‘嘎啦’蘋果花藥培養(yǎng)種質(zhì)創(chuàng)新

溫鑫，鄧舒，張春芬，侯麗媛，石江鵬，聶園軍，肖蓉，秦永軍，曹秋芬,

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‘嘎啦’蘋果花藥培養(yǎng)種質(zhì)創(chuàng)新

溫鑫1，鄧舒3，張春芬3，侯麗媛2，石江鵬1，聶園軍4，肖蓉3，秦永軍2，曹秋芬1,2

（1山西大學(xué)生物工程學(xué)院，太原 030006；2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原030031；3山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，山西太谷030815；4山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，太原030031）

【目的】單倍體花藥離體培養(yǎng)是農(nóng)作物包括果樹育種中種質(zhì)資源創(chuàng)新的最有效方法之一，蘋果是染色體高度雜合且自交不親和樹種之一。在當(dāng)前蘋果主栽品種中，‘嘎啦’具有早熟、豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、多抗的優(yōu)良性狀，是蘋果育種的重要種質(zhì)資源之一?；ㄋ巻伪扼w育種也是蘋果新品種培育的重要手段。本研究通過‘嘎啦’蘋果花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體并獲得純合再生植株，為創(chuàng)制新的純合體種質(zhì)資源，加速蘋果新品種培育進(jìn)程提供材料?！痉椒ā坎杉吕病O果單核靠邊期到雙核早期的花藥（未開放的花蕾）, 低溫處理后進(jìn)行離體培養(yǎng)，經(jīng)胚狀體誘導(dǎo)，分化培養(yǎng)形成再生苗，再經(jīng)生根培養(yǎng)獲得花藥再生植株。之后利用FACS流式細(xì)胞儀對再生植株進(jìn)行倍性分析。取再生植株葉片分離DNA，選用80個(gè)來源于蘋果HIDRAS數(shù)據(jù)庫的SSR標(biāo)記對所有植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過凝膠電泳和熒光毛細(xì)管電泳鑒定再生植株純合基因型。移栽成活后，對每個(gè)再生株系進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征觀察及統(tǒng)計(jì)分析。【結(jié)果】過去3年中，共接種的74 200個(gè)‘嘎啦’花藥，從未被污染的5萬多個(gè)花藥中成功誘導(dǎo)形成386個(gè)胚狀體（胚狀體誘導(dǎo)率0.7%），經(jīng)分化培養(yǎng)獲得64株再生苗（植株再生率16.6%），最終經(jīng)生根培養(yǎng)、移栽獲得30個(gè)成活再生株系。其中包括28個(gè)二倍體株系，1個(gè)單倍體株系和1個(gè)四倍體株系。SSR標(biāo)記用于純合性鑒定，PAGE結(jié)果表明再生株系均為花粉（小孢子）單倍體細(xì)胞來源。為了鑒定這些再生植株基因型，從80個(gè)SSR中篩選出17個(gè)SSR標(biāo)記（其余SSR標(biāo)記不具有多態(tài)性或帶型雜亂）對所獲得的30個(gè)再生株系進(jìn)行基因型鑒定。17個(gè)SSR標(biāo)記所對應(yīng)的PCR擴(kuò)增物能有效區(qū)分鑒定不同再生植株基因型。繼代培養(yǎng)60 d后的形態(tài)學(xué)觀察顯示不同再生株系的株高、葉長、葉寬等特征差異明顯。不同二倍體純合植株的植物學(xué)特征也存在差異：Gala 5植株相對較高，葉基變寬，葉尖漸尖；Gala 7葉片變小、變厚，葉柄變短且基部寬大，葉色深且有很強(qiáng)的光澤度；Gala 18葉片較小，葉數(shù)較多。純合二倍體再生植株長勢弱于‘嘎啦’雜合供體，但強(qiáng)于單倍體和純合四倍體。【結(jié)論】采用優(yōu)化花藥培養(yǎng)技術(shù)，成功獲得了一批蘋果純合體再生植株種質(zhì)并建立了SSR標(biāo)記鑒定體系。這些新的種質(zhì)很大程度豐富了蘋果育種親本種質(zhì)資源，為挖掘‘嘎啦’蘋果優(yōu)良性狀基因提供了重要材料，為后期的田間性狀篩選，雜交育種奠定了基礎(chǔ)。

