束婧婷，姬改革，單艷菊，章明，肖芹，屠云潔，盛中偉，張笛，鄒劍敏

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基于表達(dá)譜芯片挖掘雞骨骼肌不同類型肌纖維的 差異表達(dá)基因

束婧婷，姬改革，單艷菊，章明，肖芹，屠云潔，盛中偉，張笛，鄒劍敏

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225125）

【目的】肌纖維類型的差異是直接影響肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和肉品質(zhì)的重要因素，紅肌纖維比例高的肌肉肉品質(zhì)要顯著優(yōu)于白肌纖維比例高的肌肉，然而，目前對(duì)于雞骨骼肌纖維類型形成及轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。本究以中國(guó)優(yōu)良的地方品種清遠(yuǎn)麻雞為研究對(duì)象，首次對(duì)其骨骼肌中不同類型肌肉的轉(zhuǎn)錄組差異進(jìn)行了研究，以期挖掘在雞肌纖維生成和類型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵因子?！痉椒ā坎捎肁gilent雞全基因組表達(dá)譜芯片對(duì)清遠(yuǎn)麻雞骨骼肌表型差異較大的比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌中與肌纖維類型組成和轉(zhuǎn)換相關(guān)的候選基因進(jìn)行系統(tǒng)篩查，采用熒光定量PCR對(duì)芯片篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，采用慢病毒質(zhì)粒包裝系統(tǒng)構(gòu)建特異靶向雞PPARGC1A基因的RNA干擾慢病毒載體進(jìn)行基因功能研究。【結(jié)果】芯片結(jié)果共發(fā)現(xiàn)差異倍數(shù)在2倍及以上的基因1 224個(gè)(<0.05, FC≥2)，以趾長(zhǎng)伸肌作為參照，比目魚肌中上調(diào)基因?yàn)?54個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?70個(gè)，盡管芯片和熒光定量PCR兩種方法得出的差異倍數(shù)并不完全一致，但所選基因的表達(dá)趨勢(shì)是一致的，表明芯片結(jié)果是可靠的。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO（GO ontology）功能分類，共發(fā)現(xiàn)了74個(gè)顯著性GO，主要分為生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分等3大類?；贙EGG Pathway分析發(fā)現(xiàn)，一些已知的與肌纖維類型轉(zhuǎn)換、肌肉發(fā)育以及脂質(zhì)代謝相關(guān)的信號(hào)通路在兩種類型的肌肉中被顯著富集。綜合差異基因的GO、KEGG Pathway和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，推測(cè)PRKAG3, ATP2A2以及PPARGC1A可能是與肌纖維類型性狀緊密關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因。進(jìn)一步對(duì)PPARGC1A基因進(jìn)行功能研究發(fā)現(xiàn)，PPARGC1A基因的敲低，引起了PPP3CA，MEF2C以及SM等慢肌纖維標(biāo)志基因以及與肌纖維發(fā)育與轉(zhuǎn)換相關(guān)基因表達(dá)水平的顯著降低，而快肌纖維標(biāo)志基因FWM的表達(dá)水平則顯著上升?！窘Y(jié)論】揭示了雞紅肌和白肌兩種不同類型肌肉間的轉(zhuǎn)錄組差異，證明了PPARGC1A基因能夠與鈣離子信號(hào)通路相關(guān)基因協(xié)同從而在雞肌纖維類型組成和轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著重要作用，從而為中國(guó)地方雞肉品質(zhì)性狀的遺傳改良提供一定的理論依據(jù)。

