□ 雷蘭蘭 郭玉凡 舒 靜 鄭玉紅 嚴(yán) 燁 陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院

包裝飲用水中銅綠假單胞菌定性檢驗盲樣考核的結(jié)果與分析

□ 雷蘭蘭 郭玉凡 舒 靜 鄭玉紅 嚴(yán) 燁 陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院

作為包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢驗資質(zhì)的國家食品安全抽檢監(jiān)測承檢機構(gòu)，本實驗室參加2016年食藥總局食品安全抽檢監(jiān)測承檢機構(gòu)銅綠假單胞菌定性檢驗盲樣考核。按照盲樣考核作業(yè)指導(dǎo)書和《GB/T 8538-2008 飲用天然礦泉水檢驗方法》的要求檢驗，并結(jié)合全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK 2）對分離出的可疑菌落鑒定。結(jié)果顯示，樣品1559、1562、1565、1580、1582檢出銅綠假單胞菌，1546、1573、1574、1579、1584未檢出銅綠假單胞菌。

包裝飲用水；銅綠假單胞菌；盲樣考核

銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa）原稱綠膿桿菌，是一種常見的革蘭氏陰性桿菌，為專性需氧菌，生長溫度范圍25～42 ℃。因?qū)I養(yǎng)要求不高，所以在水、土壤、食品以及醫(yī)院等環(huán)境中廣泛存在[1]。隨著消費增長飲用水中銅綠假單胞菌的污染問題逐漸呈現(xiàn)出來，國內(nèi)眾多研究者對包裝飲用水中銅綠假單胞菌污染調(diào)查，發(fā)現(xiàn)飲用水中銅綠假單胞菌檢出率多集中在3.2%～26.0%[2]。鑒于銅綠假單胞菌的致病性及其在成品水中較高的檢出率，我國最新飲用水標(biāo)準(zhǔn) GB19298-2014《包裝飲用水》明確規(guī)定同一批次5份水樣，每份每250 mL水樣中銅綠假單胞菌不得檢出。如果檢出，則為不合格產(chǎn)品。因此，銅綠假單胞菌的檢測也是食品安全檢測中的非常重要的一項檢測。本次考核，共收到編碼不同的10組樣品，采用國標(biāo)方法檢測，具體檢測過程及結(jié)果分析總結(jié)如下。

1 設(shè)備材料與方法

1.1 待檢樣品

本次盲樣考核任務(wù)來自國家食藥總局，具體活動由中國食品藥品檢定研究院負(fù)責(zé)實施。收到的樣品共計20件，分別為10瓶250 mL密封包裝的水和10個裝有凍干菌球的西林瓶，其中一瓶水對應(yīng)一個西林瓶為1組樣品，10組樣品編碼完全對應(yīng)。編碼分別為1546、1559、1562、1565、1573、1574、1579、1580、1582、1584。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗方法

參照GB 8538-2008中的銅綠假單胞菌的檢測方法定性檢驗。

1.2.2 樣品處理

樣品處理參照隨樣品一起提供的作業(yè)指導(dǎo)書。在生物安全室中打開10瓶水及10個西林瓶，將10個西林瓶中的白色凍干菌球轉(zhuǎn)移至10個對應(yīng)編碼的水瓶內(nèi)，充分混勻成10個待檢水樣。

1.2.3 實驗步驟

1.2.3.1 水樣過濾及培養(yǎng)

固定好濾膜及濾器，將10個待檢水樣分別通過孔徑0.45 μm的濾膜過濾，將過濾后的濾膜貼在已制備好的CN瓊脂平板上。將10個平板置于（36±1）℃培養(yǎng)48 h。

1.2.3.2 分離培養(yǎng)

在培養(yǎng)48 h后，從每個濾膜上選取各類單菌落1～2個劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上純培養(yǎng)。（36±1）℃培養(yǎng)24 h后續(xù)確證實驗。

1.2.3.3 VITEK 2.0生化鑒定

從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取適量菌，制成比濁度在0.6～0.8的菌懸液VITEK 2.0生化鑒定。

1.2.3.4 氧化酶實驗

從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取適量菌涂抹至氧化酶試紙上做氧化酶實驗。

1.2.3.5 乙酰胺實驗

從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取適量菌分別接種至乙酰胺肉湯中，（36±1）℃培養(yǎng)24 h時，向每支培養(yǎng)物中加入2滴鈉氏試劑。

1.2.3.6 金氏B實驗

從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取適量菌分別接種至金氏B培養(yǎng)基上，（36±1）℃培養(yǎng)一定時間后，在波長365 nm紫外燈觀察其產(chǎn)熒光情況。

