許晶 岳姝婷 馬萍 張蕾 史偉 徐藝 李慎 關(guān)路媛 王敬軍 余鵬博

710054 西安, 陜西省疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(許晶、馬萍、 張蕾、 史偉、徐藝、李慎、關(guān)路媛、王敬軍、余鵬博)；710061 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院(岳姝婷)許晶與岳姝婷對(duì)本文有同等貢獻(xiàn)

·論著·

西安市流感樣病例中人腺病毒感染特點(diǎn)分析

許晶 岳姝婷 馬萍 張蕾 史偉 徐藝 李慎 關(guān)路媛 王敬軍 余鵬博

710054 西安, 陜西省疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(許晶、馬萍、 張蕾、 史偉、徐藝、李慎、關(guān)路媛、王敬軍、余鵬博)；710061 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院(岳姝婷)許晶與岳姝婷對(duì)本文有同等貢獻(xiàn)

目的 分析2013—2015年西安市流感樣病例中非流感患者腺病毒(HAdV)感染的流行病學(xué)特點(diǎn)和病毒分型特征。方法 收集2013年1月到2015年12月西安市兩所國(guó)家級(jí)流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院的流感樣病例樣本，經(jīng)熒光PCR篩檢流感病毒陰性而腺病毒陽(yáng)性的標(biāo)本，進(jìn)行病毒分離后對(duì)HAdV六鄰體(Hexon)基因擴(kuò)增、測(cè)序及分型鑒定，與HAdV 1-7型的參考序列構(gòu)建基因進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果 2 367份標(biāo)本中檢測(cè)出88例腺病毒陽(yáng)性，陽(yáng)性率為3.72%。共檢出7種亞型的HAdV，其中HAdV-1型占9.09%，HAdV-2型占22.73%，HAdV-3型占23.86%，HAdV-4型占5.68%，HAdV-5型占7.95%，HAdV-6型占3.41%，HAdV-7型占1.14%。在腺病毒陽(yáng)性病例中，男性檢出率高于女性，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；按年齡分6個(gè)組，1歲以下3例陽(yáng)性，1～3歲36例陽(yáng)性，4～6歲26例陽(yáng)性，7～18歲16例陽(yáng)性，19～59歲5例陽(yáng)性，60以上2例陽(yáng)性。7歲以下兒童高發(fā)，年齡組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.10，P<0.05)。結(jié)論 2013—2015年西安市上呼吸道感染中HAdV的主要的流行型別為3型和2型，7歲以下兒童高發(fā)；HAdV的感染全年散發(fā)，無(wú)明顯季節(jié)性。

Fund programs: Shannxi Provincial Health Science and Technology Research Project(2016D095,2016D092)

流感樣病例(Influenza-like illness, ILI)即發(fā)熱(體溫≥38 ℃)，伴咳嗽或咽痛之一者。ILI感染的常見(jiàn)呼吸道病毒包括流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、冠狀病毒、偏肺炎病毒、博卡病毒等十多種病毒屬、型[1]，在ILI監(jiān)測(cè)中流感病毒是常規(guī)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，而流感病毒檢測(cè)陰性的ILI，其引起感染的主導(dǎo)病原是臨床醫(yī)生和疾病控制專(zhuān)業(yè)人員關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)因其流行地區(qū)廣、傳播能力強(qiáng)、人群普遍易感，常引起聚集疫情和暴發(fā)流行而倍受關(guān)注[2,4]。HAdV是一種無(wú)包膜的呈二十面體對(duì)稱(chēng)的線性雙鏈DNA病毒，分為A～G共7個(gè)組，68個(gè)型別[5]，因其型別眾多，其各型導(dǎo)致ILI在不同地區(qū)、不同時(shí)間、不同人群中的特點(diǎn)和規(guī)律尚不清楚，目前文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究通過(guò)對(duì)2013—2015年收集自西安市兩個(gè)流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院的、經(jīng)實(shí)驗(yàn)室流感病毒核酸檢測(cè)為陰性的ILI咽拭子標(biāo)本，進(jìn)一步進(jìn)行HAdV檢測(cè)、病毒分離、基因測(cè)序及分型鑒定，結(jié)合流行病學(xué)資料，分析本地區(qū)HAdV的流行特點(diǎn)和感染規(guī)律，為臨床準(zhǔn)確診斷、充分認(rèn)識(shí)HAdV各型的分布規(guī)律，以及有效防控腺病毒感染而積累本底數(shù)據(jù)，并提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與篩檢 收集2013年1月到2015年12月西安市兩個(gè)國(guó)家級(jí)流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院(解放軍323醫(yī)院、解放軍451醫(yī)院)的門(mén)診ILI，患者于就診當(dāng)天采集其鼻咽拭子置于病毒采樣液中，4 ℃運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)本用天隆全自動(dòng)核酸提取儀和天隆核酸提取試劑盒(磁珠法)(Ex-RNA/DNA病毒)進(jìn)行核酸提取后，用三重?zé)晒舛縋CR法(GenTouch甲型流感/乙型流感/人腺病毒核酸檢測(cè)試劑盒)將流感病毒陰性而腺病毒陽(yáng)性的標(biāo)本篩選出來(lái)。

