楊國輝， 張景濤， 陳禮仙

(大理大學農(nóng)學與生物科學學院，云南大理671003)

?

氧化樂果對紅瘰疣螈胚胎及蝌蚪生長發(fā)育的影響

楊國輝， 張景濤， 陳禮仙

(大理大學農(nóng)學與生物科學學院，云南大理671003)

本文研究了氧化樂果對紅瘰疣螈Tylototritonshanjing胚胎及蝌蚪生長發(fā)育的影響。結(jié)果表明，氧化樂果對紅瘰疣螈胚胎發(fā)育過程中的出膜期和開口期毒性較大，其余各期毒性較小。隨著氧化樂果濃度的增大，紅瘰疣螈的畸形率和死亡率逐漸增大。gosner22期蝌蚪的安全濃度是0.05 mg·L-1。在安全濃度內(nèi)，0.03 mg·L-1氧化樂果溶液對蝌蚪的生長具有明顯的促進作用，濃度高于0.03 mg·L-1則對蝌蚪的生長發(fā)育有明顯的滯育作用，對其生長的影響主要表現(xiàn)在10 d以后，這與處理時間延長，毒物在蝌蚪體內(nèi)富集有關(guān)。氧化樂果對紅瘰疣螈胚胎及蝌蚪生長發(fā)育有顯著的影響和損傷，該研究為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)科學合理使用農(nóng)藥提供了依據(jù)。

氧化樂果；紅瘰疣螈；胚胎期；蝌蚪期；毒性

我國是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國。據(jù)統(tǒng)計，2015年我國農(nóng)藥使用量為92.64萬噸(束放等，2016)。農(nóng)藥能有效控制病蟲害，確保農(nóng)作物增產(chǎn)增收，但不合理的使用會造成生態(tài)環(huán)境污染。目前我國存在農(nóng)藥使用不合理的問題，已經(jīng)造成嚴重的生態(tài)污染，并危及到人類健康(郭晨，2016)。

氧化樂果化學名為O，O-二甲基-S-[2-(甲胺基)-2-氧代乙基]硫代磷酸酯，是一種高效有機磷殺蟲劑，由于價格低，效果好，在國內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用。目前，國內(nèi)外對氧化樂果的研究主要集中在氧化樂果的降解和植物吸收上(潘奇正等，2013；吳虹玥等，2013；Zhangetal.，2014)，對兩棲動物的毒理方面研究不多，僅有Isnas等(2012)就其對湖蛙Ranaridibunda各種組織氧化應激標志物的影響，以及張明旺等(2013)對中華蟾蜍Bufogargarizans蝌蚪進行了氧化樂果的急性毒性研究。

兩棲類具有高滲透性的皮膚和無羊膜的卵，對生活環(huán)境的化學污染物較為敏感，因此可作為環(huán)境監(jiān)測的指示生物。近年來關(guān)于農(nóng)業(yè)污染物對兩棲類的影響已有大量報道，但集中在無尾兩棲類(盧祥云等，2002；周景明等，2006；尹曉輝，2008；張明旺等，2013)。紅瘰疣螈Tylototritonshanjing是分布于我國云南中西部的一種有尾兩棲類，國家Ⅱ級重點保護野生動物(趙爾宓，1998)。本文以紅瘰疣螈為試驗對象，研究了氧化樂果對其胚胎期及蝌蚪期的毒性影響，為更好地保護該物種和合理使用農(nóng)藥提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料2011年5月和2015年6月(由于云南干旱和紅瘰疣螈野外棲息地被破壞，2012—2014年野外未收集到足夠的待繁殖成體，故于2015年才進行補充試驗)，將采自云南大理蒼山國家級自然保護區(qū)的紅瘰疣螈雌雄待繁殖個體帶回本實驗室的水族箱中飼養(yǎng)，室溫19～22 ℃，水族箱底部鋪上適量的沙石，并種植標本采集地的水生植物，放入適量的水、水藻和少量田螺及水蚯蚓，3 d更換一次水。待雌性產(chǎn)卵后，立即收集受精卵，鏡檢，剔除未受精的卵。受精卵一部分直接用于胚胎期毒性試驗，另一部分置于大水槽中正常培養(yǎng)至蝌蚪期用于蝌蚪期毒性試驗。