‘嘎啦蘋果’；花藥離體培養(yǎng)；單倍體育種；SSR標(biāo)記；純合基因型

0 引言

【研究意義】單倍體育種是首先通過雄核發(fā)育（包括離體花藥培養(yǎng)/小孢子培養(yǎng)）或孤雌生殖方法誘導(dǎo)形成單倍體植株，然后經(jīng)染色體加倍形成純合二倍體，其中具有優(yōu)良性狀的可育再生植株可作為新的育種材料。單倍體育種能加快獲得某一性狀純系，更重要的是極大豐富了親本種質(zhì)資源，從而更好的實(shí)現(xiàn)倍性育種，加快育種進(jìn)程[1-3]?；ㄋ幣囵B(yǎng)是單倍體育種的主要途徑之一，自然加倍形成的純合二倍體植株則是挖掘特有性狀基因、研究遺傳基礎(chǔ)及蘋果分子標(biāo)記輔助育種的理想材料[[4-8]。蘋果（Brokh）是世界上最重要的果樹之一[9]，中國蘋果產(chǎn)量居世界首位[10]。蘋果基因型高度雜合、異花授粉且自交不親和[11]，難以通過常規(guī)雜交育種獲得純合基因型植株，所以很大程度增加了蘋果單倍體育種難度[12-13]。通過花藥離體培養(yǎng)快速挖掘雜合體‘嘎啦’優(yōu)良性狀基因是蘋果育種中種質(zhì)創(chuàng)新的重要內(nèi)容?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自首次采用花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株以來[14]，目前已有250多種植物利用單倍體育種方法獲得再生植株[15]。20世紀(jì)70年代，Nakayama等[16]率先開始蘋果花藥培養(yǎng)，之后多個(gè)蘋果品種的花藥經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得了胚狀體[17]以及純合基因型植株[18]。依靠花藥培養(yǎng)技術(shù)，楊振英等[19]育成蘋果新品種‘華富’。Okada等[20]則獲得了‘千秋’純合可育再生植株。這些蘋果花藥培養(yǎng)再生植株，很大程度豐富了單倍體育種種質(zhì)資源[21]，擴(kuò)大了育種親本范圍。但是純合再生植株育性和結(jié)實(shí)率很低，直接用于雜交育種還有一定的困難。任瑩[22]通過蘋果花藥培養(yǎng)獲得22個(gè)再生株系，同時(shí)證明γ射線輻射后會影響結(jié)果率、果實(shí)大小和種子育性。Zhang等[23]選用SSR標(biāo)記證實(shí)‘紅星’和‘千秋’蘋果花藥培養(yǎng)再生植株來源于花粉。近期的蘋果花藥轉(zhuǎn)錄組測序研究證明多種植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因是影響花藥胚性潛能的關(guān)鍵因子[24]。在花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)形成胚狀體的細(xì)胞學(xué)研究方面，馮麗云等[25]證明改良脫水流程能強(qiáng)化胚發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】蘋果‘嘎啦’（橘紅×金冠）是當(dāng)今全球最重要的蘋果栽培主流品種之一。但‘嘎啦’蘋果的花藥離體培養(yǎng)未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】當(dāng)前限制蘋果育種的關(guān)鍵因子之一就是缺乏優(yōu)良性狀基因，比如抗逆、抗病的純合親本材料。本研究旨在以優(yōu)良雜合體‘嘎啦’為試驗(yàn)對象，采用花藥單倍體培養(yǎng)獲得一批再生株系純合體，通過流式細(xì)胞儀分析染色體，繼而應(yīng)用蘋果SSR標(biāo)記鑒定基因型，建立SSR標(biāo)記的再生植株基因型鑒定體系，從而創(chuàng)制新的蘋果育種種質(zhì)資源，為后期的蘋果育種包括田間性狀篩選、雜交提供豐富的育種材料。

1 材料與方法

1.1 花藥離體培養(yǎng)