表達(dá)譜芯片；轉(zhuǎn)錄組差異；肌纖維類型；PPARGC1A；雞

0 引言

【研究意義】骨骼肌是雞胴體中最主要的組成部分，約占體重的50%，它不僅是運(yùn)動(dòng)器官，更是內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分，參與整個(gè)機(jī)體代謝的調(diào)節(jié)[1]。肌纖維是構(gòu)成肌肉組織的基本單位，根據(jù)外觀、收縮特性和代謝特征可將雞骨骼肌纖維分成氧化型纖維（I型和IIa型，色紅，進(jìn)行有氧代謝）和酵解型纖維（IIb型，色白，進(jìn)行酵解代謝）[2]。研究表明，肉的產(chǎn)量和質(zhì)量都與肌纖維的生長(zhǎng)和組成密切相關(guān)，肌纖維類型的差異是直接影響肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和肉品質(zhì)的重要因素[3]，氧化型肌纖維比例高的肌肉肉品質(zhì)要顯著優(yōu)于酵解型肌纖維比例高的肌肉[4]，在雞上，比目魚肌以氧化型肌纖維為主，而趾長(zhǎng)伸肌和腓腸肌外側(cè)頭則以酵解型肌纖維為主。動(dòng)物骨骼肌纖維類型組成并不是完全固定的，它們會(huì)隨著骨骼肌對(duì)代謝與功能需求的改變而發(fā)生改變。因此，研究肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育及類型組成和轉(zhuǎn)換的分子機(jī)理，挖掘在肌纖維生成和類型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵因子將對(duì)雞肉品質(zhì)的遺傳改良提供新的思路和策略。【前人研究進(jìn)展】目前，國(guó)內(nèi)外在肌纖維類型形成及其轉(zhuǎn)換相關(guān)的分子遺傳學(xué)方面已開(kāi)展了一定的研究，并發(fā)現(xiàn)IGF-I-鈣調(diào)磷酸酶-NFAT信號(hào)途徑可能是調(diào)節(jié)肌肉生長(zhǎng)、決定不同肌纖維類型的主要信號(hào)途徑[5-6]。然而，肌纖維類型的發(fā)生與轉(zhuǎn)換受到許多信號(hào)通路、基因與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，是一個(gè)非常復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，因此，很有必要在全基因組水平挖掘和篩選與肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育和類型組成相關(guān)的基因和信號(hào)通路?；蛐酒夹g(shù)由于能夠同時(shí)檢測(cè)出某個(gè)特定組織中的大量差異表達(dá)基因而被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究等領(lǐng)域[7]。許多學(xué)者也在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)不同物種中決定氧化型和酵解型肌纖維差異的機(jī)理進(jìn)行了研究。CAMPBELL等采用Affymetrix芯片在雌鼠紅肌和白肌中共發(fā)現(xiàn)了49個(gè)差異表達(dá)基因[8]。BAI 等采用豬骨骼肌cDNA芯片對(duì)22周齡約克夏豬腰肌（紅?。┖捅匙铋L(zhǎng)?。ò准。┻M(jìn)行了差異表達(dá)基因篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一批在肌纖維類型組成中可能具有重要作用的候選基因[9]。LI等對(duì)梅山豬紅肌和白肌組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了包括胰島素信號(hào)通路和細(xì)胞周期通路在內(nèi)的與不同肌纖維類型代謝特征相關(guān)的28條信號(hào)通路[10]。在雞上，ZHENG等對(duì)不同發(fā)育時(shí)期蛋雞和肉雞胸肌的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)了調(diào)控肌肉生長(zhǎng)速度的一些關(guān)鍵基因[11]。本課題組前期采用Aligent表達(dá)譜芯片對(duì)清遠(yuǎn)麻雞和科寶肉雞比目魚肌進(jìn)行了差異表達(dá)基因和信號(hào)通路的篩選，共篩選到差異基因1 318個(gè)，主要涉及到肌肉發(fā)育、能量代謝、脂質(zhì)代謝等生物學(xué)過(guò)程[12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管前人在哺乳動(dòng)物不同類型肌肉組織轉(zhuǎn)錄水平上的差異研究取得了階段性進(jìn)展，但在全基因組表達(dá)水平上對(duì)雞骨骼肌表型差異的分子調(diào)控機(jī)理研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】清遠(yuǎn)麻雞是中國(guó)著名的地方雞品種，素以皮色金黃、肉質(zhì)嫩滑、皮脆爽、骨軟、風(fēng)味獨(dú)特而馳名于粵港澳市場(chǎng)。本研究以清遠(yuǎn)麻雞為研究對(duì)象，采用Agilent雞全基因組表達(dá)譜芯片（4×44K，Design ID：026441）對(duì)比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，通過(guò)對(duì)差異基因進(jìn)行GO，KEGG信號(hào)通路以及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，確定與肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育及類型組成相關(guān)的新候選基因，并進(jìn)一步通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的基因干擾技術(shù)進(jìn)行基因功能的驗(yàn)證。研究結(jié)果將為優(yōu)質(zhì)雞肉品質(zhì)性狀遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2015年3—12月在江蘇省家禽科學(xué)研究所下屬的江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