1.1.2試驗試劑氧化樂果為山東大成農(nóng)藥股份有限公司生產(chǎn)的40%氧化樂果乳油。

1.2方法

胚胎期：參考大田使用的濃度進行預試，找出氧化樂果作用的大致濃度范圍，即出現(xiàn)全部死亡的最低濃度。然后依次設(shè)計30 mg·L-1、15 mg·L-1、8 mg·L-1、4 mg·L-14個濃度梯度。將同一批次的紅瘰疣螈受精卵隨機30粒一組，分別放入盛有供試濃度梯度氧化樂果溶液的培養(yǎng)皿內(nèi)。設(shè)2個平行組和1個對照組，試驗在室內(nèi)進行，水溫22 ℃±0.5 ℃。按胚胎發(fā)育的各個時期(楊國輝等，2011)進行連續(xù)觀察。畸形胚胎表現(xiàn)為腹部膨脹透明、全身皺縮卷曲、脊柱彎曲等，死亡胚胎表現(xiàn)為胚胎停止發(fā)育。試驗過程中記錄畸形數(shù)和死亡數(shù)，死亡胚胎予以剔除，統(tǒng)計平均值。

蝌蚪期：試驗采用剛出膜的蝌蚪，參照無尾兩棲類的gosner分期標準，從后肢芽發(fā)育開始為蝌蚪期，紅瘰疣螈胚胎發(fā)育共22期，試驗蝌蚪即處于gosner22期，此時的蝌蚪前肢芽末端分成三叉，后肢芽出現(xiàn)，色斑增多加深，出膜(趙爾宓，1990；楊國輝等，2011)。預試時，將gosner22期的紅瘰疣螈蝌蚪進行24 h、48 h、72 h和96 h半致死濃度(LC50)測定，水溫22.5～23.5 ℃，pH6.8～7.6，統(tǒng)計染毒個體死亡數(shù)，計算LC50和安全濃度(賈春生，2006)。在安全濃度下設(shè)5個梯度，每20只蝌蚪為一組，置于大水槽內(nèi)，設(shè)2個平行組和1個對照組，每24 h更換一次培養(yǎng)溶液，清理食物殘渣、排泄物和死亡的蝌蚪。蝌蚪體長用生物體視成像系統(tǒng)(NIKON-SMZ1000)測量、記錄，體質(zhì)量是將蝌蚪從染毒溶液中取出放入賽多利斯分析天平(AB204-S)內(nèi)1個盛有10 mL水(22 ℃±0.5 ℃)的培養(yǎng)皿內(nèi)稱量，結(jié)束后再次放置于染毒溶液中。試驗持續(xù)25 d，直至蝌蚪變態(tài)結(jié)束，每5 d測量一次蝌蚪的體長、體質(zhì)量。

1.3統(tǒng)計分析

胚胎期試驗數(shù)據(jù)用Excel和SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析；對試驗前不同濃度組蝌蚪生長指標的差異用單因素方差分析(One-Way ANOVA)及t2檢驗(雙樣本等方差假設(shè))，并對試驗前后蝌蚪體質(zhì)量、體長的增長率進行回歸分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1氧化樂果對紅瘰疣螈胚胎發(fā)育的毒性影響

為便于統(tǒng)計，本文將紅瘰疣螈胚胎發(fā)育的22個時期分為細胞期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、外腮期、開口期及出膜期，各期歷時按60%個體數(shù)均發(fā)育到此時期為標準。試驗發(fā)現(xiàn)，氧化樂果對胚胎發(fā)育的影響主要在開口期和出膜期，其余各期受毒性影響不明顯(圖1，圖2)。