1.2 腺病毒分離 將腺病毒陽(yáng)性的標(biāo)本接種人喉表皮癌細(xì)胞(HEP-2)，維持液為含2%胎牛血清的DMEM(美國(guó)Gibco)，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)。當(dāng)CPE達(dá)到75%～100%時(shí)，收集細(xì)胞上清。Hep-2細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)保存。

1.3 腺病毒六鄰體(Hexon)基因擴(kuò)增、序列測(cè)定與分型、建樹(shù) 將得到的腺病毒毒株提取核酸(方法同上)，應(yīng)用特異引物(上游AD1 5′-CTGATGTACTACAACAGCACTGGCAACATGGG-3′, 下游AD2∶5′-GCGTTGCGGTGGTGGTTAAATGGGTTTACGTTGTCCAT-3′)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(95 ℃ 10 min,(94 ℃ 30 s,51 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min)35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min)，產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小為605～629 bp。將特異DNA條帶純化后在ABI 3500xl測(cè)序儀上用雙脫氧末端終止法(Sanger法)進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序引物同PCR引物。輸出序列在GenBank網(wǎng)站上經(jīng)BLAST比對(duì)分析，確定腺病毒型別。

將本研究獲得的腺病毒Hexon基因序列，通過(guò)MEGA5.05構(gòu)建和其他參考序列的親緣性關(guān)系樹(shù)。采用Kimura二參數(shù)法(Kimura 2-parameter)核苷酸進(jìn)化模型和鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)，自助法(Boot-strap)進(jìn)行檢驗(yàn)(檢驗(yàn)重復(fù)數(shù)為1000)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行分析，用χ2檢驗(yàn)分析比較HadV感染在不同人群、不同季節(jié)中陽(yáng)性檢出率的差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ILI中非流感樣本腺病毒檢測(cè)結(jié)果 ILI咽拭子經(jīng)A/B流感病毒/腺病毒三重病原熒光Real-time PCR檢測(cè)篩選出對(duì)流感病毒RNA陰性者，共2 367份，其中腺病毒陽(yáng)性者88例，其陽(yáng)性率為3.72%。2013—2015年HAdV檢出率分別為3.51%，3.81%和3.76%，3年間ILI非流感病例中腺病毒陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.10，P>0.05)。

2.2 HAdV感染者性別及年齡分布 在檢測(cè)的 2 367例非流感病例中，男性感染者HAdV的檢出率為4.38%(55/1 257)，女性感染者HAdV的檢出率為2.97%(33/1 110)，男女間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.24，P>0.05)；將發(fā)病年齡分為6個(gè)年齡組，1歲以下3例陽(yáng)性，1～3歲36例陽(yáng)性，4～6歲26例陽(yáng)性，7～18歲16例陽(yáng)性，19～59歲5例陽(yáng)性，60以上2例陽(yáng)性(見(jiàn)表1)。6歲以下兒童高發(fā)，年齡組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.10，P<0.05)。

表1 2013—2015年ILI中非流感病例HAdV感染者年齡分布

表2 ILI中HAdV感染者病毒分型

2.3 ILI中非流感病例HAdV感染的季節(jié)分布 ILI中非流感病例HAdV感染者的咽拭子中HAdV核酸全年均能檢出，但5月份與7月份陽(yáng)性檢出率較高(圖1)。

圖1 2013—2015年西安市ILI中非流感病例HAdV感染者季節(jié)分布Fig.1 Month distribution of HAdV in Xi′an during 2013—2015

