劉祥濤，張瑞，馮進輝，儀宏，吳洽慶，朱敦明，馬延和(1.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所工業(yè)酶國家工程實驗室，天津300308; 2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所天津市生物催化技術工程中心，天津300308)

“一鍋雙酶”法制備L-天冬氨酸的工藝條件優(yōu)化

劉祥濤1，2，張瑞1，2，馮進輝1，2，儀宏1，2，吳洽慶1，2，朱敦明1，2，馬延和1，2
(1.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所工業(yè)酶國家工程實驗室，天津300308; 2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所天津市生物催化技術工程中心，天津300308)

L-天冬氨酸作為一種大宗氨基酸產(chǎn)品，在醫(yī)藥、食品和化工等方面有著廣泛的用途。筆者所在實驗室成員前期已經(jīng)構建1株含有順丁烯二酸異構酶與L-天冬氨酸氨基裂解酶、且可直接將順丁烯二酸銨轉化成L-天冬氨酸銨的工程菌，對其培養(yǎng)基、發(fā)酵條件以及制備條件進行優(yōu)化。得到的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 1.45 g/L，富馬酸10 g/L，NH4NO38 g/L，乳糖6 g/L，氨水調節(jié)pH至7.5。最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件:發(fā)酵罐的轉速150 r/min，通氣量1.5 L/min，最佳的接種量0.5%(體積分數(shù))。通過發(fā)酵罐對優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，得出1 L發(fā)酵液可以轉化1 kg順丁烯二酸銨，優(yōu)化后相同培養(yǎng)體積的菌體轉化的底物量提高了1倍。為實現(xiàn)“一鍋雙酶”法制備L-天冬氨酸工藝的規(guī)模放大奠定了基礎。

“一鍋雙酶”法;順丁烯二酸;L-天冬氨酸;發(fā)酵工藝優(yōu)化

L-天冬氨酸作為一種大宗氨基酸產(chǎn)品，在醫(yī)藥、食品和化工等方面有著廣泛的用途［1］。在醫(yī)藥方面，主要作為治療心臟病、肝功能促進劑、氨解毒劑、疲勞消除劑和氨基酸輸液的主要成分，也是L-天冬氨酸鹽(鉀、鎂、鈣和鈉鹽)、丙氨酸和天門冬酰胺等多種小分子藥物的合成原料;在食品工業(yè)方面，L-天冬氨酸是一種良好的營養(yǎng)增補劑，添加于各種清涼飲料，是糖代用品阿斯巴甜的主要生產(chǎn)原料;在化工方面，可以作為制造合成樹脂的原料，大量用于合成環(huán)保材料聚天冬氨酸［2］。

目前，國內工業(yè)生產(chǎn)L-天冬氨酸的工藝如圖1所示:以苯裂解制備順丁烯二酸酐(順酐)，水解為順丁烯二酸(順酸或馬來酸)為原料，在無機催化劑及強酸性條件(pH 1左右)下轉化成反丁烯二酸(反酸或富馬酸)［3］;分離純化后的反丁烯二酸在L-天冬氨酸氨基裂解酶和過量氨的作用下催化生成L-天冬氨酸銨［4］，轉化完成的反應液用H2SO4中和過量的氨，并利用L-天冬氨酸在等電點溶解度最低處析出L-天冬氨酸，分離純化得到產(chǎn)品L-天冬氨酸［5－6］。此工藝中，異構化和銨的加成反應都有諸多缺點，如:順丁烯二酸異構化成反丁烯二酸的過程中需要在高溫、高壓、催化劑以及強酸性條件下進行，這一生產(chǎn)工藝過程中產(chǎn)生大量含反丁烯二酸的強酸性廢水，強酸對設備的腐蝕性非常大［7］。

近年來，有研究者提出兩步生物法催化順丁烯二酸生產(chǎn)L-天冬氨酸［8］，首先利用順丁烯二酸異構酶的生物催化法取代化學異構法，在溫和條件下成功地將順丁烯二酸銨轉化成反丁烯二酸銨［9］;再利用天冬氨酸裂解酶在溫和的條件下將反丁烯二酸銨轉化成L-天冬氨酸銨，然后通過濃H2SO4等電析出L-天冬氨酸，此法在一定程度上實現(xiàn)了節(jié)能減排。但是，目前報道的順丁烯二酸異構酶［10－13］大部分存在熱穩(wěn)定性較差、表達量低、反應時間長等缺點［14］，限制了此類菌種在工業(yè)生產(chǎn)中的應用［15－17］。同時，該法需要兩種菌同時進行發(fā)酵，對現(xiàn)有設備進行改造，而且生產(chǎn)操作繁瑣。

