吳越，郝秀靜，李敏

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納米抗體在癌癥治療中的應(yīng)用

吳越，郝秀靜，李敏

寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750021

吳越, 郝秀靜, 李敏. 納米抗體在癌癥治療中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào)，2017, 33(7): 1085–1090.Wu Y, Hao XJ, Li M. Application of nanobody in cancer treatment. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1085–1090.

駱駝科動(dòng)物的體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一種缺失輕鏈的抗體，被稱為重鏈抗體，又叫做nanobody。這種抗體只包含一個(gè)可變區(qū)，具有高親和力、高穩(wěn)定性、強(qiáng)組織穿透性、高效表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有低毒性和低免疫原性等特性，適用于診斷、治療和充當(dāng)多種領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究工具。文中將主要討論nanobody在癌癥治療中的應(yīng)用，為nanobody的進(jìn)一步研發(fā)提供思路。

重鏈抗體，納米抗體，癌癥治療

大約30%正在開發(fā)的藥品都是生物制品，其中大部分都是用于治療炎癥、癌癥和過敏的活性蛋白[1]。在臨床治療和研究過程中單克隆抗體變得不可缺少，但是高昂的生產(chǎn)成本給研究和臨床治療造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。并且，單克隆抗體并不適用于所有領(lǐng)域。首先，單克隆抗體大小在150kDa左右，不能用于腫瘤滲透治療。其次，單克隆抗體具有較強(qiáng)的免疫原性，這會(huì)導(dǎo)致單克隆抗體具有較短的半衰期不利于在治療中的應(yīng)用，也會(huì)使得單克隆抗體在進(jìn)行分子成像檢測(cè)時(shí)具有強(qiáng)烈的背景信號(hào)[2]。單克隆抗體的大部分缺點(diǎn)都是因?yàn)槠漭^大的分子質(zhì)量產(chǎn)生的，人們開始研究如何減少抗體的分子量并改進(jìn)其藥理學(xué) 性質(zhì)[3]。

1 納米抗體

20世紀(jì)90年代初，Hamers等發(fā)現(xiàn)駱駝科動(dòng)物的體內(nèi)有一種不同于免疫球蛋白G (Immunoglobulin G，IgG) 的新型抗體。這是一種缺失輕鏈的抗體，被稱為重鏈抗體(Heavy-chain-only antibodies，HcAbs)。重鏈抗體包含兩個(gè)恒定區(qū) (CH2和CH3)，一個(gè)鉸鏈區(qū)和一個(gè)重鏈可變區(qū) (Variable heavy chain domain，VHH)。VHH抗體又被稱為納米抗體(Nanobody，NB)，它保留了重鏈抗體完整的抗原結(jié)合能力[4]。

Nanobody由4個(gè)保守序列和3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)組成(Complementarity-determining region，CDR)[5]，其中CDR3比傳統(tǒng)抗體更長(zhǎng)，并且可以形成凸環(huán)結(jié)構(gòu)，使得抗體可以更容易與抗原結(jié)合。此外，由于nanobody具有獨(dú)特的理化性質(zhì)，所以在高壓或酸性等極端條件下依然可以維持活性[6–7]。nanobody的分子量只有15 kDa，因此適用于多種給藥途徑可以快速擴(kuò)散至全身，并且具有良好的組織穿透能力[8]。而nanobody基因序列與人VH基因家族3序列具有高度同源性[9]，所以在人體內(nèi)并不具有免疫原性適用于慢性病的治療。

Nanobody的編碼基因由360個(gè)左右的堿基對(duì)組成，使得nanobody易與一些小分子或者藥物前體以共價(jià)鍵的形式相連，并且可以使用細(xì)菌或者酵母菌大量生產(chǎn)。改造后的nanobody將有不同的抗原表位或作用機(jī)制，可以構(gòu)成具有高親和力的多價(jià)分子[10]，被科研工作者廣泛接受并視作臨床研究及相關(guān)研究的重要工具。

2 Nanobody與癌癥治療

現(xiàn)在市場(chǎng)上針對(duì)癌癥治療的單克隆抗體可以通過識(shí)別癌癥的相關(guān)抗原治療癌癥[11]。但是分子體積較大的單克隆抗體很難滲透腫瘤并與靶標(biāo)結(jié)合[12]。而與單克隆抗體相比，nanobody在腫瘤組織中可以均勻滲透[13]。近些年的研究多是圍繞用放射性同位素、效應(yīng)分子或者抗癌藥物分子標(biāo)記連接nanobody靶基因，使得抗癌藥物和效應(yīng)分子可以直接作用于特定的腫瘤細(xì)胞[14]。