清遠(yuǎn)麻雞來(lái)自于廣東天農(nóng)食品有限公司清遠(yuǎn)麻雞原種場(chǎng)，在同樣的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下飼養(yǎng)至性成熟日齡（112d，平均體重1 330g），隨機(jī)選擇體重相近的全同胞母雞3只進(jìn)行屠宰。屠宰后，立即采集兩側(cè)趾長(zhǎng)伸肌和比目魚肌，其中右側(cè)比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌中間1 cm×1 cm部分用于肌纖維性狀的測(cè)定，左側(cè)相同部位樣品用于RNA抽提和芯片分析，所有樣品均置于液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.3 肌纖維性狀組織學(xué)測(cè)定

在恒溫冷凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行冰凍切片的制作，每個(gè)樣品在垂直于肌纖維延展方向做10張連續(xù)橫切切片，切片厚度12 μm。采用ATPase堿孵育法進(jìn)行肌纖維類型、肌纖維密度、肌纖維直徑和面積的判定，在經(jīng)典的Guth-Samaha法[13]基礎(chǔ)上改良后進(jìn)行染色，全部試劑均新鮮配制。

1.4 RNA提取、質(zhì)量檢測(cè)及純化

采用mirVanaTMRNA提取試劑盒（Applied Biosystemp/n AM1556）提取比目魚肌、趾長(zhǎng)伸肌和成肌細(xì)胞總RNA，用Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent）對(duì)總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，合格后使用QIAGEN RNeasy?Mini Kit（QIAGEN）和RNsae-Free DNase Set（QIAGEN）純化總RNA，采用Agilent Bioanalyzer2100（Agilent Technologies）檢測(cè)RNA完整性，本試驗(yàn)所有樣品RIN值均大于9，符合檢測(cè)要求。

1.5 芯片雜交

基因表達(dá)譜芯片采用Agilent公司的雞全基因組4×44K芯片（Design ID：026441），探針數(shù)量為43 803。芯片雜交及數(shù)據(jù)處理由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。采用Low Input Quick Amp Labeling Kit, One-Color試劑盒（Agilent）對(duì)總RNA進(jìn)行放大和標(biāo)記；總RNA經(jīng)第一鏈和第二鏈合成得到cRNA，Cyanine-3-CTP（Cy3）標(biāo)記cRNA鏈后，用QIAGEN RNeasy Mini kit（QIAGEN）純化標(biāo)記后的cRNA；芯片雜交采用Agilent表達(dá)譜芯片配套試劑盒；采用Agilent Microarray Scanner進(jìn)行掃描，分辨率為5 μm，掃描儀自動(dòng)以100%和10%PMT各掃描1次，以Agilent自動(dòng)合并2次結(jié)果作為最終結(jié)果；采用Feature Extraction Software（version10.7.1.1, Agilent Technologies）讀取數(shù)據(jù)，Genespring Software（version 12.5; Agilent Technologies）進(jìn)行歸一化處理，算法為Quantile。所有操作均按試劑盒說(shuō)明和Agilent表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)操作和分析手冊(cè)進(jìn)行。

1.6 熒光定量PCR

為驗(yàn)證芯片的結(jié)果，本研究選擇了9個(gè)差異表達(dá)基因，根據(jù)GenBank中的基因序列設(shè)計(jì)引物（表1）。參與芯片雜交的比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌總RNA同樣用于熒光定量PCR驗(yàn)證試驗(yàn)。采用SYBR Green I法進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理，反應(yīng)體系如下：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol·L-1），cDNA 模板1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加ddH2O 7.8 μL補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增后經(jīng)熔解曲線檢測(cè)特異性。每次反應(yīng)均設(shè)空白樣品為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。相對(duì)定量的結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。采用Pearson’s相關(guān)檢驗(yàn)對(duì)基因芯片和qRT-PCR 2種方法的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

