袁小遠(yuǎn)+楊金興+張玉霞+孟凱+王友令+艾武

摘要：將新城疫病毒SD強(qiáng)毒株的全基因組cDNA序列進(jìn)行分段擴(kuò)增，并將各個(gè)片段通過In-Fusion技術(shù)連于克隆載體pBR322上，獲得了SD毒株的全基因組cDNA克隆。通過分段PCR擴(kuò)增鑒定及全長(zhǎng)測(cè)序分析，結(jié)果表明，SD毒株的全基因組cDNA克隆構(gòu)建成功，并且成功引入T7啟動(dòng)子序列，全長(zhǎng)基因組序列與親本毒氨基酸序列的一致性為99.9%。單個(gè)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，全基因組cDNA克隆中有11處堿基突變，其中只有2處引起氨基酸序列發(fā)生改變；整個(gè)序列未出現(xiàn)基因的缺失、插入變化，因此全長(zhǎng)氨基酸的位數(shù)未發(fā)生任何變化。SD毒株全長(zhǎng)cDNA克隆的成功構(gòu)建和序列分析為后續(xù)的反向遺傳操作奠定了關(guān)鍵的技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：新城疫病毒；基因組全長(zhǎng)cDNA；重組質(zhì)粒；序列分析

中圖分類號(hào)：S852.65+9.5：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2017）07-0012-04

Abstract The whole genomic cDNA sequence of SD virulent strain of Newcastle disease virus was amplified in sections， and each fragment was attached to the clone vector pBR322 by In-Fusion technology. The whole genomic cDNA clone was obtained. Through the fragmented-PCR amplification and sequencing analysis， the results showed that the whole genomic cDNA clone of SD virulent strain was successfully constructed and the T7 promoter sequence was successfully imported. The identity of amino acid sequence between the whole genomic cDNA clone and parent strain was 99.9%. Single sequence alignment showed that there were 11 base mutations in the whole genomic cDNA clone， and only 2 sites caused the change of amino acid sequence. However， because of no occurrence of deletion and insertion of genes in the whole sequence， the number of full-length amino acids had no change. The successful construction and sequence analysis of whole genomic cDNA clone of SD virulent strain laid the key technical foundations for future reverse genetic operation.

Keywords Newcastle disease virus； Whole genomic cDNA； Recombinant plasmid； Sequence analysis

新城疫（Newcastle disease，ND）是一種禽類的高度接觸性疾病，對(duì)全世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1，2]。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）基因組是單股負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA，病毒基因組包括六個(gè)結(jié)構(gòu)基因，基因組全長(zhǎng)為15 186 bp（或15 192 bp）[3]。單獨(dú)的NDV RNA在細(xì)胞內(nèi)不能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯蛋白，需要核衣殼蛋白、磷蛋白和大分子蛋白組成核糖核蛋白復(fù)合物才能行使轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能[4，5]。

反向遺傳操作技術(shù)是指將RNA病毒基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在體外通過基因突變、基因插入、基因敲除、基因置換等方法人為構(gòu)建新的具有感染性的病毒，來研究病毒的基因組結(jié)構(gòu)、功能及和病毒宿主之間的相互作用等，也叫全長(zhǎng)感染性cDNA克隆技術(shù)。這一技術(shù)解決了RNA病毒基因組難以操作的難題，同時(shí)為新型疫苗的研發(fā)提供了新的思路。目前，國(guó)內(nèi)外已在NDV的反向遺傳方面做了許多工作，成功構(gòu)建并拯救了多株NDV感染性克隆病毒[5-7]。構(gòu)建全長(zhǎng)基因組克隆是進(jìn)行反向遺傳操作的關(guān)鍵技術(shù)步驟和核心決定因素。因此，本研究擬構(gòu)建NDV病毒SD強(qiáng)毒株的基因組全長(zhǎng)cDNA克隆，為NDV的反向遺傳技術(shù)研究提供必要的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NDV的SD強(qiáng)毒株由山東SPF雞研究中心分離鑒定保存，pBR322改良載體和感受態(tài)大腸桿菌HST08由山東SPF雞研究中心制備保存。Gflex DNA聚合酶及PCR產(chǎn)品、In-Fusion HD克隆試劑盒、限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，Simple RNA kit購(gòu)自博日生物有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank中NDV的全基因組序列（No：KU342001）設(shè)計(jì)3對(duì)引物，用于擴(kuò)增NDV全基因組cDNA（表1）。引物由華大基因公司合成，PAGE plus級(jí)別純化。

1.2.2 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 病毒RNA的提取按照Simple RNA kit操作說明進(jìn)行，最后用30 μL DEPC水溶解RNA。反轉(zhuǎn)錄RT按照文獻(xiàn)[8]的操作進(jìn)行，cDNA產(chǎn)物-20℃保存。

1.2.3 cDNA的分段擴(kuò)增 將病毒cDNA分三段進(jìn)行擴(kuò)增，依次連接于經(jīng)ClaⅠ酶切的pBR322載體上。具體擴(kuò)增示意圖見圖1。

