孫勇，蔣繼宏(江蘇師范大學(xué)省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室，江蘇徐州221116)

一株樺褐孔菌伴生菌的鑒定及對腫瘤細胞的抑制作用

孫勇，蔣繼宏
(江蘇師范大學(xué)省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室，江蘇徐州221116)

為了從藥用真菌伴生菌中挖掘具有開發(fā)前景的活性菌株，通過顯微形態(tài)觀察結(jié)合ITs序列分析，對分離自樺褐孔菌的一株伴生菌進行鑒定，采用細胞四唑鹽(MTT)法測定伴生菌和樺褐孔菌對腫瘤細胞的抑制作用。結(jié)果表明:樺褐孔菌伴生菌為頂枝孢屬的一個種Acremonium sp．，并可能是一個新種;100μg/mL的伴生菌和樺褐孔菌提取物對肺癌細胞NCI-H460的抑制率為47.88%和41.32%，對胃腺癌細胞SGc-7901抑制率分別為42.64%和36.26%，對人肝癌細胞HepG2抑制效果差;而稀釋10倍的伴生菌發(fā)酵液對肺癌細胞NCI-H460和胃腺癌細胞SGc-7901抑制率分別為56.81%和46.63%。

樺褐孔菌;伴生菌;ITs分析;MTT法;抗腫瘤

樺褐孔菌(Inonotus obliquus(Fr．)Pilats)，又名斜生纖孔菌，是一種生長在寒帶的木腐菌，屬于真菌門、擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科和纖孔菌屬［1］。主要分布于北緯45°～50°之間，集中在俄羅斯的西伯利亞和遠東地區(qū)、北歐的波蘭和荷蘭、中國的大小興安嶺和長白山地區(qū)、日本北海道以及北美北部［2］。它的菌核中含有羊毛甾醇型三萜類、樺褐孔菌醇和樺褐孔菌素、黑色素類、葉酸衍生物以及芳香物質(zhì)、木質(zhì)素、栓菌酸和單寧等化學(xué)成分。其中，起主要藥理作用的為羊毛甾醇型三萜類、樺褐孔菌醇、樺褐孔菌素和木質(zhì)素，具有抵抗肝癌、胃癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌和皮膚癌等多種腫瘤細胞，它還具有抗艾滋病病毒、抗感染、治療糖尿病、降血壓、調(diào)節(jié)血脂、抗機體衰老及增強免疫力等藥理作用［3］。

大型真菌組織微環(huán)境微生物十分常見，在共生長中發(fā)揮著一定的功能。如，銀耳必須有伴生菌的存在才能完成其生活史［4］;郭楚燕等［5］發(fā)現(xiàn)裂蓋馬鞍菌子實體內(nèi)部存在的細菌、真菌和放線菌有可能為裂蓋馬鞍菌的伴生菌;純培養(yǎng)的豬苓菌絲不能形成菌核，但其與伴生菌共培養(yǎng)，無論在實驗室培養(yǎng)基上或用樹棒栽培，豬苓菌核形成很快且發(fā)育正常;伴生菌是豬苓菌絲形成菌核的關(guān)鍵生物因子［6］;添加適量的伴生菌菌絲體或未滅菌的發(fā)酵液能提高豬苓菌絲的生物量，提高豬苓菌絲多糖含量［7］;點枝頂孢為四川省分布的黃褐裸蓋傘、糞生裸蓋傘及裸蓋傘205菌株的伴生菌，與其宿主表現(xiàn)為偏利互生關(guān)系，并已經(jīng)達到穩(wěn)定的共進化平衡［8］。

在樺褐孔菌菌種的分離過程中，筆者分離到一株樺褐孔菌菌核伴生菌，能大量產(chǎn)生色素物質(zhì)，對該菌進行常規(guī)的形態(tài)分析和ITs序列分析，對該菌進行鑒定，并采用四唑鹽(MTT)法測定伴生菌發(fā)酵產(chǎn)物對腫瘤細胞的抑制作用，以期為以后的研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及細胞株

樺褐孔菌菌種和伴生菌均分離自東北長白山的野生樺褐孔菌菌核，保藏于江蘇師范大學(xué)省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室。

腫瘤細胞株:人肝癌細胞HepG2、胃腺癌細胞SGc-7901和肺癌細胞NCI-H460，均購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

PD培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL。

RMPI 1640完全培養(yǎng)基:RMPI 1640基本培養(yǎng)基，10%小牛血清，10 000 U青霉素，10 000 U鏈霉素，Na2CO32.0 g，雙蒸水1 000 mL，pH 7.0。