表1 熒光定量PCR引物

1.7 PPARGC1A基因shRNA載體構(gòu)建、細(xì)胞分離培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

根據(jù)PPARGC1A基因序列（NM_001006457.1）設(shè)計(jì)并合成4對(duì)shRNA片段，分別為shRNA-563（5′GCAATAAAGCGAAGAGCATTT3′），shRNA-926（5′GGACTTCACCTAAGCCGAAGT3′），shRNA-驗(yàn)1317（5′GCAGGGATCCCAAGGTAATAA3′）andshRNA-1688（5′GCT CTAGATCAAGGTCCTTTC3′），同時(shí)設(shè)計(jì)了NC shRNA作為陰性對(duì)照：5′ TTCTCC GAACGTGTCACGTTTC3′，由上海吉瑪基因股份有限公司完成。

成肌細(xì)胞分離自10胚齡的清遠(yuǎn)麻雞，分離方法參照LI等[14]。細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度至1×106個(gè)/mL，接種于6孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%—80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48h后觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，72h后收集細(xì)胞提取RNA進(jìn)行熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)shRNA-1317轉(zhuǎn)染效率最高，故將其用于轉(zhuǎn)染正式試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后96h收集細(xì)胞，采用熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中與肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育與類型轉(zhuǎn)換相關(guān)基因SM，F(xiàn)RM，MEF2C，NFATC3和PPP3CA的表達(dá)變化（表1）。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAM3.0軟件篩選差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為≤0.05，同時(shí)變化倍數(shù)≥2或≤0.5。采用GOEAST軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能分類（Gene ontology, GO），KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome. jp/kegg/），利用Fisher精確檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)對(duì)差異基因參與的Pathway進(jìn)行顯著性分析，按照value<0.05進(jìn)行篩選得到顯著性的Pathway。采用cytoscape3.3軟件對(duì)差異基因進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。

運(yùn)用SPSS軟件（IBM SPSS Statistics 20）中ANOVA統(tǒng)計(jì)目的基因在不同類型肌肉之間的表達(dá)差異。所有數(shù)據(jù)以Mean ± SE表示，＜0.05，表示差異顯著；＜0.01，表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 清遠(yuǎn)麻雞比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌中肌纖維性狀比較

比較了清遠(yuǎn)麻雞比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌的肌纖維橫截面積、直徑、密度以及氧化型和酵解型肌纖維的比例，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，趾長(zhǎng)伸肌的肌纖維橫截面積、直徑以及酵解型纖維比例均顯著高于比目魚肌（＜0.05），而肌纖維密度和氧化型纖維比例則顯著低于比目魚?。ǎ?.05）。

表2 清遠(yuǎn)麻雞比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌的肌纖維性狀比較

1Significance: * (＜0.05)

2.2 比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌中差異表達(dá)基因篩選及熒光定量PCR驗(yàn)證

采用Agilent雞全基因組表達(dá)譜芯片比較清遠(yuǎn)麻雞比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌中基因表達(dá)譜差異，共發(fā)現(xiàn)差異倍數(shù)在2倍及以上的基因1 224個(gè)（＜0.05, FC≥2），以趾長(zhǎng)伸肌作為參照，比目魚肌中上調(diào)基因?yàn)?54個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?70個(gè)，差異基因的功能主要涉及收縮結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架、細(xì)胞信號(hào)、能量代謝、應(yīng)激、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、脂肪酸合成和代謝等方面。所有芯片數(shù)據(jù)均已提交至NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)為GSE69918）。

采用熒光定量PCR的方法對(duì)基因芯片所篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行了驗(yàn)證，隨機(jī)選取9個(gè)基因，其中下調(diào)基因6個(gè)（MYH1E, PPP3CA, PPP3R1, PRKAG3, FASN和STAT5B），上調(diào)基因2個(gè)（PPARGC1A, BMP4和SCD5）。除了FASN基因外，其他8個(gè)基因在兩種肌肉組織中的表達(dá)量均表現(xiàn)出顯著差異（＜0.05 or＜0.01）（圖1）。通過(guò)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，芯片和熒光定量PCR兩種方法所得的結(jié)果具有正相關(guān)關(guān)系，所選基因的表達(dá)趨勢(shì)是一致的，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.85（表3），結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性。

