余維麗，鹿中華，楊翔，鄭瑤，孫昀(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，安徽合肥230601)

肺炎鏈球菌Spr0982的表達(dá)純化及保守性分析

余維麗，鹿中華，楊翔，鄭瑤，孫昀
(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，安徽合肥230601)

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖基轉(zhuǎn)移酶是與其耐藥性或致病性相關(guān)的基因。本文以S．pneumoniae R6菌株基因組為模板，利用PCR克隆S．pneumoniae中的糖基轉(zhuǎn)移酶(spr0982)基因，構(gòu)建重組p28 (PET28b改造的克隆載體)-Spr0982載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21-Ril中，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化條件的研究。采用ClustalW在線工具對(duì)Spr0982蛋白在不同肺炎鏈球菌菌株中的保守性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示: p28-Spr0982重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后于BL21-Ril菌株中獲得大量以包涵體形式存在的目的蛋白質(zhì);通過(guò)QFF陽(yáng)離子交換柱和分子篩層析獲得較純的可溶目的蛋白;Spr0982蛋白在不同肺炎鏈球菌中的保守程度高達(dá)99.3%。本研究對(duì)于理解S．pneumoniae的致病性和耐藥機(jī)理研究具有指導(dǎo)意義。

肺炎鏈球菌;Spr0982蛋白;重組表達(dá);保守性;耐藥性

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，是一種對(duì)人類有巨大危害的病原微生物。通常定殖在人的鼻腔中，可以擴(kuò)散至中耳、肺部或者侵入上皮細(xì)胞，進(jìn)入血腦屏障，可引起局部及全身的感染，從而使宿主患上如敗血癥、肺炎、腦膜炎、鼻竇炎、中耳炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等多種疾?。?］?？股氐臑E用加劇了肺炎鏈球菌的耐藥性，尤其對(duì)作用于細(xì)胞壁的β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率逐漸上升。因此，對(duì)于肺炎鏈球菌耐藥性相關(guān)基因的研究也是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

Laible等［2］和Helassa等［3］的研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌的青霉素耐藥性主要是由于β-內(nèi)酰胺類抗生素的靶蛋白的改變，如青霉素結(jié)合蛋白PBP發(fā)生了突變。Hakenbeck等［4］的研究表明，在耐藥肺炎鏈球菌株中除了PBP蛋白的突變外，一些其他的非青霉素結(jié)合蛋白也發(fā)生了突變，也參與β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物的耐藥。一些糖基轉(zhuǎn)移酶的基因突變與肺炎鏈球菌耐藥相關(guān)，如糖基轉(zhuǎn)移酶基因cpo A。在兩株耐哌拉西林的肺炎鏈球菌P106和P104中，發(fā)現(xiàn)了cpo A基因的突變，cpo A的突變降低了肺炎鏈球菌對(duì)哌拉西林的敏感性［5］。