2 實驗結(jié)果

2.1 CN瓊脂平板上的菌落觀察

CN瓊脂平板上的菌落見圖1、圖2、圖3和圖4。

圖1 有藍(lán)綠色菌落生長的CN瓊脂平板圖

如圖1和圖2所示，編碼1 559、1 562、1 565、1 580、1 582：有藍(lán)綠色圓形菌落，菌落直徑1～3 mm，表面濕潤光滑，邊緣整齊，在紫外燈下檢查時有藍(lán)綠色熒光產(chǎn)生。

圖2 在紫外燈下檢查有藍(lán)綠色菌落生長的濾膜圖

圖3 無藍(lán)綠色菌落生長的CN瓊脂平板圖

圖4 在紫外燈下檢查無藍(lán)綠色菌落生長的濾膜圖

如圖3和圖4所示，編碼1 546、1 584：僅有淺黃褐色圓形菌落，菌落直徑2～3 mm，表面光滑，邊緣整齊，在紫外燈下檢查時有熒光產(chǎn)生。編碼1 573、1 574、1 579：占多數(shù)的一種為淺黃褐色圓形菌落，菌落直徑2～3 mm，濕潤光滑，邊緣整齊，在紫外燈下檢查時有藍(lán)綠色熒光產(chǎn)生。占少數(shù)的一種為淺黃褐色圓形菌落，菌落直徑不到1 mm，濕潤光滑，邊緣整齊，在紫外燈下檢查時無熒光產(chǎn)生。

2.2 VITEK 2.0生化反應(yīng)鑒定結(jié)果

編碼為1 559、1 562、1 565-1、1 565-2、1 580、1 582的生化反應(yīng)結(jié)果如表1所示，均為：Pseudomonas aeruginosa，置信度均為Excellent identification。

編碼為1546-19、1546-20、1573-18、1574-15、1579-11、1584-13、1584-14的鑒定結(jié)果均為：Pseudomonas putida

編碼為1574-16、1573-17的鑒定結(jié)果均為：Burkholderia cepacia group

編碼為1579-12的鑒定結(jié)果為：Acinetobacter baumannii complex

2.3 氧化酶實驗

如圖5所示，編碼為1559、1562、1565-1、1565-2、1580、1582、1 546-19、1546-20、1573-17、1573-18、1574-15、1574-16、1579-11、1579-12、1584-13、1584-14及陽性對照9027均顯示深紫色。陰性對照8739未顯示紫色。

圖5 氧化酶實驗結(jié)果圖

2.4 乙酰胺實驗

在培養(yǎng)24 h后的乙酰胺肉湯中滴加鈉氏試劑，反應(yīng)結(jié)果如圖6、7所示，

編碼為1559、1562、1565-1、1565-2、1580、1582及陽性對照9027的培養(yǎng)物均出現(xiàn)明顯的磚紅色。

編碼為1546-19、1546-20、1573-17、1573-18、1574-15、1574-16、1 579-11、1579-12、1584-13、1584-14及陰性對照8739的培養(yǎng)物均未產(chǎn)生磚紅色。

2.5 金氏B培養(yǎng)基實驗

在紫外燈下觀察產(chǎn)熒光狀況如圖8所示，編碼為1559、1562、1565-1、1565-2、1580、1582、1546-19、1546-20、1573-17、1573-18、1574-15、1574-16、1579-11、1579-12、1584-13、1584-14及陽性對照9 027均有熒光產(chǎn)生。陰性對照8739未產(chǎn)生熒光。

表1 銅綠假單胞菌的VITEK生化反應(yīng)鑒定表

圖6 乙酰胺肉湯24h培養(yǎng)物滴加鈉氏試劑前圖

圖 7乙酰胺肉湯24h培養(yǎng)物，滴加鈉氏試劑后圖

圖8 金氏B培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，紫外燈下觀察圖

3 結(jié)論

綜合形態(tài)學(xué)和生化鑒定，得出本次樣品檢測結(jié)果。檢出銅綠假單胞菌的樣品為：1559、1562、1565、1580、1582；未檢出銅綠假單胞菌的樣品為：1546、1573、1574、1579、1584其中的干擾菌大部分是惡臭假單胞菌，另有少量干擾菌是洋蔥伯克霍爾德菌群和鮑氏不動桿菌復(fù)合體。結(jié)果上報本次盲樣考核實施機構(gòu)，實施機構(gòu)對我院本次提交的盲樣考核結(jié)果反饋為滿意，說明我院有能力檢驗飲用水中銅綠假單胞菌。

[1]徐勵琴,薛計泉,羅澤燕,等.桶裝飲用水銅綠假單胞菌檢測及耐藥性分析[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2015,21(3):56-57.

[2]楊娟,蔡震,徐妍.泰州市桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染監(jiān)測[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2016,26(12):1771-1772.