2.3 差異表達(dá)基因的GO和KEGG信號(hào)通路分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO（GO ontology）功能分類，共發(fā)現(xiàn)了74個(gè)顯著性GO（＜0.05），主要分為3大類：生物學(xué)過(guò)程（34個(gè)顯著性GO）、分子功能（20個(gè)顯著性GO）和細(xì)胞組分（20個(gè)顯著性GO）。在生物學(xué)過(guò)程方面，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要參與了能量代謝過(guò)程（包括小分子代謝過(guò)程，碳水化合物代謝過(guò)程，糖酵解過(guò)程，氧化還原過(guò)程，類固醇代謝過(guò)程以及丙酮酸代謝過(guò)程）。同時(shí)，3個(gè)與肌肉發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程也被顯著富集，分別為快肌與慢肌纖維的轉(zhuǎn)換過(guò)程，胚胎骨骼形態(tài)發(fā)生過(guò)程以及骨骼肌收縮過(guò)程，TNNC1, ATP2A2, HOXD11, COL2A1, CHRNA1和TNNI2等6個(gè)基因參與了這些生物學(xué)過(guò)程，這些基因可能在肌纖維發(fā)育和類型組成中發(fā)揮重要作用。

本研究的差異表達(dá)基因共被富集到20條顯著的KEGG信號(hào)通路（＜0.05），其中心肌細(xì)胞的腎上腺素信號(hào)通路最為顯著（圖2）。值得關(guān)注的是，一些已知的與肌纖維類型轉(zhuǎn)換（Calcium和PPAR信號(hào)通路）、肌肉發(fā)育（Insulin信號(hào)通路）以及脂質(zhì)代謝（adipocytokine信號(hào)通路）相關(guān)的信號(hào)通路也在兩種類型的肌肉中被富集到，共有62個(gè)差異表達(dá)基因參與到這4條信號(hào)通路中，包括ATP2A2, PRKAG3, PPARGC1A和TNNC1。

表3 芯片和熒光定量?jī)煞N方法基因表達(dá)的差異倍數(shù)

*表示達(dá)到顯著水平P＜0.05，**表示達(dá)到極顯著水平P＜0.01 * shows significance level at P＜0.05,** shows significance level at P＜0.01.

圖2 兩種類型肌肉組織中差異表達(dá)基因富集顯著的KEGG信號(hào)通路

2.4 差異基因共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

為了進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，筆者從差異表達(dá)的基因中選擇了一些已知的與肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育和類型組成相關(guān)的基因，首先采用Person’s相關(guān)分析基因間的相關(guān)系數(shù)，然后以相關(guān)系數(shù)2＞0.8且＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，選留了300個(gè)基因?qū)Γ⒉捎胏ytoscape3.3軟件構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，PPP2CA, PRKAG3, ATP2A2, PPARGC1A和PPARGC1B為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因（圖3）。

綜合GO，KEGG信號(hào)通路以及基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，推測(cè)PRKAG3, ATP2A2 以及PPARGC1A可能是與肌纖維類型性狀緊密關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因，且ATP2A2和PPARGC1A在紅肌中的mRNA表達(dá)水平要高于白肌。因此，筆者選擇了其中的PPARGC1A基因進(jìn)行了后續(xù)的功能驗(yàn)證。

紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因，色塊的大小表示上調(diào)或下調(diào)的倍數(shù)多少，實(shí)線和虛線分別表示正相關(guān)和負(fù)相關(guān)

2.5 干擾PPARGC1A基因后對(duì)肌纖維發(fā)育及類型相關(guān)基因的影響

本研究設(shè)計(jì)的4對(duì)shRNA片段（shRNA-563, shRNA-926, shRNA-1317和shRNA-1688）的干擾效率分別為11%，26%，46%和37%。因此，選擇干擾效率最高的shRNA-1317進(jìn)行正式試驗(yàn)。在干擾后96h，熒光定量PCR結(jié)果顯示，PPARGC1A基因的表達(dá)被有效抑制（＜0.01）。PPARGC1A基因的敲低，也引起了PPP3CA（＜0.01），MEF2C（＜0.05）以及SM（＜0.01）等慢肌纖維標(biāo)志基因以及與肌纖維發(fā)育與轉(zhuǎn)換相關(guān)基因表達(dá)水平的顯著降低，而快肌纖維標(biāo)志基因FWM的表達(dá)水平則顯著上升（＜0.05）（圖4）。