在正常發(fā)育條件下，紅瘰疣螈胚胎很少發(fā)生畸形。本試驗中紅瘰疣螈從囊胚期開始出現(xiàn)畸形，且隨著氧化樂果濃度的增大，畸形率逐漸升高(圖1)?；闻咛ヅc正常胚胎在形態(tài)上有很大差異：神經(jīng)胚期前畸形發(fā)生在胚胎背唇及胚孔附近，主要表現(xiàn)為腹部膨脹呈透明狀，胚體彎曲，全身皺縮卷曲，一段時間后死亡；神經(jīng)胚期后畸形多發(fā)生在胚胎的脊椎部位，主要表現(xiàn)為尾部彎曲，但胚體能繼續(xù)發(fā)育，在蝌蚪早期死亡(圖版Ⅰ)。

自然狀態(tài)下，紅瘰疣螈胚胎的死亡率較低，全部都能正常發(fā)育。試驗結(jié)果顯示，隨著氧化樂果濃度的增大，紅瘰疣螈的死亡率逐漸升高，且呈線性增長(圖2)，出膜期和開口期受毒性影響較大，其余各期影響較小。出膜期后胚胎脫離卵膠膜的保護，農(nóng)藥成分可直接滲透進入正在發(fā)育中的胚胎，導致胚胎畸形和死亡；而開口期后，蝌蚪開始主動吞咽，氧化樂果隨水流進入蝌蚪體內(nèi)，導致死亡率升高。

圖1 不同濃度氧化樂果對紅瘰疣螈胚胎的致畸率Fig. 1 Malformation rate of Tylototriton shanjing embryos exposed to different concentrations of omethoate

圖2 不同濃度氧化樂果對紅瘰疣螈胚胎的致死率Fig. 2 Death rate of Tylototriton shanjing embryos exposed to different concentrations of omethoate

圖版Ⅰ 胚胎畸形： 尾部彎曲(A), 胚胎畸形： 皺縮卷曲(B), 死亡胚胎(C)， 蝌蚪畸形(D)Plate Ⅰ Embryo malformation: tail curved(A), embryo malformation: crimped of embryo(B)， embryonic death(C)， tadpole deformity(D)

2.2氧化樂果對紅瘰疣螈蝌蚪生長的影響

2.2.1氧化樂果染毒24～96h紅瘰疣螈蝌蚪的LC50及安全濃度gosner22期紅瘰疣螈蝌蚪24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為1.62 mg·L-1、0.79 mg·L-1、0.48 mg·L-1、0.61 mg·L-1，安全濃度為0.05 mg·L-1。

2.2.2氧化樂果對紅瘰疣螈蝌蚪生長的影響試驗前，各濃度組中蝌蚪的各項生長指標差異較小，經(jīng)單因素方差分析，其體長、體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學意義(F=1.57，P>0.05；F=1.38，P>0.05)。而試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，0.03 mg·L-1濃度下蝌蚪體質(zhì)量增長量最大，0.05 mg·L-1濃度下蝌蚪體質(zhì)量出現(xiàn)負增長，蝌蚪在不同濃度氧化樂果下體長增長量大小依次是0.03 mg·L-1>0.02 mg·L-1>對照組>0.01 mg·L-1>0.04 mg·L-1>0.05 mg·L-1。在試驗中，氧化樂果濃度在染毒早期(0～10 d)對蝌蚪體長、體質(zhì)量的生長無滯育作用(F=1.44，P>0.05；F=1.29，P>0.05)；當染毒到15 d時，氧化樂果濃度在0～0.02 mg·L-1蝌蚪的體長和體質(zhì)量變化不明顯(F=1.68，P>0.05；F=1.55，P>0.05)，隨著染毒濃度的增加，蝌蚪的體長和體質(zhì)量出現(xiàn)停滯，各濃度染毒組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=2.16，P<0.05；F=3.04，P<0.01)(表1)。

