液態(tài)活檢miR-509-5p/miR-124比值診斷膀胱癌的臨床應(yīng)用

沈益君，謝湖陽，萬方寧，卞曉潔，肖文軍，朱一平，戴 波，葉定偉

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

液態(tài)活檢miR-509-5p/miR-124比值診斷膀胱癌的臨床應(yīng)用

沈益君，謝湖陽，萬方寧，卞曉潔，肖文軍，朱一平，戴 波，葉定偉

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

背景與目的：液態(tài)活檢是一種從血液、尿液等非實(shí)體生物組織中取樣分析，主要用于惡性腫瘤診斷、監(jiān)測(cè)及判斷預(yù)后的方法。該研究通過優(yōu)化尿液miRNA的提取方法，建立標(biāo)準(zhǔn)化的液態(tài)活檢手段，篩選并驗(yàn)證膀胱癌患者尿液miRNA標(biāo)志物以闡明其臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：收集2014年1月—2015年9月膀胱癌患者及健康對(duì)照者的尿液，應(yīng)用miRNA表達(dá)譜芯片進(jìn)行篩選，在78例膀胱癌患者及23例健康對(duì)照者的晨尿中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)驗(yàn)證，分析液態(tài)活檢的miRNA標(biāo)志物與膀胱癌臨床病理的關(guān)系及其診斷價(jià)值。結(jié)果：通過對(duì)6例膀胱癌及6例健康對(duì)照者的尿液miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選出了10個(gè)miRNA有差異表達(dá)，結(jié)合既往文獻(xiàn)報(bào)道的膀胱癌尿液miRNA標(biāo)志物，我們挑選了20個(gè)miRNA進(jìn)行RTFQ-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-509-5p/miR-124比值在膀胱癌患者尿液中表達(dá)水平較健康對(duì)照者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.000 1)。尿液miR-509-5p/miR-124比值隨著患者腫瘤分期和腫瘤分級(jí)的上升而升高(P=0.003)。當(dāng)界值定在0.41時(shí)，miR-509-5p/miR-124比值對(duì)膀胱癌的診斷靈敏度為73.1%，特異度為82.6%，曲線下面積(area under the curve，AUC)達(dá)到0.864，比尿液脫落細(xì)胞學(xué)的診斷價(jià)值高(P=0.000 2)。結(jié)論：該研究?jī)?yōu)化了尿液miRNA的提取方法，建立了標(biāo)準(zhǔn)化的液態(tài)活檢尿液miRNA標(biāo)志物的檢測(cè)手段，發(fā)現(xiàn)miR-509-5p/miR-124比值可能是膀胱癌理想的診斷標(biāo)志物。

膀胱癌；miRNA；診斷；液態(tài)活檢

膀胱癌是我國(guó)最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。近年來，許多尿液腫瘤標(biāo)志物成功應(yīng)用于臨床實(shí)踐，較傳統(tǒng)的尿脫落細(xì)胞學(xué)提高了膀胱癌診斷的靈敏度和特異度［2］。液態(tài)活檢是一種從血液、尿液等非實(shí)體生物組織中取樣分析，主要用于惡性腫瘤診斷、監(jiān)測(cè)及判斷預(yù)后的方法，其中包括對(duì)miRNA的活檢分析。該研究通過優(yōu)化尿液中miRNA的提取方法，建立標(biāo)準(zhǔn)化的液態(tài)活檢手段，篩選并驗(yàn)證膀胱癌患者尿液中的miRNA標(biāo)志物以闡明其臨床價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

收集復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2014年1月—2015年9月收治的膀胱癌患者及健康對(duì)照者的尿液，留取晨起第1次排尿的尿液約300 mL，收集后1 h內(nèi)1 000×g室溫離心10 min，取上清2 mL，－80 ℃保存。余下尿沉渣標(biāo)本送檢尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢查。膀胱癌診斷均由手術(shù)病理證實(shí)，采用TNM 2002分期和WHO 1973分級(jí)系統(tǒng)對(duì)腫瘤進(jìn)行分期分級(jí)。所有樣本留存者皆簽署知情同意書。

1.2 miRNA表達(dá)譜芯片

選用膀胱癌患者及健康對(duì)照者各6例，使用mirVanaTmPARIS miRNA提取試劑盒(購自美國(guó)ABI公司)抽提其尿液中的miRNA，抽提后的RNA樣品用帶有莖環(huán)的特異引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(Taqman miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自美國(guó)ABI公司)，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。12例患者進(jìn)行miRNA表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)(TaqMan? Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0，購自美國(guó)ABI公司)，該芯片共包含人類常見的miRNA探針754條。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fl uorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)。