**和*分別表示P＜0.01和P＜ 0.05 ** and * indicated P＜0.01 and P＜0.05, respectively

3 討論

3.1 兩種類型肌肉之間的差異表達(dá)基因分析

肌纖維類型的組成可影響肉色、系水力、嫩度、多汁性以及風(fēng)味等諸多肉品質(zhì)性狀。RENAND等研究表明，肌纖維大小與肉品質(zhì)性狀存在負(fù)相關(guān)，I型肌纖維含量越高的肌肉，其多汁性和風(fēng)味越好[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，清遠(yuǎn)麻雞比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌在表型上也存在顯著的差異，趾長(zhǎng)伸肌中肌纖維橫截面積、直徑以及白肌纖維的比例均顯著高于比目魚肌，這也與前人報(bào)道的比目魚肌為紅肌為主的肌肉，而趾長(zhǎng)伸肌為白肌為主的肌肉的事實(shí)相符合[4]。因此，本研究以這兩種類型肌肉為研究對(duì)象，采用安捷倫雞全基因組表達(dá)譜芯片挖掘雞肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育及類型組成的候選基因。結(jié)果在比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌間共發(fā)現(xiàn)了1 224個(gè)差異表達(dá)基因，隨機(jī)選取其中9個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，盡管所選基因在兩種方法間的差異倍數(shù)并不完全一致，但表達(dá)趨勢(shì)是高度一致的，這也證明本研究芯片分析得出的結(jié)果是可信的。

通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因的分析和文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)一些已被報(bào)道的在紅肌和白肌間差異表達(dá)的基因，如PGM1, fibronectin, HMOX1, SM1, MYH1E, PPARGC1A, PPARGC1B, PPP3CA以及PPP3R1[8, 10, 16-18]，在本研究中同樣被篩選到。值得關(guān)注的是，一些能量代謝相關(guān)酶基因、膠原蛋白基因以及慢肌蛋白編碼基因等可能與優(yōu)良肉品質(zhì)相關(guān)的基因在氧化型肌肉中的表達(dá)量也要顯著高于酵解型肌肉。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)了一些未曾報(bào)道的與肌纖維類型相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子如PPARA, HOXA1以及GTF3C6等，在不同類型的肌肉間也表現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)，這些將可能作為對(duì)不同肌纖維類型進(jìn)行調(diào)控的新轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.2 GO、KEGG信號(hào)通路及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

本研究的GO功能分類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參與能量代謝相關(guān)通路（如小分子代謝過(guò)程、碳水化合物代謝過(guò)程、糖酵解過(guò)程、氧化還原過(guò)程、類固醇代謝過(guò)程和丙酮酸的代謝過(guò)程）和肌肉發(fā)育相關(guān)通路（如快肌與慢肌纖維的轉(zhuǎn)換過(guò)程，胚胎骨骼形態(tài)發(fā)生過(guò)程以及骨骼肌收縮過(guò)程）的基因在兩種類型的肌肉中具有顯著差異，這也與不同肌纖維類型具有不同的能量代謝特征的報(bào)道一致[19]。KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞的腎上腺素信號(hào)通路被富集為最顯著的通路，該信號(hào)通路是心肌細(xì)胞中最為重要的蛋白信號(hào)系統(tǒng)，能夠調(diào)節(jié)心臟搏動(dòng)時(shí)間、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)以及收縮強(qiáng)度[22]。同時(shí)，一些與肌纖維類型轉(zhuǎn)換相關(guān)的通路（如Calcium和 PPAR信號(hào)通路）、肌肉發(fā)育相關(guān)通路（Insulin信號(hào)通路）以及脂質(zhì)代謝相關(guān)通路（如adipocytokine信號(hào)通路）也被富集為顯著的信號(hào)通路。Calcium信號(hào)通路是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一受鈣離子/鈣調(diào)素（Calmodulin, CaM）活化的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，可通過(guò)去磷酸化作用使某些特異的轉(zhuǎn)錄因子如T細(xì)胞活化核因子（nuclear factor of activated t cell, NFAT）和核因子kappaB（Nuclear factor kappa B, NFКB）等激活后進(jìn)入細(xì)胞核，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，可促使慢肌纖維特異表達(dá)的一些基因表達(dá)水平上調(diào)[23]。PPAR信號(hào)通路在肌纖維類型的調(diào)控中同樣發(fā)揮著重要的作用[24]。Insulin信號(hào)通路中的IGF-I很早即被證明能夠刺激成肌細(xì)胞分化速率并影響生肌調(diào)節(jié)因子家族基因的表達(dá)[25-26]。該結(jié)果表明與肌肉、脂肪和結(jié)締組織發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路之間可能存在互作，形成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)從而影響肌纖維發(fā)育和類型組成。