2013—2015年每年4月初，采取山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所蘋果圃的‘嘎啦’蘋果未開放的花蕾（此時(shí)花藥多處于單核晚期到雙核早期[23]）?；ɡ俳?jīng)4℃低溫預(yù)處理26—32 d，用75%酒精消毒（振蕩漂洗）30 s，后用無菌水沖洗3—4次，再用0.5%的次氯酸溶液滅菌8 min，無菌水沖洗3—4次，放置于已滅菌的濾紙上待接種。剝?nèi)』ㄋ幇?0個(gè)/皿的密度接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基（N6培養(yǎng)基，附加2.0—3.0 mg·L-16-BA和0—0.15 mg·L-1NAA），25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚狀體形成，轉(zhuǎn)移胚狀體至分化培養(yǎng)基，后經(jīng)繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、馴化、室內(nèi)移栽獲得再生植株。

1.2 染色體倍性分析

取再生植株葉片在500 μL裂解液中用刀片切碎，靜置2 min后過濾于EP管中，PI染色后用BD Accuri C5 流式細(xì)胞儀分析葉片中的DNA含量。以莖尖培養(yǎng)獲得的雜合二倍體‘嘎啦’試管苗葉片為倍性鑒定的參考標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 基因組DNA的提取

采用改良CTAB法提取葉片總DNA[26]，經(jīng)核酸蛋白儀（Bio-Rad）檢測DNA濃度，再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質(zhì)量。

1.4 SSR標(biāo)記篩選

從蘋果HIDRAS數(shù)據(jù)庫（http://www.hidras. unimi.it/）選定位于17個(gè)連鎖群（Linkage Group，LG）的80個(gè)SSR標(biāo)記，相應(yīng)引物由華大基因合成。以雜合體‘嘎啦’葉片和再生株系葉片的DNA為擴(kuò)增模板，使用80對SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為15 μL，含dNTP mixture（2.5 mmol·L-1）1.2 μL、正向引物和反向引物（10 μmol·L-1）各1.5 μL、10×PCR Buffer（Mg2+）1.5 μL、rTaq酶（5 U·μL-1）0.15 μL、DNA 模板50 ng。PCR儀（Eppendorf AG 22331 Hamburg, Germany）反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性150 s；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸4 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入7.5 μL（2﹕1）的上樣緩沖液，在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上電泳100 min（150 A）左右，銀染檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，篩選擴(kuò)增穩(wěn)定、帶型清晰、可區(qū)分雜合親本與純合再生株系的SSR標(biāo)記。

1.5 再生株系的基因型鑒定

對篩選得到引物的5′端TAM、FAM、HEX熒光標(biāo)記，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，含dNTP mixture（10 mmol·L-1）0.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、25 mmol·L-1MgCl22.0 μL、rTaq酶（5 U·μL-1）0.2 μL、DNA模板（100 ng·μL-1）1 μL、ddH2O 17.8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊?5℃預(yù)變性3 min；第二步94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個(gè)循環(huán)；第三步95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)；第四步72℃充分延伸6 min，4℃保存。反應(yīng)板每孔先加入9.9 μL去離子甲酰胺和0.1 μL ROX500或LIZ500分子量內(nèi)標(biāo)，再吸取50 pg擴(kuò)增產(chǎn)物加入樣品孔中。98℃變性5 min，急速冷卻，放置于ABI 3730XL DNA分析儀上。使用Gene Mapper軟件分析擴(kuò)增片段峰型并讀取相應(yīng)數(shù)據(jù)。

1.6 再生株系植物學(xué)觀察

以‘嘎啦’供體（雜合二倍體）為對照，對胚狀體分化出再生苗后繼代培養(yǎng)60 d的再生株系進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征（包括株高、葉形、葉數(shù)、葉長寬比）觀察和統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 ‘嘎啦’花藥培養(yǎng)再生植株獲得

共接種74 200個(gè)‘嘎啦’花藥。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，未被污染的花藥數(shù)55 143個(gè)（未污染率74.3%），誘導(dǎo)形成386個(gè)胚狀體（胚狀體誘導(dǎo)率0.7%，圖1-A），經(jīng)過胚狀體經(jīng)分化培養(yǎng)后共獲得64株再生苗（植株再生率16.6%，圖1-B），之后經(jīng)生根培養(yǎng)（圖1-C）、室內(nèi)移栽，最終獲得30個(gè)花藥培養(yǎng)再生株系（圖1-D）。