2.1 Nanobody與效應(yīng)分子

因?yàn)閚anobody沒有Fc片段，所以nanobody可以作為一種運(yùn)輸貨物的工具來使用，比如將藥物或者大分子物質(zhì)運(yùn)輸?shù)侥[瘤細(xì)胞或者其他靶細(xì)胞內(nèi)。這樣可以使抗癌藥物在需要治療的部位富集以提高藥物的效果，并且可以減少藥物給全身其他部位帶來的不良反應(yīng)。同時(shí)nanobody與這些效應(yīng)分子連接形成的復(fù)合物將具有特異性的治療效果和對(duì)腫瘤組織的滲透能力。例如，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2 (VEGFR2) 與假單胞菌外毒素A共軛復(fù)合物和主要組織相容性復(fù)合體(MHC-Ⅱ)[15]與小分子微管抑制劑 (DMⅠ) 共軛復(fù)合物[16]都可以讓nanobody運(yùn)輸至腫瘤部位有效地發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。同樣，用帶有編碼二價(jià)的抗表皮生長(zhǎng)因子受體 (Anti-EGFR) 和TRAIL細(xì)胞毒素重組蛋白的質(zhì)粒的慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSC)，可以獲得對(duì)腫瘤細(xì)胞有高度靶向性的NSC，并且到達(dá)腫瘤部位后NSC可以釋放Nb-TRAIL復(fù)合物，以達(dá)到抑制惡性腫瘤侵染的能力[17]。而將可以與腫瘤標(biāo)記物CEA的β內(nèi)酰胺酶偶聯(lián)的nanobody與一種抗癌藥物前體共軛，nanobody可以準(zhǔn)確地將藥物帶到可以表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞表面，使得藥物可以準(zhǔn)確作用于腫瘤細(xì)胞[18]。

2.2 Nanobody與藥物傳遞系統(tǒng)

采用化學(xué)的方法將nanobody與藥物傳遞分子結(jié)合起來，就可以利用nanobody的特異性將被密封包裹著的藥物傳遞到作用部位。這種方法可以避免普通給藥方式給全身帶來的毒性反應(yīng)，并且可以讓具有疏水性的藥物以親水結(jié)構(gòu)進(jìn)行運(yùn)輸。此外，可以采用這樣的方式進(jìn)行大劑量給藥，從而避免多次給藥產(chǎn)生的免疫原性[15]。同時(shí)，除了運(yùn)載藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞作用以外，nanobody也會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。這種大分子復(fù)合體與普通藥物相比能更長(zhǎng)時(shí)間存在于血液循環(huán)系統(tǒng)中，雖然隨著時(shí)間的延長(zhǎng)效果會(huì)逐漸減弱，但足夠在腫瘤組織中充分?jǐn)U散。

例如，將靶標(biāo)EGFR的nanobody與包裹有胰島素增長(zhǎng)因子R1 (IGF-R1) 激酶抑制劑的脂質(zhì)體結(jié)合，這樣可以得到一個(gè)具有雙重療效的納米制劑，可以同時(shí)抑制EGFR和IGF-R1[19]?；蛘邔anobody與包裹有阿霉素的膠粒偶聯(lián)[20]，可以下調(diào)EGFR并且抑制腫瘤細(xì)胞增殖。而將靶標(biāo)EGFR的nanobody進(jìn)行生物素?；⑴c包裹著鏈霉親和素的膠粒偶聯(lián)，nanobody可以直接帶著藥物到達(dá)表達(dá)EGFR的肝腫瘤細(xì)胞并發(fā)生作用[21]。

運(yùn)用胞外囊泡向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送分子也是一種新興的研究方向。胞外囊泡可以迅速運(yùn)送分子藥物，但是不具有特異靶向性，并且在體內(nèi)會(huì)被快速地清除[22]。將聚乙二醇化的膠團(tuán)與對(duì)EGFR特異性的nanobody共軛復(fù)合物嵌入到胞外囊泡的膜上，就可以使胞外囊泡對(duì)特定細(xì)胞產(chǎn)生靶向性并依然保持胞外囊泡的形態(tài)和生物物理特性[23]。

2.3 Nanobody與放射性核素治療和光動(dòng)力治療

放射免疫療法 (Radioimmunotherapy，RIT)是綜合放射治療和抗體免疫治療的一種治療方法，可以選擇性地破壞癌癥細(xì)胞以達(dá)到微創(chuàng)放射治療。讓被放射性同位素標(biāo)記的抗體識(shí)別并結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上，可以向腫瘤傳遞大量輻射但不會(huì)影響到健康組織以達(dá)到治療的目的。當(dāng)前，只有一種被放射性同位素標(biāo)記的抗CD20的單克隆抗體被美國(guó)食品藥品管理局 (FDA) 允許上市[24]。同樣，該抗體也存在著低滲透力、低靶向性和過長(zhǎng)的半衰期等嚴(yán)重缺陷。相比之下，放射性同位素標(biāo)記的nanobody對(duì)腫瘤組織具有高度特異性，可以最大程度減少對(duì)健康組織的影響[25]。