1.3 伴生菌形態(tài)學(xué)鑒定

1.3.1 載玻片培養(yǎng)法培養(yǎng)

在無菌操作臺上將熔化后冷卻至60℃以下的PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，厚度為0.1～0.2 cm。接種鏟在酒精燈火焰上方灼燒滅菌后，在凝固的培養(yǎng)基上劃0.5 cm×0.5 cm的瓊脂培養(yǎng)基小塊，并將其轉(zhuǎn)移至滅菌的載玻片上，將分離的樺褐孔菌伴生菌菌種活化后接種在小塊四角，蓋上無菌蓋玻片，置于保濕培養(yǎng)皿中28℃進行培養(yǎng)2～3 d。

1.3.2 顯微鏡觀察

將培養(yǎng)2 d的玻片取出，放于顯微鏡操作臺上，用針尖輕輕拿起蓋玻片的一側(cè)，慢慢將蓋玻片拿起來，挑掉周圍的培養(yǎng)基，在新的載玻片中央滴一滴甲基藍染液，蓋玻片一側(cè)輕放于液體邊緣，輕輕蓋上玻片，濾紙吸取周圍的液體;調(diào)整顯微鏡，觀察并記錄分生孢子大小、形狀、產(chǎn)孢細胞、厚垣孢子的有無等。根據(jù)Booth分類系統(tǒng)進行分類鑒定。

1.4 rDNA ITs區(qū)的擴增與測序

以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取伴生菌的核DNA，以真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')為引物進行PCR擴增［9］，擴增程序:94℃預(yù)變性10 min，94℃預(yù)變性1 min，55℃退火性1 min，72℃延伸2 min，共25個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認后，送上海生工生物工程有限公司純化測序。

1.5 序列數(shù)據(jù)的處理

將測得的序列在GenBank進行比對，獲得美國生物信息中心(NCBI)網(wǎng)站提供的相似度高的真菌的相關(guān)序列，通過軟件Mega 5.02構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6 MTT法測定伴生菌與樺褐孔菌混合培養(yǎng)抗腫瘤活性

1.6.1 待測菌株的培養(yǎng)和培養(yǎng)獲得物的處理

選用PDA培養(yǎng)基作為測定各菌株樺褐孔菌及其伴生菌抗腫瘤活性的培養(yǎng)基，將活化的菌種轉(zhuǎn)接到含100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中，置于培養(yǎng)箱中25℃恒溫培養(yǎng)，各培養(yǎng)6瓶，樺褐孔菌培養(yǎng)20 d，伴生菌培養(yǎng)15 d，培養(yǎng)好后用真空泵抽濾真菌深層培養(yǎng)物，得到菌絲體和發(fā)酵液，菌絲體置于60℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥，然后稱質(zhì)量，搗碎，最后放入小錐形瓶用體積分數(shù)95%的乙醇浸提7 d，抽濾取上清液，水浴蒸干后即為乙醇提取物粗品，稱質(zhì)量;再將其加1 mL DMSO溶解至5 mg/mL，用0.22μm微孔濾膜過濾后在4℃條件下保存;發(fā)酵液直接用0.22μm微孔濾膜過濾后放在4℃條件下保存。

1.6.2 抗腫瘤活性測定方法

1)細胞培養(yǎng)。用RMPI1640完全培養(yǎng)基在37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肺癌細胞NCIH460等腫瘤細胞。

2)細胞接種。將處于對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰酶從培養(yǎng)瓶上消化下來，1 000 r/min離心5 min，用細胞數(shù)計板計數(shù)，制成2×104個/mL的細胞懸液。96孔板中每孔加100μL RMPI1640培養(yǎng)基，空白對照孔加100μL不含細胞的培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱中過夜，使細胞貼壁。

3)加樣。每孔補加RMPI1640培養(yǎng)基80μL，加20μL處理的發(fā)酵液或菌絲醇提物，即發(fā)酵液的最終濃度為原發(fā)酵液的0.1倍，菌絲醇提物的最終質(zhì)量濃度為100μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

4)Alamar blue方法。Alamar blue貯存液用培養(yǎng)基以1∶1(體積比)比例稀釋，每孔加50μL，每孔終體積為250μL，Alamar blue為10%，5 h后用Synergy 2多功能檢測儀(BioTek公司)檢測。將培養(yǎng)板分別放在530和590 nm的波長下，加入不含細胞的培養(yǎng)基的孔做空白值，加細胞液不加樣品的孔做對照值，細胞培養(yǎng)孔減去空白值為實際值。按照公式計算細胞抑制率:細胞抑制率=(對照-樣品)/對照×100%［10］。