本研究進(jìn)一步基于GO和KEGG信號(hào)通路分析中發(fā)現(xiàn)的或者已有文獻(xiàn)報(bào)道的與肌纖維發(fā)育和類型轉(zhuǎn)換相關(guān)的基因，進(jìn)行了基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。通過(guò)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)了3個(gè)可能與雞肌纖維類型組成相關(guān)的重要的節(jié)點(diǎn)基因（PRKAG3, ATP2A2 和PPARGC1A），這3個(gè)基因彼此之間存在互作關(guān)系，這與前人的報(bào)道相一致[27]。PRKAG3是編碼一磷酸腺苷激活蛋白激酶（a heterotrimeric serine/threonine protein kinase，AMPK）γ3亞基的基因，只在骨骼肌中特異性地表達(dá)。CHEN等報(bào)道PRKAG3基因中的一個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)肌纖維密度具有顯著的遺傳效應(yīng)[28]。本研究中，PRKAG3基因在趾長(zhǎng)伸肌中的mRNA表達(dá)量要顯著高于比目魚?。ú町惐稊?shù)為10.82，＜0.01），這也與趾長(zhǎng)伸肌中具有較高的糖原含量的事實(shí)相符合，同時(shí)也與前人在哺乳動(dòng)物中的報(bào)道結(jié)果一致，即PRKAG3基因在快速酵解型肌肉中的表達(dá)量要顯著高于氧化酵解型肌肉，而在慢速氧化型肌肉中基本檢測(cè)不到[29]。ATP2A2是ATP2As基因家族的成員，編碼肌漿（內(nèi)質(zhì)）網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶中的一種，即SERCA2，在鈣離子相關(guān)信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用。WEI等報(bào)道ATP2A2能夠調(diào)控慢肌基因的表達(dá)[30]，這也與本研究中該基因在氧化型的比目魚肌中特異性高表達(dá)（差異倍數(shù)151.9，＜0.001）的結(jié)果一致。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1A（PPARGC1A或PGC-1α）是一種多功能的輔激活因子，在骨骼肌超表達(dá)PGC-1α的轉(zhuǎn)基因小鼠中，快酵解型肌肉股肌和跖肌中I型肌纖維的含量增加；同時(shí)，利用快慢肌纖維特異的啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)PGC-1α與MEF2蛋白協(xié)同激活慢肌纖維相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄并能夠作為CaN信號(hào)通路的靶基因發(fā)揮作用[16]。課題組前期研究了PGC-1α基因?qū)﹄u肌纖維特性的遺傳效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該基因的多態(tài)位點(diǎn)及其單倍型與肌纖維類型等性狀緊密關(guān)聯(lián)[31]，因此，本研究選擇PPARGC1A基因作為影響肌纖維類型組成及轉(zhuǎn)換的候選基因進(jìn)行了進(jìn)一步的功能研究。

3.3 PPARGC1A基因在肌纖維類型組成和轉(zhuǎn)換中的作用

本研究共構(gòu)建了4對(duì)shRNA片段來(lái)研究PPARGC1A基因在肌纖維類型組成和轉(zhuǎn)化中的功能，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)選擇了干擾效率最高的shRNA-1317進(jìn)行正式試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPARGC1A基因的敲低，引起了PPP3CA，MEF2C以及SM等慢肌纖維標(biāo)志基因以及與肌纖維發(fā)育與轉(zhuǎn)換相關(guān)基因表達(dá)水平的顯著降低，而快肌纖維標(biāo)志基因FWM的表達(dá)水平則顯著上升，這一結(jié)果也證明了PPARGC1A基因能夠與鈣離子信號(hào)通路相關(guān)基因協(xié)同從而在雞肌纖維類型組成和轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著重要作用，也驗(yàn)證了LIN等的結(jié)論，即PPARGC1A可能與MEF2蛋白協(xié)同激活慢肌纖維相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄并能夠作為CaN信號(hào)通路的靶基因發(fā)揮作用[16]。