圖1 ‘嘎啦’花藥培養(yǎng)再生株系

2.2 再生株系倍性分析

采用流式細(xì)胞儀對成活再生株系進(jìn)行染色體倍性鑒定。以雜合二倍體‘嘎啦’供體（圖2-A）為對照，結(jié)果表明，再生株系呈現(xiàn)3種不同的倍性，其中株系Gala 17為單倍體（圖2-B），Gala 22株系為四倍體（圖2-C）外，其余28個(gè)再生株系包括Gala 5（圖2-D）均為二倍體。

2.3 SSR標(biāo)記分析

為了鑒別再生株系是純合還是雜合體，首先對選自蘋果SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)庫（HIDRAS）的80個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行篩選。用每一個(gè)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后根據(jù)擴(kuò)增條帶鑒別染色體來源。結(jié)果顯示，80個(gè)SSR標(biāo)記中有20個(gè)可區(qū)分純合體/雜合體，擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定，擴(kuò)增片段長度在100—300 bp。如圖3（Hi12c02（LG1）標(biāo)記）聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果所示，‘嘎啦’雜合供體呈現(xiàn)2條PCR擴(kuò)增帶（170 bp和190 bp），而30個(gè)再生株系均只顯示其中1條帶，13個(gè)株系顯示170 bp，其余17個(gè)株系為190 bp。20個(gè)標(biāo)記如表1所示：LG4、LG9、LG14均篩得兩個(gè)標(biāo)記，其余連鎖群各有一個(gè)標(biāo)記。

圖2 流式細(xì)胞儀對再生植株倍性分析

圖3 Hi12c02（LG1）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在PAGE的電泳圖結(jié)果

2.4 再生植株基因型鑒定

進(jìn)一步從LG4、LG9、LG14中各選擇一個(gè)帶型清晰的標(biāo)記，與其余13個(gè)標(biāo)記（另外13個(gè)連鎖群）共17個(gè)SSR標(biāo)記，利用熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)鑒定PCR產(chǎn)物。圖4（Hi12c02（LG1）標(biāo)記）可見，‘嘎啦’雜合供體呈現(xiàn)176 bp和189 bp峰值，而純合再生株系則只有其中一個(gè)峰值，其中13個(gè)再生株系呈現(xiàn)峰值176 bp，另外17個(gè)則呈現(xiàn)189 bp峰值，其他16個(gè)連鎖群上的16個(gè)SSR標(biāo)記也同樣顯示雜合體為兩個(gè)峰，而再生株系只有其中的一個(gè)峰。此結(jié)果與上述聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果一致。證明，再生株系除單倍體gala17外，所獲其他29個(gè)再生株系均為純合基因型植株。

表1 蘋果HIDRAS數(shù)據(jù)庫SSR 標(biāo)記

雖然一個(gè)SSR能鑒別雜合體或純合體，但是不足以鑒定純系間的基因型。因此采用一組SSR標(biāo)記來鑒定基因型。從20個(gè)SSR選出的17個(gè)SSR（每個(gè)連鎖群一個(gè)），利用熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)用來鑒別植株的基因型。如表2所示，根據(jù)不同的產(chǎn)物大小組合，這17個(gè)SSR譜（組合）完全可以把所有30個(gè)植株鑒別。比如Gala03基因型可以用SSR擴(kuò)增條帶176 bp-176 bp-128 bp-153 bp-221 bp-193 bp-286 bp-112 bp-196 bp-124 bp-151 bp-134 bp-142 bp-158 bp-143 bp-149 bp-237 bp序列來表示，相當(dāng)于植株的條形碼。這種SSR 產(chǎn)物序列可以用于獲得的‘嘎啦’花藥植株純合體種質(zhì)資源鑒定，同時(shí)也是一種分子育種標(biāo)記物。另外，發(fā)現(xiàn)部分株系在部分位點(diǎn)上存在變異：即未擴(kuò)增出條帶，或大小與親本不一致。比如Gala01（189 bp-140 bp-119 bp-159 bp-175 bp-193 bp-286 bp-112 bp-196 bp-177 bp-0-149 bp-142 bp-141 bp-143 bp-130 bp-244 bp）在LG10未擴(kuò)增出條帶（用‘0’表示），Gala02、Gala14同在LG10未擴(kuò)增條帶；Gala07（176 bp-140 bp-119 bp-159 bp-221 bp-193 bp-238 bp-120 bp-196/229 bp-124 bp-141 bp-134 bp-142 bp-141 bp-143 bp-149 bp-244 bp）在LG9擴(kuò)增異常。上述篩出的17個(gè)SSR標(biāo)記譜（組合）能同時(shí)區(qū)分鑒定每個(gè)純合植株的基因型，30個(gè)再生株系均為不同基因型的蘋果新種質(zhì)。這些SSR標(biāo)記（每個(gè)連鎖群一個(gè)SSR標(biāo)記）為后期田間嫁接育種種質(zhì)資源來源及新的‘嘎啦’蘋果純合基因型種質(zhì)的鑒定提供了依據(jù)。