筆者所在實驗室成員通過多年研究獲得一種穩(wěn)定性及活性較高的順丁烯二酸異構酶，并創(chuàng)新性地將順丁烯二酸異構酶與L-天冬氨酸氨基裂解酶有效地表達在同一工程菌中，即“一鍋雙酶”法制備L-天冬氨酸的新工藝，該工藝極大簡化生產(chǎn)工藝流程，不需要對現(xiàn)有的設備條件進行改造，直接省去反丁烯二酸的生產(chǎn)環(huán)節(jié)，大幅降低人工、能耗及廢水的排放，為順丁烯二酸異構酶的工業(yè)化應用奠定了基礎。

本文中，筆者以“一鍋雙酶”法制備L-天冬氨酸的工程菌為研究對象，利用正交法優(yōu)化該工程菌的培養(yǎng)基與發(fā)酵條件，并對生產(chǎn)L-天冬氨酸的生產(chǎn)工藝進行改進，以期為L-天冬氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供基本數(shù)據(jù)。

圖1 L-天冬氨酸生產(chǎn)簡圖Fig.1 Diagram of L-aspartic acid production

1 材料與方法

1.1 菌種

順丁烯二酸異構酶Escherichia coli BL21 (DE3)-p ET24b-Mtil，簡寫為Mtil［18］;L-天冬氨酸氨基裂解酶Escherichia coli BL21(DE3)-Asp，簡寫為AspA，“一鍋雙酶”法工程菌Escherichia coli BL21 (DE3)-p ET24b-Mtil-Asp，簡寫為MA，均構建并保存

于中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所工業(yè)酶國家工程實驗室。

1.2 試劑

蛋白胨、酵母浸粉，Oxoid公司;其他分析純試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器

Gel Doc XR+凝膠成像儀、PowerPac basic蛋白電泳儀，Bio-Rad公司;GBJL-5L C型4連發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術有限公司;BMR-7A發(fā)酵罐，上海傲中生物工程設備有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 5，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨18，酵母浸粉7，NaCl 5，富馬酸10。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨20，酵母浸粉5，NaCl 5，富馬酸10，NH4NO38。

以上培養(yǎng)基都用氨水調節(jié)pH至7.5后在121℃滅菌20 min。

1.5 底物反應液制備

稱取順丁烯二酸250 g加入500 mL水，然后濃氨水調節(jié)pH至8.2，蒸餾水定容至1 L，得順丁烯二酸銨(250 g/L，pH 8.2)溶液。

1.6 實驗方法

1.6.1 菌種生長量的測定

取1 mL菌液加入無菌水稀釋，分光光度計測定600 nm處吸光度。

1.6.2 順丁烯二酸濃度測定

取出500μL順丁烯二酸水溶液樣品并加入500 μL鹽酸(5 mol/L)酸化，高效液相色譜(HPLC)測試前樣品再稀釋25倍，過0.22μm濾膜。HPLC檢測條件:安捷倫C18柱，流動相為30%甲醇-醋酸水溶液(pH 3.0)，流速0.4 mL/min，檢測波長220 nm，柱溫40℃，進樣5μL。利用去離子水分別將順丁烯二酸配制成質量濃度為0、1、2、4、6、8和10 g/L;以順丁烯二酸濃度為橫坐標，以液相順丁烯二酸的峰面積為縱坐標制作相應的標準曲線。利用樣品在HPLC的峰面積得到順丁烯二酸水溶液的質量濃度。

1.6.3 薄層層析法(TLC)檢測發(fā)酵液對底物轉化能力

將培養(yǎng)完成的20 mL菌體加入20 mL反丁烯二酸銨(200 g/L，pH 8.2)，搖床轉速200 r/min，42℃進行轉化實驗。在轉化4、5和6 h取500μL轉化液于1.5 mL EP管中，加入100μL濃鹽酸終止反應，再加入500μL乙酸乙酯萃取，離心，取相同體積的萃取液點樣進行TLC檢測。TLC法的展開劑，V(20%甲醇)∶V(1，2-二氯乙烷)=1∶4(簡寫為20% MD)，254 nm顯色，粗略估算轉化率，轉化正常則進行下一步轉化實驗［18］。