對各生長指標的增長率與氧化樂果濃度作相關(guān)分析，結(jié)果表明，紅瘰疣螈蝌蚪各個生長指標的增長率與氧化樂果濃度呈顯著負相關(guān)(表2)。

表1 氧化樂果對紅瘰疣螈蝌蚪生長的影響Table 1 Effect of omethoate concentration on the growth of Tylototriton shanjing tadpoles

表2 不同濃度氧化樂果對對照組紅瘰疣螈蝌蚪生長指標增長率的相關(guān)關(guān)系Table 2 Correlational relationship between the growth rate of Tylototriton shanjing tadpoles and the concentration of omethoate

3 討論

眾所周知，兩棲類動物人工繁殖快，生長周期短，易于培養(yǎng)和觀察，其胚胎發(fā)育過程對水環(huán)境的化學污染物敏感，作為水體有害物質(zhì)及水質(zhì)監(jiān)測的指示生物被廣泛應用(周景明等，2006)。目前，對兩棲類的毒性影響研究主要集中在無尾兩棲類(李貞等，2010)，有尾兩棲類的毒性影響與無尾兩棲類之間是否存在差異，還有待進一步研究。

3.1紅瘰疣螈發(fā)育過程對氧化樂果耐受差

試驗中紅瘰疣螈蝌蚪安全濃度為0.05 mg·L-1，低于胚胎期處理濃度，這是因為胚胎發(fā)育過程在卵膠膜內(nèi)進行，卵膠膜能有效阻止毒物進入，而蝌蚪期的個體直接浸泡在毒物中，其安全濃度較胚胎期低。與無尾兩棲類相比，紅瘰疣螈蝌蚪期的安全濃度也低于中華蟾蜍(6.5 mg·L-1)(張明旺等，2013)，這可能與紅瘰疣螈長期生活在無污染的山澗中有關(guān)。

3.2氧化樂果對紅瘰疣螈胚胎及蝌蚪的影響

氧化樂果對紅瘰疣螈胚胎具有明顯的致畸、致死作用，影響主要發(fā)生在出膜期和開口期，其余各期受毒性影響不明顯，隨著氧化樂果濃度的升高，紅瘰疣螈胚胎的畸形率和死亡率逐漸升高，這與其他兩棲類研究結(jié)果一致(汪學英等，2001)。

氧化樂果對紅瘰疣螈蝌蚪的生長具有非常顯著的抑制作用，其影響主要表現(xiàn)在10 d以后。隨著氧化樂果濃度增大和處理時間延長，蝌蚪的體質(zhì)量和體長均出現(xiàn)負生長，可能與處理時間延長、毒物在蝌蚪體內(nèi)富集有關(guān)。

在安全濃度內(nèi)，低濃度(0.03 mg·L-1)的氧化樂果對紅瘰疣螈蝌蚪的生長有一定的促進作用，而高濃度(>0.03 mg·L-1)對蝌蚪的生長發(fā)育有明顯的滯育作用。這與中華蟾蜍的毒性實驗(尹曉輝，2008；張明旺等，2013)的研究結(jié)果一致，可能與蝌蚪在低濃度農(nóng)藥下能產(chǎn)生一定的應激反應，加強了抵抗力有關(guān)。

總之，氧化樂果對紅瘰疣螈胚胎具有明顯的致畸、致死作用，濫用氧化樂果農(nóng)藥可能導致紅瘰疣螈生長發(fā)育異常，建議農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中盡量科學合理使用。

郭晨. 2016. 高危農(nóng)藥： 健康和環(huán)境的殺手[J]. 生態(tài)經(jīng)濟， 32(7)： 7-9.

賈春生. 2006. 利用SPSS軟件計算殺蟲劑的LC50[J]. 昆蟲知識， 43(4)： 414-417.

李貞， 李丕鵬， 徐齊艷， 等. 2010. 農(nóng)藥和化肥對無尾兩棲類蝌蚪的毒性效應研究進展[J]. 生態(tài)毒理學報， 5(2)： 287-294.