4 結(jié)論

首次在全基因組水平上研究了清遠(yuǎn)麻雞不同類型肌肉（紅肌和白?。┲谢虮磉_(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了PRKAG3, ATP2A2和PPARGC1A基因可能在肌纖維類型組成和轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用。對(duì)PPARGC1A基因進(jìn)一步的功能驗(yàn)證證實(shí)了該基因在雞肌纖維類型組成和轉(zhuǎn)換中發(fā)揮了重要的作用。本研究結(jié)果將對(duì)中國(guó)地方雞肉品質(zhì)性狀的遺傳改良提供重要的理論指導(dǎo)。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Analysis of Differential Expression Genes Between Different Myofiber Types in Chicken Skeletal Muscle Based on Gene Expression Microarray

SHU JingTing, JI GaiGe, SHAN YanJu, ZHANG Ming, XIAO Qin, TU YunJie, SHENG ZhongWei, ZHANG Di, ZOU JianMin

(Jiangsu Institute of Poultry Science，Key laboratory for Poultry Genetics and Breeding of Jiangsu Province, Yangzhou 225125)

【Objective】It has been well documented that myofiber type composition can profoundly influence postnatal muscle growth and meat quality, a higher content of red (oxidative) fibers in muscles exhibits excellent meat quality than muscles contain a high content of white (glycolic) fibers. However, the molecular processes that govern the expression of specific fiber type and the phenotypic characteristics of skeletal muscle remains unclear. In the present study, the transcriptional differential analysis between red and white myofiber types was firstly studied in Qingyuan partridge chickens in order to identify key factors that regulates chicken myofiber composition and transition. 【Method】A global gene expression profiling investigation was conducted to identify differentially expressed genes between red () and white () muscle of Qingyuan partridge chickens using the Agilent Chicken Gene Expression Chip. qRT-PCR assays were used to validate the microarray hybridization results, and lentivirural plasmids pack-aging system was used to establish a lentiviral vector for RNA interference of specific targeting chicken PPARGC1A gene to study the function of the target gene. 【Result】A total of 1224 genes with at least 2-fold differences were identified at the<0.05 significance level (<0.05, FC ≥ 2). Compared with the expression of transcripts in EDL, a set of 654 transcripts belonged to the up-regulated group, and another set of 570 transcripts belonged to the down-regulated group in SOL. Although fold changes of the selected genes were not exactly the same between real-time PCR assay and microarray assay, the expression tendencies were highly consistent, suggesting that the data from microarray assay in this study was reliable. A total of 74 significantly different GO terms (value<0.05) were obtained. These terms were categorized into one of three categories: biological process, molecular function and cellular component. KEGG pathway analysis revealed that some well known pathways affecting muscle fiber transition, muscle development and lipid metabolism were enriched in both types of muscles. The results of the GO, KEGG pathway and gene coexpression network analysis indicated that PRKAG3, ATP2A2 and PPARGC1A might be the key genes related to chicken muscle fiber characteristics, and PPARGC1A was selected for the further functional analysis. Genes involved in the calcium signaling such as PPP3CA and MEF2C as well as MyHC SM isoform were significantly down-regulated, while MyHC FRM isoform was significantly up-regulated by PPARGC1A knockdown after shRNA interference.【Conclusion】The analysis presented the gene expression profiles and identified DEGs that may be related to the phenotypic differences between red (SOL) and white (EDL) muscles in chickens. Further shRNA analysis demonstrated that PPARGC1A might play an important role in chicken myofiber composition and can co-activate the transcriptional activity of calcium signaling genes. Results of this study will provide new clues to understand the molecular basis of chicken myofiber composition and transition, and also will provide a theoretical basis for improving and controlling meat quality of chickens.

microarray;differential transcriptional analysis; myofiber types; PPARGC1A; chicken

2016-07-25；接受日期：2017-05-22

國(guó)家自然科學(xué)基金（31301967，31572358）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-42-G03）、江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（現(xiàn)代農(nóng)業(yè)）（BE2015344）、江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金（CX(15)1009）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20161322）、江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉雞）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系集成創(chuàng)新中心（首席專家）（SXGC[2017]254）

束婧婷，E-mail：shujingting@163.com。通信作者鄒劍敏，E-mail：jqszjm@163.com