基因spr0982編碼肺炎鏈球菌R6中的一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，與cpo A及其他3個(gè)基因位于一個(gè)操縱子上?；騭pr0982位于cpo A基因的下游，編碼一個(gè)441個(gè)氨基酸的糖基轉(zhuǎn)移酶，屬于GT1-YagM類似家族，通常這個(gè)家族的成員通過(guò)疏水相互作用和電荷作用來(lái)錨定膜-細(xì)胞質(zhì)界面［6－7］，并且將一個(gè)糖單元轉(zhuǎn)移到膜內(nèi)側(cè)的受體分子上。Spr0982催化轉(zhuǎn)移UDP-葡萄糖中的一個(gè)葡糖基至甘油二酯(DAG)上，形成α-單糖甘油二酯(GlcDAG)。而基因cpo A編碼肺炎鏈球菌R6中的另一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，催化轉(zhuǎn)移UDP-半乳糖中的一個(gè)半乳糖基至GlcDAG上，形成α-半乳糖基葡糖基甘油二酯(GalGlcDAG)。體外實(shí)驗(yàn)也證明了Spr0982和CpoA參與糖脂的合成，分別起到GlcDAG合成酶和GalGlcDAG合成酶的作用［6－7］。GlcDAG是肺炎鏈球菌脂磷壁酸的脂錨點(diǎn)，能維持特定的陰離子脂質(zhì)表面電荷密度來(lái)平衡雙分子-非雙分子層的比例。在肺炎鏈球菌膜中GlcDAG和GalGlcDAG的比例通常為1∶2.5。spr0982是肺炎鏈球菌的一個(gè)必需基因［8－9］。糖基轉(zhuǎn)移酶Spr0982和CpoA都與肺炎鏈球菌的細(xì)胞壁形成相關(guān)［10］，且cpo A的突變?cè)斐闪朔窝祖溓蚓哪退幮裕琑6Δcpo A的增殖時(shí)間(46～48 min)明顯比R6野生型時(shí)間長(zhǎng)，這說(shuō)明CpoA在肺炎鏈球菌生長(zhǎng)代謝及抗生素耐藥過(guò)程中都起著非常重要的作用［8］。因此，推測(cè)位于cpo A基因下游的糖基轉(zhuǎn)移酶spr0982基因有可能參與肺炎鏈球菌的毒性和耐藥性，是潛在的抗生素藥物的靶標(biāo)。

肺炎鏈球菌的耐藥性已經(jīng)是不容小覷的一個(gè)問(wèn)題，尤其是對(duì)于β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率逐漸上升。對(duì)于其耐藥性相關(guān)蛋白的研究也是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。糖基轉(zhuǎn)移酶的突變導(dǎo)致了肺炎鏈球菌莢膜組成的改變，從而影響了肺炎鏈球菌的毒性及耐藥性［11－13］。

目前，關(guān)于Spr0982的研究報(bào)道并不多，鑒于此，本研究擬對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶基因spr0982進(jìn)行分子克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)純化條件進(jìn)行摸索，同時(shí)在不同肺炎鏈球菌中進(jìn)行保守性分析，以期為后續(xù)酶活測(cè)定等實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)，對(duì)篩選研究新型的抗生素靶點(diǎn)提供指導(dǎo)，對(duì)理解肺炎鏈球菌的致病性和耐藥性有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

肺炎鏈球菌R6菌株、大腸桿菌Top10和BL21 (DE3)菌株，原核表達(dá)質(zhì)粒p28均為筆者所在課題組保存。

1.1.2 試劑

細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，北京天根生化科技有限公司;DNA切膠回試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、限制性內(nèi)切酶(NdeⅠ、XholⅠ)，Promega公司;Easy Pfu DNA聚合酶、DNA marker、連接酶Solution I，TaKaRa公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素、LB培養(yǎng)基、鹽酸胍、NaCl、Tris粉末、咪唑、氯化鎳，上海生工生物工程有限公司;鎳柱、鎳膠、陽(yáng)離子交換柱QFF及分子篩S200，GE公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲取

收集OD600達(dá)0.6～0.8的10 mL肺炎鏈球菌R6菌液，用細(xì)菌基因組抽提試劑盒抽提肺炎鏈球菌R6的基因組。根據(jù)NCBI等網(wǎng)站上的靶基因序列(1 323 bp)，設(shè)計(jì)合適的引物(Primer 6.0設(shè)計(jì)引物)，以R6基因組為模板，將spr0982全長(zhǎng)構(gòu)建至由pET28b改造后的p28質(zhì)粒中，N端帶His6-Tag。

引物序列:正向引物5'-CTCCATATG CGAATTGGTTTATTTACAG-3';反向引物5'-GTCCTCGAGC-TATTCTTCATGGTCTTTC-3'(下劃線序列為酶切位點(diǎn))。