1.3 液態(tài)活檢miRNA標(biāo)志物的驗(yàn)證

選取78例膀胱癌患者及23例健康對(duì)照者的晨尿進(jìn)行驗(yàn)證。miRNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄方法同1.2。樣本加樣于384孔板，置于ABI PRISM 7900 system(購自美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行RTFQPCR。反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，45個(gè)循環(huán)。RTFQ-PCR完成后，經(jīng)電腦自動(dòng)分析，查看每個(gè)miRNA的擴(kuò)增情況，導(dǎo)出相應(yīng)的域值循環(huán)數(shù)Ct值。采用2-△Ct法，以U6為內(nèi)參，計(jì)算每個(gè)miRNA的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

比較miRNA標(biāo)志物及尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷膀胱癌的靈敏度、特異度及曲線下面積(area under the curve，AUC)，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 液態(tài)活檢膀胱癌尿液miRNA標(biāo)志物的篩選

通過對(duì)6例膀胱癌及6例健康對(duì)照者的尿液miRNA表達(dá)譜分析，篩選出10個(gè)miRNA(表1)。這些miRNA在12個(gè)標(biāo)本中均能檢測(cè)到相應(yīng)的Ct值，且Ct值均小于30，其平均Ct值在腫瘤組和對(duì)照組間存在一定差異，可以作為候選miRNA標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2 液態(tài)活檢膀胱癌尿液miRNA標(biāo)志物的驗(yàn)證

除了本研究篩選出的尿液miRNA外，我們還根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道的膀胱癌尿液miRNA標(biāo)志物，挑選了以下miRNA做驗(yàn)證，包括hsa-miR-499-3p、hsa-miR-1236、hsa-miR-330-5p、hsamiR-126、hsa-miR-182、hsa-miR-513-5p、hsamiR-183、hsa-miR-510、hsa-miR-375和hsa-miR-323-3p，總共20個(gè)miRNA進(jìn)行RTFQ-PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示，這些候選miRNA標(biāo)志物在78例膀胱癌患者和23例對(duì)照者的尿液中表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。miR-509-5p、miR-375、miR-183和miR-124在所有尿液標(biāo)本中均能檢測(cè)出Ct值，miR-509-5p、miR-375和miR-183在膀胱癌患者尿液中表達(dá)水平較健康對(duì)照者高，而miR-124在對(duì)照者尿液中表達(dá)水平較膀胱癌患者高。進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，miR-509-5p/miR-124比值在膀胱癌患者尿液中表達(dá)水平較對(duì)照者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.000 1，圖1)。

表1 尿液miRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果Tab. 1 Result of urine miRNA microarray

圖1 miR-509-5p/miR-124比值在膀胱癌患者及健康對(duì)照者尿液中表達(dá)水平比較Fig. 1 Compare expression level of miR-509-5p/miR-124 ratio between bladder cancer patients and healthy controls

2.3 液態(tài)活檢miR-509-5p/miR-124比值與膀胱癌臨床病理的關(guān)系

78例膀胱癌患者中，Ta期20例，T1期21例，T2-4期37例，G1級(jí)24例，G2級(jí)34例，G3級(jí)20例，尿液miR-509-5p/miR-124比值隨著腫瘤分期和腫瘤分級(jí)的上升而升高(P=0.003，圖2)。該比值與患者年齡、性別及腫瘤大小無關(guān)(P＞0.05)。

2.4 液態(tài)活檢miR-509-5p/miR-124比值診斷膀胱癌的價(jià)值

我們進(jìn)一步分析了尿液miR-509-5p/miR-124比值及尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷膀胱癌的價(jià)值。當(dāng)界值定在0.41時(shí)，miR-509-5p/miR-124比值對(duì)膀胱癌的診斷靈敏度為73.1%，特異度為82.6%，AUC為0.864，而尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷膀胱癌的靈敏度為43.6%，特異度為95.7%，AUC為0.696，兩者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3，表2，P=0.000 2)

圖2 miR-509-5p/miR-124比值與膀胱癌臨床分期及分級(jí)的關(guān)系Fig. 2 Relationship among miR-509-5p/miR-124 ratio, bladder cancer clinical stage and grade

圖3 miR-509-5p/miR-124比值及尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷膀胱癌的AUCFig. 3 The AUC in diagnosis of bladder cancer by miR-509-5p/ miR-124 ratio and urine cytology

表2 尿液miR-509-5p/miR-124比值及尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷膀胱癌的價(jià)值Tab. 2 The value in diagnosis of bladder cancer by miR-509-5p/miR-124 ratio and urine cytology