2.5 再生株系形態(tài)學(xué)觀察

表3結(jié)果顯示‘嘎啦’雜合供體株高為5.67 cm（n=1），純合二倍體平均株高2.96 cm（n=28），比純合四倍體為1.90 cm（n=1）和單倍體為2.53 cm（n=1）略高。同時(shí)也觀察到純合二倍體長勢相對于嘎啦雜合供體較弱。不同二倍體純合植株的植物學(xué)特征也存在差異，如圖5所示，Gala05植株相對較高，葉基變寬，葉尖漸尖；Gala07葉片變小、變厚，葉柄變短且基部寬大，葉色深且有很強(qiáng)的光澤度；Gala18葉片較小，葉數(shù)較多。

橫坐標(biāo)：擴(kuò)增片段大小；縱坐標(biāo)：熒光信號強(qiáng)度。G：‘嘎啦’供體；1-30：‘嘎啦’花藥再生株系

the abscissa indicates the sizes of amplified fragment and the ordinate shows the intensity of fluorescence signal. G: ‘Gala’ Heterozygote; 1-30: Regenarated plantlets of ‘Gala’ by anther culture

圖4 Hi12c02（LG1）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳熒光檢測法檢測結(jié)果

Fig. 4 Hi12c02（LG1） PCR fragment detected by capillary electrophoresis with fluorescence detection

表2 ‘嘎啦’花藥再生植株SSR標(biāo)記鑒定

表3 再生株系形態(tài)學(xué)觀察

圖5 嘎啦花藥培養(yǎng)再生植株的形態(tài)學(xué)觀察

3 討論

本研究的主要目的是通過花藥培養(yǎng)獲得純合體再生植株豐富蘋果育種親本材料。蘋果單倍體育種技術(shù)，尤其用花藥離體培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體形成純合基因型再生植株的研究仍存在較多問題。在技術(shù)上，采用了先前優(yōu)化的花藥培養(yǎng)種技術(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，‘嘎啦’花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率以及再生植株率都比較低。根據(jù)前人研究，花藥培養(yǎng)研究低胚誘導(dǎo)率和植株再生率受到供體基因型、取樣時(shí)間、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件（如光照、溫度等）等多種因素影響[27-28]。其中供體基因型是最重要的影響因子[29]。就培養(yǎng)條件而言，H?fer等[30]則證明花藥先于27℃暗培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后轉(zhuǎn)入23℃正常光下培養(yǎng)能提高蘋果胚誘導(dǎo)率。此外，低溫預(yù)處理可有效提高胚誘導(dǎo)率[31]。本研究采用的是前期優(yōu)化后的培養(yǎng)條件，包括在胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6附加L6-BA、NAA和活性炭等成分[22]。

一般來說在花藥離體培養(yǎng)過程中，尤其是在愈傷組織誘導(dǎo)階段，再生植株染色體倍數(shù)可能發(fā)生變化[32]，導(dǎo)致花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)形成的再生植株呈現(xiàn)單倍體、二倍體、多倍體和混倍體[33]。本研究的倍性分析結(jié)果和前人的研告類似。在獲得的30個(gè)花藥培養(yǎng)再生株系，結(jié)果顯示有單倍體、二倍體、四倍體，其中28株為純合二倍體株系（93.3%）。二倍體和四倍體再生株系經(jīng)過SSR鑒定均是單倍體自然加倍得到的純合株系，這些二倍體的純合株系可能由于單倍體細(xì)胞發(fā)生了核融合或核內(nèi)加倍[34]。這種倍性多樣性與H?fer等[29]的研究相同。