PCR反應(yīng)體系(25μL體系):滅菌ddH2O 18.5 μL，10×Easy Pfu Buffer 2.5μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 1μL，基因組1μL，正向引物(8μmol/L)0.5μL，反向引物(8μmol/L)0.5μL，Easy Pfu酶1μL。PCR反應(yīng)程序:95℃變性10 min，95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min 30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)之后進(jìn)行切膠回收純化。

1.2.2 重組質(zhì)粒p28-Spr0982的構(gòu)建

將回收完畢的目的片段及載體進(jìn)行NdeⅠ和XholⅠ雙酶切反應(yīng)。之后切膠回收，用連接酶SolutionⅠ進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)并涂布于50μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板。第2天挑單菌落于3 mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌液搖至渾濁后取1μL菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證。選取含有陽(yáng)性克隆的渾濁菌液，用質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提。對(duì)抽取的質(zhì)粒用NdeⅠ及XholⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證及質(zhì)粒PCR驗(yàn)證。經(jīng)核酸電泳檢測(cè)是否含有目的條帶。選取陽(yáng)性結(jié)果的質(zhì)粒送至華大基因公司測(cè)序來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。

1.2.3 重組Spr0982蛋白的表達(dá)

將測(cè)序成功的p28-Spr0982質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21-Ril感受態(tài)中，挑選單菌落于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。再轉(zhuǎn)入500 mL培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，待OD600達(dá)0.6～0.8。用0.2 mmol/L終濃度的IPTG于16℃誘導(dǎo)20 h。12 000 g，離心10 min收菌。用含有20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl的Buffer重懸菌體。重懸的菌體于－80℃中反復(fù)凍融3次后，用超聲破碎儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行充分裂解。將超聲后的樣品于離心機(jī)中4℃、12 000 g離心35 min，收集上清液，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.4 重組Spr0982蛋白的純化

經(jīng)檢測(cè)Spr0982重組蛋白上清中有少量可溶蛋白表達(dá)，經(jīng)多次擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得大量目的蛋白用于純化。由于目的蛋白N端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，所以首先嘗試了鎳柱親和層析，再進(jìn)行分子篩S200進(jìn)一步純化。后來(lái)改變純化方法為QFF陽(yáng)離子交換柱和分子篩S200，得到的蛋白樣品用SDS-PAGE來(lái)鑒定。

鎳柱親和層析方法。往鎳柱中灌注1 mL鎳膠，分別用10 mL的6 mol/L鹽酸胍，1 mol/L咪唑20 mL沖洗鎳柱，然后補(bǔ)加10 mL 0.1 mol/L的氯化鎳。再用20 mL的20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl的Buffer平衡鎳柱。取之前離心所得上清上樣，然后用含相應(yīng)緩沖液的50 mmol/L咪唑20 mL洗脫以去除雜蛋白，再用含相應(yīng)Buffer的6 mL 300 mmol/L咪唑洗脫得到目的蛋白。

QFF陽(yáng)離子交換層析方法。首先用低鹽緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，20 mmol/L NaCl)來(lái)平衡QFF柱(柱體積5 mL)，3 mL/min平衡20 min。取之前離心所得上清上樣，選擇20 mmol/L～1 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8緩沖液來(lái)進(jìn)行梯度洗脫。選擇在280 nm有吸收峰的蛋白用SDS-PAGE鑒定及下一步分子篩純化。

分子篩S200層析方法。用20 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8、50 mmol/L NaCl緩沖液來(lái)平衡分子篩S200柱子(柱體積120 mL)，1 mL/min平衡140 min，取QFF收集的目的蛋白上樣，選擇在280 nm有吸收峰的蛋白用SDS-PAGE鑒定。

1.2.5 保守性分析

根據(jù)NCBI等網(wǎng)站上的不同肺炎鏈球菌中GlcDAG合成酶的氨基酸序列，利用ClustalW在線工具對(duì)GlcDAG合成酶蛋白在不同肺炎鏈球菌中的保守性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 spr0982目的基因擴(kuò)增及重組載體構(gòu)建