3 討 論

目前，臨床上主要依靠膀胱鏡和尿脫落細(xì)胞學(xué)對(duì)膀胱癌進(jìn)行診斷和監(jiān)測(cè)隨訪。前者雖然是確診膀胱癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但卻是一種創(chuàng)傷性的手段，并且膀胱內(nèi)的一些扁平病變及微小的乳頭狀病變，會(huì)出現(xiàn)遺漏或誤診。后者雖然是一種無創(chuàng)傷性手段，特異度高，但靈敏度較低，對(duì)于高分級(jí)的腫瘤靈敏度則更低，這使其臨床應(yīng)用受到很大限制［3］。

近年，膀胱腫瘤抗原、核基質(zhì)蛋白、透明質(zhì)酸、端粒酶和存活素等生物標(biāo)志物以及熒光原位雜交技術(shù)的運(yùn)用雖然在膀胱癌中顯示出了一定的臨床價(jià)值，較傳統(tǒng)的尿脫落細(xì)胞學(xué)方法提高了診斷的靈敏度，但特異度較尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查降低，并容易受到膀胱炎癥、手術(shù)及腔內(nèi)藥物治療等的影響［4］。因此，開發(fā)無創(chuàng)性、更高靈敏度和特異度的膀胱癌生物標(biāo)志物依然是臨床上的一個(gè)重要課題。

隨著近年細(xì)胞分離技術(shù)、測(cè)序技術(shù)等的發(fā)展，液態(tài)活檢在腫瘤個(gè)體化精準(zhǔn)治療中的地位越來越高。液態(tài)活檢可以包含檢測(cè)患者血液和尿液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、外泌體、循環(huán)腫瘤脫氧核糖核酸及循環(huán)miRNA等［5］。

miRNA是一類長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，廣泛存在于人類血液、唾液、痰液、腦脊液及尿液等體液中，可用于許多惡性腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷及監(jiān)測(cè)隨訪［6］。miRNA在組織、細(xì)胞中的表達(dá)表現(xiàn)為顯著的腫瘤相關(guān)性、組織特異性和表達(dá)穩(wěn)定性，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的病理進(jìn)程中，miRNA會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)改變［7-8］。尿液檢查是一種較為理想的無創(chuàng)傷性檢查手段，臨床上容易反復(fù)獲取，普遍較其他體液如血液、腦脊液、羊水及胸腔積液等更易被受檢者接受。

有研究發(fā)現(xiàn)，miR-96和miR-183在膀胱癌患者尿液中表達(dá)量明顯較健康人群和尿路感染者高，診斷靈敏度分別為71%和74%，特異度分別為89.2%和77.3%，尿液中miR-96和miR-183的水平與膀胱癌患者的病理分期和腫瘤分級(jí)相關(guān)［9］。Hanke等［10］篩選了36例膀胱癌患者、泌尿系統(tǒng)感染及健康人群的細(xì)胞外尿液中的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-126和miR-182在膀胱癌患者中明顯升高，經(jīng)過miR-152校正后，miR-126和miR-182診斷膀胱癌的靈敏度分別為72%和67%，特異度均為82%。Puerta-Gil等［11］通過對(duì)37例膀胱癌患者及57例對(duì)照者尿液細(xì)胞內(nèi)miRNA的RTFQ-PCR分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以miR-16為內(nèi)參校正后，miR-452和miR-222對(duì)膀胱癌診斷的AUC分別達(dá)到0.848和0.718，準(zhǔn)確性較好。以上研究均顯示出尿液miRNA標(biāo)志物應(yīng)用于膀胱癌診斷的價(jià)值，雖然得出了不錯(cuò)的結(jié)論，但各研究間發(fā)現(xiàn)的miRNA各不相同，因此如何優(yōu)化現(xiàn)有的尿液miRNA提取方法，特別是對(duì)尿液細(xì)胞外的微量miRNA進(jìn)行富集，建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化流程，以使各研究結(jié)果間具有重復(fù)性和可比性，是目前開展液態(tài)活檢膀胱癌尿液標(biāo)志物的關(guān)鍵。