（1）片段In-PCR1的擴(kuò)增克隆。cDNA產(chǎn)物2 μL、2×Gflex PCR Buffer（Mg2+、dNTP plus）25 μL、Tks Gflex DNA Polymerase （1.25 U/μL） 1 μL、cDNA-1F和cDNA-1R（20 pmol/μL）各1 μL，加水補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件94℃ 1 min；98℃ 10 s、55℃ 15 s、68℃ 3 min，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；4℃保存。將擴(kuò)增得到的In-PCR1產(chǎn)物純化后與經(jīng)ClaⅠ酶切的 pBR322載體經(jīng)In-Fusion HD體系進(jìn)行連接，50℃作用15 min。取連接產(chǎn)物2 μL熱轉(zhuǎn)化至E. coli HST08 Premium Competent Cell中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，重組陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序后命名為SD-IN1。

（2）片段In-PCR2的擴(kuò)增克隆。cDNA產(chǎn)物2 μL，cDNA-2F和cDNA-2R（20 pmol/μL）各1 μL，Tks Gflex聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件94℃ 1 min；98℃ 10 s，52℃ 15 s，68℃ 3 min，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；4℃保存。將擴(kuò)增得到的In-PCR2產(chǎn)物純化后與經(jīng)ClaⅠ酶切的上述SD-IN1質(zhì)粒經(jīng)In-Fusion HD體系進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證，重組陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序命名為SD-IN2。

（3）全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增克隆。cDNA產(chǎn)物2 μL，cDNA-3F和cDNA-3R（20 pmol/μL）各1 μL，Tks Gflex聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件94℃ 1 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，68℃ 2 min，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；4℃保存。擴(kuò)增得到的In-PCR3產(chǎn)物與經(jīng)ClaⅠ酶切的上述SD-IN2質(zhì)粒進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆。

1.2.4 全長(zhǎng)cDNA克隆的驗(yàn)證和序列分析 挑取單克隆，提取質(zhì)粒，用兩對(duì)引物IN-P1/P2和IN-F1/F2分別進(jìn)行分段的PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，經(jīng)測(cè)序的陽(yáng)性克隆命名為SD-IN3，即全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒。全長(zhǎng)序列進(jìn)行拼接后利用DNAStar v6.13進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分段PCR擴(kuò)增結(jié)果

按照預(yù)期設(shè)計(jì)，分三段進(jìn)行NDV病毒全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，獲得3個(gè)目的基因片段，其大小均與預(yù)期擴(kuò)增大小相符，為4.0～5.8 kb（見圖2）。

2.2 全基因組cDNA克隆的PCR驗(yàn)證

全長(zhǎng)SD-IN3重組質(zhì)粒用IN-P/F系列引物進(jìn)行分段PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，獲得2個(gè)基因片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示其大小均與預(yù)期相符，約5.0 kb（見圖3）。

2.3 全基因組cDNA序列的測(cè)定與分析

通過對(duì)全基因組cDNA序列的測(cè)定與拼接，得到的SD毒株基因組總長(zhǎng)度為15 192 bp，符合NDV的“六堿基”原則。利用DNAStar軟件分析，發(fā)現(xiàn)6個(gè)開放閱讀框的起始區(qū)高度保守，構(gòu)建的cDNA序列與親本毒的氨基酸序列一致性為99.9%。單個(gè)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，全基因組cDNA克隆中有11處堿基突變，只有2處引起氨基酸序列發(fā)生改變；整個(gè)序列未出現(xiàn)基因的缺失、插入變化，因此全長(zhǎng)氨基酸的數(shù)量亦未發(fā)生變化。構(gòu)建的全基因組cDNA克隆可用于病毒的感染性拯救研究。

3 討論與結(jié)論

本研究采用的In-Fusion HD克隆技術(shù)可以將PCR產(chǎn)物直接克隆到任意載體中，無(wú)需引物酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)、限制性內(nèi)切酶處理或粘性末端平滑化。In-Fusion酶可以利用線性化載體末端和PCR產(chǎn)物末端的15個(gè)相同的堿基，實(shí)現(xiàn)高效、精確的克隆，大大減少了篩選正確克隆的工作量，最終獲得的克隆具有定向的插入片段且不含多余序列[9]。

NDV反向遺傳操作技術(shù)體系主要包括基因組全長(zhǎng)cDNA的克隆以及NP、P和L蛋白輔助質(zhì)粒的構(gòu)建及共轉(zhuǎn)染到特定的細(xì)胞系中拯救病毒粒子和新生病毒特性的鑒定[7，10]。Peeters等采用表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組禽痘病毒構(gòu)建疫苗毒株La Sota的感染性分子克隆，對(duì)F0裂解位點(diǎn)進(jìn)行改造，將F0裂解位點(diǎn)的氨基酸序列從GGRQOIL/L轉(zhuǎn)變?yōu)镚GRQORR/F時(shí)，病毒的毒力顯著增強(qiáng)。這樣直接證明F蛋白是決定NDV毒力的主要原因，NDV F0蛋白裂解位點(diǎn)的變化可以顯著改變NDV的毒力，從而結(jié)束了對(duì)F蛋白和毒力關(guān)系的推測(cè)[11]。

近年來，應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救RNA病毒是RNA病毒學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。感染性克隆病毒通過基因的突變、缺失、替換等技術(shù)而產(chǎn)生基因改造的新病毒，這在病毒的生活周期、基因結(jié)構(gòu)和功能、致病機(jī)理、新型疫苗構(gòu)建和抗腫瘤作用等研究方面具有很好的應(yīng)用前景。本研究成功構(gòu)建了SD毒株全長(zhǎng)cDNA的克隆，并且引入T7啟動(dòng)子序列，為后續(xù)的反向遺傳平臺(tái)的建立奠定基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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