1.7 不同溶劑對伴生菌發(fā)酵液和菌絲體活性物質(zhì)的粗提效果

對樺褐孔菌伴生菌進行大量發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物通過抽濾獲得的菌絲體和發(fā)酵液，菌絲體烘干后磨碎，用不同的有機試劑進行浸提7 d，過濾獲得浸提液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，干燥后測定抗腫瘤活性;發(fā)酵液使用不同溶劑萃取，萃取液濃縮后干燥稱質(zhì)量，再用水或DMSO配成1 mg/mL的溶液。用于測定其對胃腺癌細胞SGc-7901的抑制作用。

2 結(jié)果與討論

2.1 伴生菌的形態(tài)

圖1為樺褐孔菌伴生菌的菌落形態(tài)。由圖1可知:菌落的邊緣菌絲密集，不整齊呈鋸齒狀，呈灰白色;菌落中央為黃綠色，菌絲體平伏致密，產(chǎn)生水溶性墨綠色色素，培養(yǎng)基表面因色素存在而稍有金屬光澤;老熟時，菌落中央漸變?yōu)槟G色，有黑色油滴狀分泌物。

圖1樺褐孔菌伴生菌的菌落Fig.1 Colony of company fungus of Inonotus obliquus

圖2 為樺褐孔菌伴生菌的顯微形態(tài)。由圖2可知:伴生菌孢子的分生孢子梗簡單、細長，很少分枝;分生孢子無色、單胞，集聚在黏液滴中，形似粗棒形至長桶形、光滑;大小為(3.1～6.6)μm× (1.2～2.2)μm，平均長為3.8μm，寬為1.6μm。據(jù)此可將該伴生菌歸為枝頂孢屬(Acremonium)。

圖2 樺褐孔菌伴生菌的分生孢子Fig.2 Conidiopores and conidia of company fungus of Inonotus obliquus

2.2 ITs序列及分析

ITs序列分析結(jié)果見圖3。由圖3可知:樺褐孔菌伴生菌與Cosmospora viridescens的親緣關(guān)系比較近，ITs序列相似性達99%，這表明該伴生菌應(yīng)屬于赤殼屬(Cosmospora);在枝頂孢屬中發(fā)現(xiàn)有性型的菌種多屬于赤殼屬，樺褐孔菌伴生菌暫時未發(fā)現(xiàn)有性階段，故暫歸為枝頂孢屬，其GenBank登錄號為KJ777534.1。

由圖3可知:該伴生菌初步鑒定為枝頂孢屬的一個種(Acremonium sp．)，參照Wang等［11］對中國枝頂孢屬真菌的相關(guān)特性及該屬菌種的描述，沒有發(fā)現(xiàn)完全相同的形態(tài)描述，故不能確定到具體的種，因此，推斷這株菌可能為枝頂孢屬的一個新種;同屬的真菌作為大型真菌的伴生菌也有相關(guān)報道，點枝頂孢霉即為黃褐裸蓋傘(Psilocybe fasciata)、糞生裸蓋傘(P.merdaria)及裸蓋傘的伴生菌。

圖3 基于ITs序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Neighbour-joining phylogenetic tree based on internal transcribed spacer sequence analysis

2.3 樺褐孔菌及其伴生菌的發(fā)酵物對腫瘤細胞的抑制作用

表1為樺褐孔菌及其伴生菌的發(fā)酵物對腫瘤細胞的抑制作用。由表1可知:樺褐孔菌、伴生菌的發(fā)酵液和菌絲體提取物對腫瘤細胞HepG2(人肝癌細胞)的抗腫瘤活性不是很明顯;對細胞HepG2(人肝癌細胞)的抗腫瘤活性按照從大到小的順序依次為伴生菌發(fā)酵液、樺褐孔菌菌絲體提取物、伴生菌提取物和樺褐孔菌發(fā)酵液。樺褐孔菌、伴生菌對人肝癌細胞抑制率差，對肺癌細胞NCI-H460和胃腺癌細胞SGC7901有一定的抑制作用，其中，當(dāng)樺褐孔菌的菌絲體提取物質(zhì)量濃度為100μg/mL時，對兩種腫瘤細胞的抑制率分別為47.88%和42.64%，而發(fā)酵液相對差些，稀釋10倍后對兩腫瘤細胞的抑制率分別為13.54%和17.27%;伴生菌的菌絲體提取物對胃癌細胞NCI-H460和胃腺癌細胞細胞SGC7901的抑制率為41.32%和36.26%，而伴生菌發(fā)酵液的抑制率反而高些，分別為56.81%和46.63%。在研究過程中，筆者發(fā)現(xiàn)該伴生菌的生長速度比樺褐孔菌快得多，且抗腫瘤活性優(yōu)于樺褐孔菌，因此，可以認為更適合于工業(yè)發(fā)酵用于生產(chǎn)抗腫瘤藥物。