2.4 ILI中非流感病例HAdV感染者咽拭子HAdV核酸分型結(jié)果 對(duì)2 367例ILI中非流感而腺病毒陽(yáng)性的88例，經(jīng)PCR擴(kuò)增腺病毒六鄰體(Hexon)基因后，對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序并在GenBank上BLAST比對(duì)分析，確定88例腺病毒感染者病毒基因分型為HAdV 1-7型均有。其中HAdV-1型8株，占9.09%；HAdV-2型20株，占22.73%；HAdV-3型21株，占23.86%；HAdV-4型5株，占5.68%，HAdV-5型7株，占7.95%；HAdV-6型3株，占3.41%；HAdV-7型1株，占1.14%。主要的流行型別主要為HAdV-3和HAdV-2(表2)。

2.5 人腺病毒分子分型特征及進(jìn)化分析 對(duì)88例腺病毒陽(yáng)性樣本接種細(xì)胞，成功獲得65例腺病毒Hexon基因擴(kuò)增且完成序列測(cè)定者。對(duì)該65例HadV基因序列分析顯示，陽(yáng)性的HAdV屬于3個(gè)亞群(B、C、E)的7種亞型。其中B亞群(3型、7型)占33.85%(22/65)，C亞群(1型、2型、5型、6型)占58.46%(38/65)，E亞群(4型)占7.69%(5/65)。2013—2015年3年間都出現(xiàn)B、C亞群，E亞群在2015未檢出。2013年B亞群2株，C亞群8株，E亞群4株；2014年B亞群14株，C亞群18株，E亞群1株；2015年B亞群6株，C亞群12株。其中HAdV-C6僅在2014年檢出，HAdV-B7僅在2015年檢出。

將65株HAdV的Hexon基因序列(編號(hào)以年份如15+樣本號(hào)如569組成序列編號(hào)15569，下同)，與文獻(xiàn)報(bào)道較多的腺病毒流行株基因序列(GenBank序列號(hào)JX173086、AB330083、AY854178、AF542122、AY339865、FJ943597、GU230 898分別代表HAdV-1、2、3、4、5、6、7型)作參考，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示各HAdV型別與其對(duì)應(yīng)的參考株同源性較高(圖2)。

◆ GenBank中不同型別的腺病毒序列圖2 基于HAdV Hexon引物擴(kuò)增片段的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)◆ The sequence of different types of HAdV from GenBankFig.2 Phylogenetic analysis of HAdV species based on the partial sequence of the hexon gene

3 討論

HAdVD是一種無(wú)包膜的呈二十面體對(duì)稱(chēng)的線性雙鏈DNA病毒，歸屬哺乳動(dòng)物腺病毒屬(Mastadenovirus)。 HAdV常侵犯呼吸道、消化道及眼結(jié)膜等，可引起廣泛的疾病譜，如急性呼吸道感染、咽結(jié)膜熱、肺炎、流行性角結(jié)膜炎和胃腸炎等[6,8]。全球HAdV流行地區(qū)廣、人群普遍易感，常引起暴發(fā)流行[9]。目前HAdV感染尚無(wú)特效藥，疫苗也僅在美國(guó)軍隊(duì)使用[10]。因此開(kāi)展HAdV感染的調(diào)查研究，了解HAdV在人群中的感染特征很有必要。

本研究報(bào)道了西安地區(qū)2013—2015年呼吸道腺病毒的流行情況和分子分型結(jié)果，這三年HAdV的總檢出率為3.72%，與深圳地區(qū)(3.86%)、無(wú)錫地區(qū)(3.22%)[11,12]檢出率基本一致。在HAdV感染中，男性患者的檢出率高于女性患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。全人群普遍易感HAdV，7歲以下兒童為易感人群。腺病毒感染各地季節(jié)性差異較大，這可能與氣候、地域不同有關(guān)。如北京2003-2012年監(jiān)測(cè)未見(jiàn)明顯季節(jié)性，無(wú)錫地區(qū)、深圳市以冬春季為主[13]，南京地區(qū)[14]春夏季高發(fā)。西安地區(qū)全年均能檢出HAdV，各年檢出月份略有不同，檢出率為5月份、7月份較高，但沒(méi)有出現(xiàn)像流感病毒和呼吸道合胞病毒[15-17]那樣規(guī)律的流行趨勢(shì)。