通過(guò)PCR擴(kuò)增得到目的片段，進(jìn)行重組載體構(gòu)建。首先對(duì)PCR擴(kuò)增得到的結(jié)果和重組基因構(gòu)建進(jìn)行電泳分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，PCR擴(kuò)增后的目的條帶大小約為1 323 bp(圖1(a))，與預(yù)測(cè)大小相符。將目的片段進(jìn)行雙酶切，然后與p28載體連接，轉(zhuǎn)入Top10菌株中，將陽(yáng)性克隆經(jīng)菌液PCR (圖1(b))和雙酶切驗(yàn)證(圖1(c))鑒定，發(fā)現(xiàn)酶切片段與擴(kuò)增片段大小一致，再將目的基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示重組載體構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21-Ril，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，Spr0982目的蛋白主要以包涵體形式存在，因?yàn)樯锨逯杏猩倭靠扇艿鞍?圖2(a)框內(nèi)為目的蛋白條帶)。再將目的蛋白進(jìn)行Western blotting驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在16℃時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的上清和沉淀中均有目的蛋白(圖2(b))。

圖1 目的基因的擴(kuò)增(a)、重組質(zhì)粒菌液PCR(b)與重組質(zhì)粒雙酶切鑒定(c)Fig.1 PCR amplification of target gene(a)，bacterial PCR of recombinant plasmid(b)and double enzyme digestion of recombinant plasmid(c)

圖2 重組蛋白Spr0982的SDS-PAGE電泳和Western blotting驗(yàn)證Fig.2 SDS-PAGE analysis and Western blotting detection of Spr0982

圖3 重組蛋白Spr0982鎳柱親和層析的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE detection of nickel column affinity chromatography of Spr0982

2.3 重組蛋白的鎳柱親和層析及分子篩S200純化

大量培養(yǎng)表達(dá)菌株，收集上清中的可溶目的蛋白進(jìn)行純化條件的摸索。由于帶6個(gè)His標(biāo)簽，首先嘗試進(jìn)行鎳柱親和層析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，目的蛋白在流穿液和20 mmol/L咪唑的緩沖液中被洗脫出來(lái)(圖3框內(nèi)為目的蛋白)。

經(jīng)鎳柱親和層析及SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn):目的蛋白結(jié)合鎳的能力很差，大部分目的蛋白在流穿中被洗脫，推測(cè)可能N端His被包裹起來(lái)從而影響目的蛋白與鎳的結(jié)合。于是考慮換其他方法來(lái)純化目的蛋白。

2.4 重組蛋白的QFF陽(yáng)離子交換層析及分子篩S200純化

重組蛋白經(jīng)鎳柱親和層析發(fā)現(xiàn)效果不佳，于是改變純化方法為嘗試QFF陽(yáng)離子交換層析初步純化，并用SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4和5。由圖4和5可見(jiàn):選取含較多目的蛋白(圖4(b)中2、3和4條帶，框內(nèi)為目的蛋白)，再用分子篩S200進(jìn)一步純化(圖5(a))。純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)(圖5(b))，顯示目的蛋白中的雜蛋白被去除了很多可以得到較純的目的蛋白(圖5(b)中4、5、6、7和9條帶，框內(nèi)為目的蛋白)。

圖4 陽(yáng)離子交換層析(a)及Spr0982蛋白SDS-PAGE電泳圖(b)Fig.4 Cation exchange chromatography(a)and SDS-PAGE detection(b)of Spr0982

經(jīng)QFF及S200純化后可以得到純度達(dá)到80%左右的目的蛋白，可以用于進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)，如分析Spr0982的酶學(xué)性質(zhì)及生理生化特點(diǎn)等。Spr0982催化合成GlcDAG，對(duì)肺炎鏈球菌細(xì)胞壁的組成至關(guān)重要，其酶學(xué)性質(zhì)對(duì)于篩選抑制劑有指導(dǎo)意義。