迪修威特等嘗試構(gòu)建用鎦-177標(biāo)記抗M蛋白的單克隆抗體來治療多發(fā)性骨髓鎦[26]，利用1B4M-DTPA螯合劑將放射性元素鎦-177、化學(xué)反應(yīng)功能基團(tuán)和抗HER2 nanobody結(jié)合起來。這種方法幾乎可以完全抑制腫瘤的生長(zhǎng)，用小鼠進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)治療效果明顯[27]。

光動(dòng)力療法 (Photodynamic therapy，PDT)使用放射性元素和光敏劑殺死癌癥細(xì)胞，被公認(rèn)是一種微創(chuàng)無毒的治療方法。無論是采用光敏劑、單克隆抗體還是nanobody作為靶向物質(zhì)，都被認(rèn)為是一種光免疫療法。將抗EGFR nanobody與光敏劑偶聯(lián)，結(jié)合分子成像技術(shù)進(jìn)行癌癥治療是一種特殊且有效的治療方法[28]。

3 結(jié)論與展望

在1993年，具有免疫功能的重鏈抗體被發(fā)現(xiàn)于駱駝科動(dòng)物體內(nèi)。這種具有獨(dú)特的抗原結(jié)合域的抗體，因其較強(qiáng)的組織滲透力和較快的腎清除率，被證明可以應(yīng)用于腫瘤學(xué)、炎癥反應(yīng)、傳染病學(xué)、分子成像學(xué)等各領(lǐng)域的治療與診斷的研究當(dāng)中。

盡管nanobody在臨床治療方面具有許多優(yōu)勢(shì)，但是有時(shí)候仍需要進(jìn)行一定改進(jìn)才可以使用。比如在神經(jīng)退行性疾病的治療當(dāng)中，胞內(nèi)抗體可以在疾病早期進(jìn)行干預(yù)，但是傳統(tǒng)抗體在具有還原性的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無法正確折疊，而nanobody則可以保持穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)[29]，但是仍需要解決如何遞送nanobody表達(dá)載體的問題。不過因?yàn)閚anobody是由單基因表達(dá)，所以可以通過基因治療研究出細(xì)胞內(nèi)遞送的方法[30]。另外，也可以將HIV Tat蛋白作為穿膜蛋白將nanobody轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞當(dāng)中，或者利用細(xì)菌3型分泌系統(tǒng) (T3SS) 直接將nanobody注射到細(xì)胞當(dāng)中[31]。

在臨床試驗(yàn)中特異性總是越高越好，于是可以通過免疫文庫(kù)的噬菌體展示技術(shù)有效篩選出對(duì)特定抗原具有特異性的抗體，但是不能排除有可能篩選到一價(jià)的親和力較低的抗體的可能，而通過nanobody免疫庫(kù)進(jìn)行篩選則可以避免這個(gè)問題。通過Pain等的研究可以得知，經(jīng)過噬菌體展示篩選獲得的nanobody的親和力要比篩選前的高1.5倍[32]。而通過DNA重組技術(shù)，獲得大量隨機(jī)重組的直系同源的基因片段建立文庫(kù)，可以篩選得到更穩(wěn)定親和力更高的nanobody[33]。然而，建立這樣的nanobody庫(kù)會(huì)消耗更多的時(shí)間及成本。同時(shí)，在抗原有毒性、致死因子或者可傳播、低免疫原性的情況下，免疫并不可行，必須尋找替代方法。比如，使用非免庫(kù)進(jìn)行淘選[34]，或者通過體外核糖體展示技術(shù)獲得的文庫(kù)也可淘選出高親和力的特異性nanobody[35]。除了通過免疫駱駝或駱駝科動(dòng)物獲得nanobody，一些研究小組還研究出通過B細(xì)胞生成正確折疊的nanobody的轉(zhuǎn)基因小鼠[36]。

總之，nanobody性能優(yōu)越，用途廣泛，可以應(yīng)用于診斷、治療和各種實(shí)驗(yàn)，并且還有被進(jìn)一步研發(fā)的潛能。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Application of nanobody in cancer treatment

Yue Wu, Xiujing Hao, and Min Li

Key Laboratory for Conservation and Utilization of Special Biological Resources in the Western China, Ministry of Education, Ningxia University, Yinchuan 750021, Ningxia, China

Camelidae can produce a unique antibody that lacks light chain called variable heavy chain domain, also known as nanobodies. This antibody contains only one variable region, with high affinity, high stability, strong tissue penetration, efficient expression. Besides, their toxicity and immunogenicity are both low to be used for both therapeutic and diagnostic applications, as well as research tools. In this review, we discuss how nanobody has been explored as therapeutics in oncology, and provide ideas for the further development of nanobody.

heavy-chain-only antibodies, nanobodies, oncology

December 23, 2016; Accepted: April 25, 2017

Min Li. Tel: +86-951-2062010; E-mail: lim@nxu.edu.cn

Supported by: Key Technology Research and Development Program of the Ministry of Science and Technology of Ningxia (No. 4130397).

寧夏科技支撐項(xiàng)目 (No. 4130397) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-05-24

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170524.0902.001.html