盧祥云， 陳海波， 韓曜平. 2002. 幾種農(nóng)藥對黑斑蛙胚胎及蝌蚪的毒性[J]. 四川動物， 21(2)： 84-85.

潘奇正， 侯雪， 時佳宏. 2013. 氧化樂果對大鼠體內(nèi)氧化應激和脂代謝水平的影響[J]. 中國老年學雜志， 33(15)： 3695-3697.

束放， 熊延坤， 韓梅. 2016. 2015年我國農(nóng)藥生產(chǎn)與使用概況[J]. 農(nóng)藥科學與管理， 37(7)： 10-14.

汪學英， 盧祥云， 李春梅， 等. 2001. 重金屬離子對黑斑蛙胚胎及蝌蚪的毒性影響[J]. 四川動物， 20(1)： 59-61.

吳虹玥， 張靜恒， 方曉燕. 2013. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用菌中氧化樂果殘留[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學， (3)： 304-306.

楊國輝， 楊自忠， 李孟然， 等. 2011. 紅瘰疣螈胚胎發(fā)育的初步觀察[J]. 生物學通報， 46(8)： 51-52.

尹曉輝. 2008. 幾種農(nóng)藥對中華蟾蜍的生態(tài)毒理效應及分子毒性研究[D]. 上海： 東華大學.

張明旺， 黃憶湄， 席蓉， 等. 2013. 稻瘟靈和樂果對中華蟾蜍蝌蚪的急性毒性實驗研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學學報， 31(1)： 79-82.

趙爾宓. 1998. 中國瀕危動物紅皮書：兩棲類和爬行類[M]. 北京： 科學出版社.

趙爾宓. 1990. 介紹一種蛙類胚胎及蝌蚪發(fā)育的分期[J]. 生物學通報， 39(1)： 13-15.

周景明， 秦占芬， 徐曉白. 2006. 兩棲類動物在環(huán)境毒理學研究中的應用學[J]. 環(huán)境與健康， 23(4)： 369-371.

Isnas M， Yegin E， Celik I. 2012. Effects of omethoate on certain oxidative biomarkers in various tissues of frogs (Ranaridibunda) at acute exposure[J]. Toxicology and Industrial Health， 28(1)： 27-34.

Zhang Y， Ren M， Li J，etal. 2014. Does omethoate have the potential to cause insulin resistance[J]. Environmental Toxicology Pharmacology， 37(1)： 284-290.

ToxicityofOmethoatetoEmbryosandLarvaeofTylototritonshanjing

YANG Guohui， ZHANG Jingtao， CHEN Lixian

(College of Agriculture and Biology Science， Dali University， Dali， Yunnan Province 671003， China)

The toxicity of omethoate to the embryos and larvae ofTylototritonshanjingwas studied by acute toxici test. The results showed that the toxicity of omethoate on theT.shanjingembryos was greater during hatching and mouth open stages than the others. With the increase of the concentration， deformity and mortality of the embryos increased gradually. The safe concentration of omethoate onT.shanjingtadpoles was 0.05 mg·L-1. Within the safe concentration(0.03 mg·L-1)， the growth of tadpoles promoted significantly. The growth of tadpoles would diapause when the concentration was higher than 0.03 mg·L-1. The effect on the tadpoles mainly appeared after 10 days since the omethoate could be concentrated in tadpoles along with time. The study suggested that omethoate had a significant impact on the growth of embryos and larvae ofT.shanjing， and provided a reference to the rational usage of the pesticides.

omethoate；Tylototritonshanjing； embryos period； larvae period； toxicity

2017-01-25接受日期：2017-04-26

中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心；大理大學實驗教學示范中心建設(shè)項目(X-SYZX-3)；云南省教育廳科研項目(2015Y388)

楊國輝(1970—)， 女， 高級實驗師， 碩士， 主要從事動物學研究， E-mail:yanggh727@sina.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20170030

S482.3+3； Q959.5+2

： A

： 1000-7083(2017)04-0431-05