表1 樺褐孔菌與伴生菌對腫瘤細胞的抑制作用Table 1 Inhibition of Inonotus obliquus and its companion fungus on tumor cells %

2.4 不同溶劑處理獲得的伴生菌粗提物對腫瘤細胞SGc-7901的抑制作用

考察不同溶劑對伴生菌發(fā)酵液和菌絲體活性物質(zhì)的粗提效果，結(jié)果見表2。

由表2可知:用丙酮提取伴生菌的菌絲體抗腫瘤活性物質(zhì)的效果優(yōu)于其他溶劑，當(dāng)丙酮為溶劑的提取物用量為100μg/mL時，對腫瘤細胞SGc-7901的抑制率為80.95%。而發(fā)酵液中的活性成分在堿性條件下用正丁醇萃取或在酸性條件下用乙酸乙酯萃取，提取物抗腫瘤效果較好，當(dāng)這2種條件下得到的提取物用量為100μg/mL時，腫瘤細胞抑制率分別為88.42%和99.49%，考慮到正丁醇沸點高于乙酸乙酯，和在水中的溶解度高于乙酸乙酯，因此，在后續(xù)的研究中將以在酸性條件下使用乙酸乙酯萃取濃縮發(fā)酵液中的活性物質(zhì)來進一步研究這些活性成分的結(jié)構(gòu)和功能等。

表2 不同萃取條件下的伴生菌的活性成分對腫瘤細胞SGc-7901的抑制率Table 2 Inhibition of the companion fungus extract components by different solvent on tumor cell SGc-7901

3 結(jié)論

1)通過形態(tài)觀察和ITs序列測定，樺褐孔菌伴生菌初步鑒定為頂孢霉屬的一個種(Acremonium sp．)。

2)伴生菌發(fā)酵液和菌絲體提取物具有與樺褐孔菌相似的抗腫瘤活性，對腫瘤細胞的抑制率稍優(yōu)于樺褐孔菌。

3)對伴生菌發(fā)酵液和菌絲體提取物中抗腫瘤有效成分進行初步分離，丙酮是提取伴生菌菌絲體抗腫瘤成分的最佳試劑;則在酸性條件下(pH=4)，使用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液抗腫瘤活性物質(zhì)，其效果較好。

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(責(zé)任編輯荀志金)

Identification of a strain of companion fungus of Inonotus obliquus and its activity againsttumor cell

SUN Yong，JIANG Jihong
(Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant of Jiangsu Province，Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116，China)

In order to screen active strains from medicinal fungi，we used microscopic morphology and internal transcribed spacer(ITs)sequence analysis to classify the companion fungus separated from Inonotus obliquus，and studied the inhibition of the companion fungus and Inonotus obliquus fermentation on tumor cells by the 3-［4，5-dimethylthiazol-2-yl］-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)colorimetric assay．The companion fungus is Acremonium sp．，and may be a new species．The extract of the companion fungus and Inonotus obliquus could inhibited 47.88%and 41.32%NC2-H460 cells，42.64%and 36.26% gastric adenocarcinoma cells SGC-7901，respectively．However，the extract of the companion fungus and Inonotus obliquus inhibited hardly human hepatoma cell HepG2．When the broth of the companion fungus was 10 times diluted，it inhibited 56.81%NCI-H460 cells and 46.63%SGc-7901 cells．

Inonotus obliquus;companion fungus;ITs sequence analysis;MTT method;antitumor

Q939.9

A

1672－3678(2017)04－0082－05

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.014

2017－02－28

江蘇師范大學(xué)省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室開放課題(KLBMP1305)

孫勇(1977—)，男，江西高安人，講師，研究方向:微生物學(xué);蔣繼宏(聯(lián)系人)，教授，E-mail:jhjiang@jsnu．edu．cn