HAdV自發(fā)現(xiàn)以來(lái)分為A～G 7個(gè)組，其中C組、E組及部分B組通常感染呼吸道，尤其是B亞組可引起嚴(yán)重的呼吸道疾病。本次研究檢測(cè)出B、C、E組共7個(gè)型，顯示西安地區(qū)2013—2015年引起呼吸道腺病毒感染的主要為C亞群，其次為B亞群；主要是B亞群的3型及C亞群的2型；這與其他地區(qū)報(bào)道的主要為HAdV-3型及7型有所不同。從親緣進(jìn)化的結(jié)果看，本研究中HAdV各型別序列與下載參考株的同源性較高，未發(fā)生明顯變異。

HAdV作為一種在全世界范圍普遍流行、容易引起暴發(fā)疫情并有廣泛疾病譜的病毒，受到世界各地的重視，如美國(guó)有全國(guó)腺病毒監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，韓國(guó)及日本對(duì)HAdV有連續(xù)多年的監(jiān)測(cè)[18,19]。在我國(guó)尚未建立腺病毒監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，僅有個(gè)別省份有幾年監(jiān)測(cè)的數(shù)據(jù)。陜西省亦無(wú)呼吸道腺病毒監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，流行的分子型別也是首次報(bào)道，這對(duì)于陜西省呼吸道腺病毒的防控具有指導(dǎo)意義。

[1] Nakafero G，Sanders RD，Nguyen JS，et al. The association between benzodiazepines and influenza-like illness-related pneumonia and mortality: a survival analysis using UK Primary Care data [J]. Pharmacoepidemiol Drug Saf，2016，25(11)：1263-1273. doi: 10.1002/pds.4028.

[2] 唐瀏英，劉秀云，許文波. 一株致嬰兒死亡的腺病毒Ad7d2的基因特點(diǎn) [J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2009，23(2)：127-128. doi:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2009.02.017.

[3] Tang LY，Wang L，Tan XJ，et al. Adenovirus serotype 7 associated with a severe lower respiratory tract disease outbreak in infants in Shaanxi Province, China [J]. Virol J，2011, 8：23. doi: 10.1186/1743-422X-8-23.

[4] Yu PB，Ma CF，Muhammad N，et al. Outbreak of acute respiratory disease caused by human adenovirus type 7 in a military training camp in Shaanxi，China[J]. Microbiol Immunol，2013，57(8)：553-560. doi：10.1111/1348-0421.12074.

[5] 田新貴，周榮.人腺病毒分型及分子進(jìn)化研究進(jìn)展[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2014，34(6)：481-486. doi:10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2014.06.015.

[6] Jones MS， Harrach B，Ganac RD，et al. New adenovirus species found in a patient presenting with gastroenteritis[J]. J Virol，2007，81 (11)：5978-5984. doc:10.1128/JVI.02650-06.

[7] Sun Q，Jiang W，Chen Z，et al. Epidemiology and clinical features of respiratory adenoviral infections in children[J]. Eur J Pediatr，2014，173(4)：441-444. doi：10.1007/s00431-013-2188-z.

[8] Treacy A，Carr MJ，Dunford L，et al. First report of sudden death due to myocarditis caused by adenovirus serotype 3[J]. J Clin Microbiol，2010，48(2)：642-645. doi：10.1128/JCM.00815-09.

[9] Gerber SI，Erdman DD，Pur SL，et al. Outbreak of adenovirus genome type 7d2 infection in a pediatric chronic-care facility and tertiary-care hospital[J]. Clin Infect Dis，2001，32(5)：694-700. doi：10.1086/319210.

[10] 高文娟，金玉，段招軍.人腺病毒的研究進(jìn)展[J].病毒學(xué)報(bào)，2014，30(2)：193-200. doi:10.13242/j.cnki.bingduxuebao.002464.

[11] 劉騰穎子，呂星，黃達(dá)娜，等.2011—2012年深圳市呼吸道腺病毒分子分型及其流行特征[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2014,14(1)：12-15.

[12] 馬廣源，劉瑞霞，肖勇，等.2011—2013年無(wú)錫地區(qū)人腺病毒流行特征與分型[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2016，30(5)：457-460. doi:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.010.

[13] 鄧潔，錢(qián)淵，趙林清，等. 2003-2012年北京兒童急性呼吸道感染中腺病毒監(jiān)測(cè)及流行型別分析[J].病毒學(xué)報(bào)，2013，6(29)：615-619. dio:10.13242/j.cnki.bingduxuebao.002427.

