發(fā)生率最高，因此，檢測A389T/G391A雙突變對判斷病情進展和預防HCC具有重要意義。另一方面，T380C點突變可能通過抑制前C mRNA轉(zhuǎn)錄活性，導致HBeAg的下調(diào)或不表達，表現(xiàn)為HBeAg(-)。

本實驗在2例HCC及1例CHB患者的HBX基因中檢測到HBX△120、HBX△129、HBX△131截短體存在。而相關研究發(fā)現(xiàn)，全長的HBX蛋白對細胞轉(zhuǎn)化可能起著負調(diào)控作用，羧基端的缺失可能使其在調(diào)節(jié)細胞增殖、生存和轉(zhuǎn)化方面出現(xiàn)了紊亂。HBX突變體尤其是C 端截短型的突變體可能是HBX引起HCC發(fā)生的重要機理。因此， CHB或肝硬化患者HBX基因發(fā)生羧基端的缺失，可能是發(fā)展為HCC的高?；颊?，值得以后進一步隨訪。此外，本文所進行的研究樣本量偏小，檢測序列片段較短，在后續(xù)研究中將加以完善。

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(本文編輯：呂新軍)

Analysis of HBX gene in PBMC from chronic hepatitis B patients with undetectable serum HBV DNA after treatment by nucleoside analogues

Song Yiran, Li Ge, Zhang Hang, Wang Jie, Jiang Yanming, Kang Yanhua, Gao Yidan, Zhang Binbin, Chen Gongying

Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China(Song YR); The Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, Hangzhou 310053, China(Li G, Wang J, Jiang YM, Chen GY); Hangzhou Normal University, Hangzhou 310053, China(Zhang H, Kang YH, Gao YD, Zhang BB, Chen GY)

Chen Gongying, Email: liuxingli0329@163.com

Objective Study the clinical significance of HBX gene detection, sequence analysis in peripheral blood mononuclear cell(PBMC) of chronic hepatitis B(CHB) patients with serum HBV DNA negative conversion after treatment by nucleoside analogues(NAs). Methods Detected and analyzed the HBX gene sequence by real time PCR in PBMC of 60 patients with CHB including some with cirrhosis or hepatocellular carcinoma(HCC), all the serum HBV DNA had turned negative after treatment by NAs, and explore the clinical significance of the HBX gene. Results HBX genes were detected in 37 cases(61.67%, 37/60). HBX positive rates of PBMC in HCC and cirrhosis patients were higher than that of CHB patients(P=0.000,P=0.010). HBX △120, HBX△129, HBX△131 truncations were detected in two HCC and one CHB cases. Two hotspot mutation including A389T/G391A, T380C had been found, and A389T/G391A double mutation in HCC patients was significantly higher than that in CHB patients(P=0.021). In cirrhosis and HCC patients, T380C mutation rate in HBeAg(-) cases was higher than that in HBeAg(+) cases(P=0.035). Conclusions In patients with serum HBV DNA negative conversion after treatment by NAs, PBMC HBX gene positive rates in cirrhosis or HCC cases are higher than that in CHB cases. A389T/G391A double mutation rate in HCC cases is significantly higher than that in CHB cases. In cirrhosis and HCC patients, T380C mutation rate in HBeAg(-) cases is higher than that in HBeAg(+) cases.

PCR; Hepatitis B; Chronic; DNA

陳公英，Email：liuxingli0329@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.016

PCR；肝炎；乙型；慢性；DNA

浙江省科技廳(2014C37081)；杭州市科技局(20120533Q09)

2016-10-17)