2.5 蛋白保守性分析

從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得不同型肺炎鏈球菌GlcDAG合成酶蛋白的氨基酸序列:SPSMRU1009 (AAK99786.1)、HMPREF0837_11410(ADI69638.1)、mgtA(CXF84241.1)、SP_1076(AAK75189.1)、SPH_ 1164(ACA37145.1)、SPD_0961(ABJ53775.1)，通過(guò)ClustalW在線工具對(duì)GlcDAG合成酶(Spr0982)進(jìn)行了多序列比對(duì)，分析其在不同肺炎鏈球菌菌株中的保守性，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，在不同的肺炎鏈球菌中GlcDAG合成酶的保守性高達(dá)99.3%。高保守性的靶蛋白對(duì)于篩選殺滅不同型肺炎鏈球菌的抗生素有重要意義。這些有可能為后續(xù)開(kāi)發(fā)和制備GlcDAG合成酶蛋白疫苗及研究新型的抗生素靶標(biāo)提供依據(jù)。

圖5 分子篩層析及Spr0982蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.5 Sephadex S200 and SDS-PAGE detection of Spr0982

3 結(jié)論

通過(guò)分子克隆成功構(gòu)建p28-Spr0982重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中成功表達(dá)出了可溶目的蛋白(大量包涵體形式的目的蛋白質(zhì))，通過(guò)多次擴(kuò)大培養(yǎng)后收集可溶目的蛋白，進(jìn)行純化條件的摸索，結(jié)合QFF陽(yáng)離子交換層析和分子篩層析純化出純度可達(dá)80%的目的蛋白，可供下一步實(shí)驗(yàn)。ClustalW在線工具分析得出其在不同肺炎鏈球菌中具有高度的保守性(99.3%)。

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圖6 不同肺炎鏈球菌中GlcDAG合成酶蛋白(Spr0982)保守性分析Fig.6 Conservation analysis of GlcDAG synthetases from different S．pneumoniae strains

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(責(zé)任編輯荀志金)

Expression，purification and conservation analysis of Spr0982 protein from Streptococcus pneumonia R6

YU Weili，LU Zhonghua，YANG Xiang，ZHENG Yao，SUN Yun
(Department of Intensive Care Unit，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601，China)

The glycosyltransferase gene of Streptococcus pneumonia(S．pneumoniae)is related to its drug resistance and pathogenicity．This study was designed to clone the glycosyltransferase gene spr0982 from S．pneumoniae by PCR method with the S．pneumoniae R6 genome DNA as the template．Gene s pr0982 was constructed into p28(modified PET28b)plasmid．Then，p28-Spr0982 plasmid was transferred into E．coli BL21-Ril for induced expression of the target protein using isopropylβ-D-l-thiogalactopyranoside．The purification condition of the target protein was explored by multiple methods．The conservation of Spr0982 protein in different S．pneumonia strains was analyzed by ClustalW tool online．The recombinant plasmid p28-Spr0982 was constructed successfully and a large amount of target protein was obtained by IPTG induction，although mainly in inclusion body．Through QFF cation exchange column and Sephdex S200，relatively pure soluble protein was obtained．The conservation of Spr0982 protein was as much as 99.3% among different S．pneumonia strains．This study has directive significance for understanding the pathogenicity and drug resistance of S．pneumoniae．

Streptococcus pneumoniae;Spr0982 protein;recombinant expression;conservation;drug resistance

R378.4

A

1672－3678(2017)04－0064－06

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.011

2017－04－14

安徽省自然科學(xué)基金(1508085QC49);安徽醫(yī)科大學(xué)?；?2015XKJ031);安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院博士科研基金(2014BKJ034)

余維麗(1985—)，女，河南商城人，博士，助理研究員，研究方向:微生物生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail:ywl7026@mail．ustc．edu．cn