為此，本研究從建立簡(jiǎn)單、易行、重復(fù)性好的尿液細(xì)胞外miRNA提取流程著手，發(fā)現(xiàn)使用mirVanaTmPARIS miRNA提取試劑盒提取的miRNA在RNA的濃度和純度方面較為滿意，同時(shí)參考既往研究［12］，在尿液樣本中加入了糖原，以進(jìn)一步沉淀和富集miRNA。在miRNA標(biāo)志物的驗(yàn)證過程中，我們綜合了本研究篩選出的差異表達(dá)miRNA，以及既往文獻(xiàn)中曾報(bào)道過的尿液miRNA標(biāo)志物。在候選的20條miRNA中，沒有發(fā)現(xiàn)在膀胱癌患者的尿液中呈現(xiàn)明顯高表達(dá)的單個(gè)miRNA。原因可能為：① 選擇進(jìn)行RTFQ-PCR驗(yàn)證的樣本數(shù)較少，無法得出統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)論；② 與其他不同的研究平臺(tái)、不同的樣本選擇(尿液細(xì)胞內(nèi)外miRNA)及不同的樣本處理和miRNA提取方法有關(guān)。但進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，miR-509-5p/miR-124比值在膀胱癌患者尿液中表達(dá)水平較對(duì)照組高，當(dāng)界值定在0.41時(shí)，miR-509-5p/miR-124比值對(duì)膀胱癌的診斷靈敏度為73.1%，特異度為82.6%，AUC為0.864，與既往報(bào)道的尿液其他miRNA標(biāo)志物，包括miR-126/miR-152、miR-182/miR-152、miR-452/ miR-16、miR-222/miR-16、miR-96和miR-183診斷膀胱癌的AUC(0.72～0.85)相比，診斷價(jià)值更好［9-11］。

本研究也分析了miR-509-5p/miR-124比值與膀胱癌臨床病理的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-509-5p/miR-124比值與膀胱腫瘤的分期和腫瘤分級(jí)有關(guān)，可見miR-509-5p與miR-124在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有一定作用，具體機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。

綜上，本研究通過優(yōu)化尿液中miRNA的提取方法，建立了標(biāo)準(zhǔn)化的液態(tài)活檢miRNA標(biāo)志物的檢測(cè)手段，篩選并驗(yàn)證出miR-509-5p/miR-124比值能較好的診斷膀胱癌。隨著未來進(jìn)一步擴(kuò)大病例數(shù)及多中心的驗(yàn)證，液態(tài)活檢miR-509-5p/miR-124比值有望成為膀胱癌早期診斷、預(yù)后判斷及監(jiān)測(cè)隨訪的理想腫瘤標(biāo)志物。

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The miR-509-5p/miR-124 ratio of liquid biopsies in diagnosis of bladder cancer

SHEN Yijun, XIE Huyang, WAN Fangning, BIAN Xiaojie, XIAO Wenjun, ZHU Yiping, DAI Bo, YE Dingwei (Department of Urology, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

YE Dingwei E-mail: dwyeli@163.com

Background and purpose: Liquid biopsy is a kind of blood, urine and other non-solid biological tissue sampling analysis, mainly for malignant tumor diagnosis, monitoring and predicting its prognosis. In this research, we optimized the extraction of miRNA in urine, established a standardized means of liquid biopsy, screened and verified the miRNA markers in patients with bladder cancer. Methods: From Jan. 2014 to Sept. 2015, we used miRNA microarray in six patients with bladder cancer and six healthy controls. Samples of 78 cases of bladder cancer and 23 healthy controls were tested by real-time fl uorescent quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) to verify the relationship between miRNA markers in liquid biopsy and clinical pathological parameters. The diagnostic value of miRNA markers was also analyzed and compared. Results: We screened 10 miRNAs differential expression in urine. Combined with previous literature, we selected 20 miRNAs to verify their expression levels in bladder cancers and healthy controls. miR-509-5p/miR-124 ratio in the urine was found higher in patients with bladder cancer than in healthy controls (P＜0.000 1). With the rise of miR-509-5p/miR-124 ratio in urine, tumor stage and grade were also increased (P=0.003). When the cutoffwas set at 0.41, the diagnostic sensitivity and specificity of miR-509-5p/miR-124 ratio were 73.1% and 82.6%, respectively. The AUC of miR-509-5p/miR-124 ratio to detect bladder cancer was 0.864, higher than that of urinary exfoliated cells (P=0.000 2). Conclusion: We optimized the extraction of miRNAs in urine,established a standardized liquid biopsy of miRNA markers. The miR-509-5p/miR-124 ratio could be an ideal diagnostic marker for bladder cancer.

Bladder cancer; miRNA; Diagnosis; Liquid biopsy

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.06.016

R737.14

A

1007-3639(2017)06-0496-05

2017-01-25

2017-03-15）

上海市衛(wèi)生計(jì)生委科研課題(2010Y014)。

葉定偉 E-mail: dwyeli@163.com