[14] 高小倩，金玉，謝志萍，等.南京地區(qū)2010—2011年度呼吸道感染患兒腺病毒的流行病學(xué)研究[J].病毒學(xué)報(bào)，2012，28(5)：531-535. doi：10.13242/j.cnki.bingduxuebao.002317.

[15] 馬萍，王學(xué)良，田小萍，等.陜西省2005-2009年流行性感冒監(jiān)測(cè)分析[J].中國(guó)初級(jí)衛(wèi)生保健，2011，25(3)：65-67.doi:10.3969/j.issn.1001-568X.2011.03.033.

[16] 張蕾，許晶，史偉，等.西安地區(qū)2009—2014年呼吸道合胞病毒流行病學(xué)特征研究[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2016，17(2)：81-85.doi:10.16506/j.1009-6639.2016.02.001.

[17] Bruzzone MS，F(xiàn)uentes L，Spencer E. Specific subgroup B adenovirus diagnosis by PCR of the fibre gene[J].J Infect，2000，40(2)：154-159. doi：10.1053/jinf.1999.0632.

[18] Lee J，Choi EH，Lee HJ. Clinical severity of respiratory adenoviral infection by serotypes in Korean children over 17 consecutive years (1991-2007) [J]. J Clin Virol，2010， 49(2)：115-120. doi：10.1016/j.jcv.2010.07.007.

[19] Noda M，Yoshida T，Sakaguchi T，et al. Molecular and epidemiological analyses of human adenovirus type 7 strains isolated from the 1995 nationwide outbreak in Japan[J]. J Clin Microbiol，2002，40(1)：140-145.doi：10.1128/JCM.40.1.140-145.2002.

(本文編輯：唐瀏英)

Characteristics of the human adenovirus infections from influenza-like illness samples in Xi′an

Xu Jing, Yue Shuting, Ma Ping, Zhang Lei, Shi Wei, Xu Yi, Li Shen, Guan Luyuan, Wang Jingjun, Yu Pengbo

Viroloy Research Laboratory of Shaanxi Provincial Center for Disease Control and Prevention，Xi＇an 710054，China(Xu J, Ma P, Zhang L, Shi W, Xu Y, Li S, Guan LY, Wang JJ, Yu PB)；School of Public Health, Xi′an Jiaotong University Health Science Center, Xi′an 710061, China (Yue ST) Xu Jing and Yue Shuting are the first authors who contributed equally to this article

Yu Pengbo, Email: sxcdcy@126.com

Objective To analyze the epidemiological characteristics and the molecular types of human adenovirus (HAdV) from influenza-like illness (ILI) samples with negative influenza virus in Xi'an from January 2013 to December 2015. Methods Samples from patients with ILI were collected from two national influenza sentinel surveillance hospitals during 2013—2015 in Xi′an. HAdV was detected by real-time PCR, and then the positive samples were inoculated into Hep-2 cells to isolate the viruses. The amplified products were purified and sequenced of hexon gene, and the sequences were compared with the Genebank data and phylogenetic trees were constructed. Results In 2367 samples, 88 samples were positive for HAdV, the positive rate was 3.72%. There were 7 subtypes detected, and the rates of each subtype are as follows: HAdV-1 was 9.09%, HAdV-2 was 22.73%, HAdV-3 was 23.86%, HAdV-4 was 5.68%, HAdV-5 was 7.95%, HAdV-6 was 3.41% and HAdV-7 was 1.14%. Males had higher infection rate than females, but there was no significant difference. The patients were divided into 6 groups according to age. There were 3 positive samples among those under 1 year of age, 36 positive samples among those 1 to 3 years old, 26 positive samples among those 4 to 6 years old, 16 positive samples in those 7 to 18 years old, 5 positive samples in 19 to 59 years old and 2 positive samples in those older than sixty years of age. HAdV infection was primarily confined to children under 7 years of age. Conclusions HAdV-3 and HAdV-2 were the dominant epidemic strains during 2013—2015 in Xi′an. Children younger than 7 years were the main susceptible population. HAdV infections circulate all year-round and there was no considerable seasonal variation.

Human Adenovirus; Epidemiological characteristics; Molecular typing

余鵬博，Email: sxcdcy@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.008

人腺病毒；流行特征；分子分型

陜西省衛(wèi)生計(jì)生科研基金項(xiàng)目(2016D095，2016D092)

2017-03-06)