單倍體育種是獲得優(yōu)勢親本供體材料的最有效方法之一。花藥的花藥壁是雜合體細(xì)胞，同時(shí)也可能誘導(dǎo)成雜合二倍體的再生植株，所以獲得的二倍體植株并非一定為純合體。通過鑒定再生植株的等位基因就可以把花藥培養(yǎng)再生植株的雜合二倍體和純合二倍體區(qū)分開。以前的技術(shù)包括同工酶標(biāo)記[35]、S等位基因[36]及SSR分子標(biāo)記[18,20,23,27]都曾被應(yīng)用于花藥再生植株的純合性鑒定。本研究也采用了SSR鑒定方法。首先選用的80個(gè)SSR標(biāo)記（來自HISDAS）對所有的再生植株進(jìn)行PCR，篩出20個(gè)可區(qū)分再生植株為純合的SSR標(biāo)記。為了進(jìn)一步區(qū)分再生植株的基因型，又篩選出分布于蘋果17個(gè)連鎖群的17個(gè)SSR標(biāo)記。這17個(gè)SSR標(biāo)記能明確標(biāo)記‘嘎啦’蘋果不同的植株，為今后進(jìn)行‘嘎啦’蘋果的基因型鑒定提供了技術(shù)指標(biāo)。目前選出的SSR標(biāo)記是低密度的SSR標(biāo)記手段，這些低密度的SSR不能完全應(yīng)用到所有‘嘎啦’蘋果的后代植株，因此在鑒定30個(gè)‘嘎啦’蘋果花藥培養(yǎng)再生株系時(shí)出現(xiàn)了個(gè)別株系沒有條帶的現(xiàn)象，今后可能會獲得一些新的植株，還需要增加新的不同SSR標(biāo)記來鑒定這些株系的來源，這也是SSR標(biāo)記的一個(gè)普遍技術(shù)局限性。隨著高通量測序技術(shù)的普及，全基因組測序的成本降低，進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)的測序開發(fā)SNP標(biāo)記是替代SSR標(biāo)記的必然趨勢，近年來，一種更加快速、簡易和低成本的基因分型技術(shù)GBS（Genotyping-by- Sequencing）能有效的開發(fā)大規(guī)模的SNP標(biāo)記[37]，結(jié)合現(xiàn)有的SSR技術(shù)可以在全基因組范圍內(nèi)快速挖掘‘嘎啦’蘋果的基因資源。

研究表明，花藥再生植株的植物學(xué)特征呈現(xiàn)多樣化。單倍體育種所獲純合植株雖然失去了雜種優(yōu)勢，出現(xiàn)不同程度返祖現(xiàn)象，其價(jià)值在于可作為遺傳研究的基礎(chǔ)材料，后代雜交種也許會表現(xiàn)出更強(qiáng)的雜種優(yōu)勢。而純合二倍體之間的差異源于花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)（在不發(fā)生交換的情況下）非同源染色體（非等位基因）自由組合，應(yīng)有217個(gè)基因重組類型，加之培養(yǎng)過程中可能誘導(dǎo)基因突變，使花藥培養(yǎng)后代的表型差異顯著，遺傳變異類型較常規(guī)雜交后代更豐富[2]。再生植株的植物學(xué)特征也應(yīng)證了這些發(fā)現(xiàn)。對花藥培養(yǎng)試管苗的葉形、株高、葉長、葉寬等的評價(jià)結(jié)果顯示，不同倍性的再生植株差異顯著；即使同為純合二倍體再生植株，其植物學(xué)性狀也有差異。通常來看雜合供體的生長優(yōu)于單倍體以及其他倍性植株[38]。從育種和生產(chǎn)實(shí)踐而言，蘋果以二倍體和三倍體的生長勢最強(qiáng)。對再生植株組培苗的植物學(xué)觀察同樣發(fā)現(xiàn)，無論是純合二倍體或者其他倍性植株長勢均弱于雜合供體植株，這是因?yàn)閱适Я穗s種優(yōu)勢。當(dāng)然，觀察的是組培苗，植株育性有待于后期進(jìn)一步觀察。

4 結(jié)論

獲得了30個(gè)‘嘎啦’花藥再生株系并用SSR標(biāo)記對每個(gè)植株進(jìn)行了基因型鑒定，早期的植物學(xué)觀察顯示再生株系株高、葉長、葉寬等呈現(xiàn)多樣性。鑒于蘋果基因型高度雜合，生長周期長，蘋果花藥培養(yǎng)植株獲得率極低，獲得的再生株系以及SSR鑒定體系對分析鑒定‘嘎啦’優(yōu)良性狀基因研究，田間嫁接、雜交育種，以及表型-基因型關(guān)聯(lián)分析具有重要意義。

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（責(zé)任編輯趙伶俐）

Regeneration of New Germplasms Using Anther Culture of Apple Cultivar ‘Gala’

WEN Xin1, DENG Shu3, ZHANG ChunFen3, HOU LiYuan2, SHI JiangPeng1, NIE YuanJun4, XIAO Rong3, QIN YongJun2, CAO QiuFen2

(1College of Biological Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006;2Biotechnology Research Center, Shanxi Academy of Agriculture Sciences, Taiyuan 030031;3Shanxi Academy of Agricultural Sciences Pomology Institute, Taigu030815, Shanxi;4Agricultural resource and Economic Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031)

【Objective】Anther culture is one of the most effective techniques to create new germplasms in modern breeding. Apple is one of the most highly genetically heterozygous and self-incompatible fruit tree. Among the current major apple germplasms, ‘Gala’ cultivar shows traits of early maturity, high yield and enhanced anti-biotic stress, thus is a very important genetic resource for apple breeding programs. Haploid breeding has already been employed to regenerate new germplasm in apple breeding research. In this study, the plantlets were regenerated through embryogenesis during “gala” cultivar anther culture lines to enrich parental apple breeding germplasms. 【Method】The anther culture was used to regenerate gala plants. The ploidy level of regenerated plantlets was determined using flow-cytometry. Subsequently, using selected SSR (HIDRAS) markers, the genotypes of regenerated lines were characterized by gel electrophoresis as well as fluorescent capillary electrophoresis. The anther of ‘Gala’ cultivar collected at early stage were firstly treated at low temperature and then culturedthrough embryos induction and differentiation phases and the regenerated plantlets were obtained. The ploidy levels of regenerated plants were analyzed using FACS flow cytometry. To identify the genotype of the plantlets, the DNA was isolated from leaves and then subjected to PCR amplification based on 80 SSR primers selected from the apple HIDRAS database. The homozygous genotypes were determined using both gel electrophoresis and fluorescence capillary electrophoresis. After transplantation, the morphological characteristics of each regenerated plantlet were analyzed.【Result】In the past 3 years, by using the previously optimized anther culture technology, a total of 74 200 ‘Gala’ anthers were inoculated with embryo induction of 0.7% (contaminated anthers over 50 000), resulted in 386 embryos. With differentiation culture, 64 regenerated plantlets survived with regeneration rate of 16.6%. After root induction phase, finally 30 regenerated lines including 28 diploids, 1 haploid and 1 tetraploid were obtained. The PAGE analysis showed that all the regenerated lines were originated from haploid pollen. For genotyping these regenerated plantlets, 17 of 80 SSR markers were further selected (the remaining SSR markers were not polymorphic thus cannot be used for the genotyping) for PCR amplification. Results showed that the panel of 17 SSRs each located in 17 linkage groups, respectively, well distinguished genotypes of the 30 individual regenerated lines. Subsequent morphological observation at the time of 60 days subculture showed that the height of plantlets and morphology of the leaves varied largely. In addition, variations regarding variant ploidy levels were also observed: Gala 5 line was relatively high with wider leaf base, while Gala 7 line showed smaller and thicker leaves and Gala 18 line showed smaller leaves and less amount of leaves. Moreover, diploid plantlets showed a trend of weaker growth than that of the parental ‘Gala’ but stronger than that of haploid and homozygous tetraploid.【Conclusions】By using the technique of anther culture, a set of apple germplasm was successfully obtained and a SSR marker identification system was established. More importantly, the regenerated lines have greatly enriched the apple germplasms and will lay a foundation for apple haploid breeding.

Gala; anther culture; haploid breeding; SSR markers; homogeneous genotype

2017-01-12；接受日期：2017-03-10

國家自然科學(xué)基金（31372033）、國家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2012 FY110100-5）、山西省青年科技研究基金（201502115，201601D202068）、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（2016zyzx35）

溫鑫，E-mail：18234061314@163.com。通信作者曹秋芬，E-mail：qiufengcao@163.com