1.6.4 后處理

取轉化完成的轉化液1 000 mL加入10 g活性炭，85℃熱處理1 h，過濾得到澄清液體，然后升溫至80℃［17］，用濃H2SO4調節(jié)pH至2.9左右，攪拌2 h后，抽濾0.5 h;1倍體積純水淋洗固體L-天冬氨酸后抽濾0.5 h，收集固體。重復此步驟3次，烘干至恒質量。

1.6.5 轉化產(chǎn)物的鑒定

烘干后的產(chǎn)物通過400 MHz核磁共振波譜儀(AVANCE III型，Bruker公司)進行鑒定。

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)

依次用滅菌的牙簽挑取LB固體平板上的單菌落于1 000 mL種子培養(yǎng)基中，在200 r/min、37℃條件下培養(yǎng)12 h;培養(yǎng)完成的種子培養(yǎng)液按體積分數(shù)0.3%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在200 r/min、37℃條件下培養(yǎng)18 h。發(fā)酵培養(yǎng)過程中每隔3 h取樣測定蛋白表達量，結果見圖2。由圖2可知:Mtil在發(fā)酵培養(yǎng)15 h后蛋白表達基本到達峰值，延長至18 h，Mtil的表達量基本不變;而AspA表達量在12 h趨于峰值，綜合考慮發(fā)酵周期設為15 h。Mtil的等電點為4.97，蛋白分子量為2.67×104;AspA的等電點為5.19，蛋白質的分子量為5.23×104。

圖2 “一鍋雙酶”法工程菌目的蛋白表達分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of protein expression by a"one-pot two-enzyme"process

2.2 工程菌對底物轉化能力的比較

將3種工程菌進行培養(yǎng)，培養(yǎng)完成的工程菌分別進行底物轉化，結果見表1。由表1可知:Mtil對底物的轉化能力與AspA對底物的轉化能力相差近10倍，MA工程菌轉化能力受制于Mtil轉化能力。而“一鍋雙酶”法進行轉化實驗時，順丁烯二酸銨在Mtil作用下生成反丁烯二酸銨，然后在AspA的作用下生成L-天冬氨酸銨，使反應向L-天冬氨酸銨方向進行，打破了產(chǎn)物反丁烯二酸濃度反饋抑制，使Mtil對底物的轉化能力提高了5倍。

表1 工程菌對底物轉化能力Table 1 Conversion ability of different recombinant strains with different substrate

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)化

為降低發(fā)酵成本，用乳糖代替IPTG為誘導劑，并對乳糖進行單因素實驗，考察不同質量濃度乳糖對工程菌相對酶活的影響，結果見圖3。由圖3可以看出:當乳糖質量濃度為6 g/L時，工程菌的相對酶活均達到峰值，但繼續(xù)增加乳糖，相對酶活變化不顯著?？紤]發(fā)酵成本，因此選擇誘導時乳糖的質量濃度為6 g/L。

圖3 乳糖質量濃度對工程菌轉化底物能力影響Fig.3 Effect of the lactose on one-pot two-enzyme relative enzyme activity

氮源優(yōu)化時，選擇的有機氮源為蛋白胨，而酵母粉也可作為有機氮源的一部分進行考察;無機氮源為NH4NO3。利用L9(34)正交試驗來考察氮源對工程菌相對酶活的影響，正交試驗設計及方差分析見表2～4。由表2～4的結果可以分析得出:培養(yǎng)基中氮源對酶活影響的顯著性從大到小依次為蛋白胨、NH4NO3、酵母提取物。由此可見，該工程菌利用蛋白胨為氮源表達兩種酶的優(yōu)勢明顯高于NH4NO3，并且這2種氮源對工程菌MA的作用高于酵母提取物的。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為20 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、8 g/L NH4NO3。

表2 氮源的正交試驗L9(34)設計及結果Table 2 Results and design of nitrogen source orthogonal experiments

表4 氮源優(yōu)化結果的方差分析Table 4 Analysis of variance of nitrogen source

優(yōu)化后的培養(yǎng)基在3 L的發(fā)酵規(guī)模下(鎮(zhèn)江東方5 L發(fā)酵罐)對發(fā)酵條件進行L9(34)正交試驗，結果及其分析見表5～7。

表5 培養(yǎng)條件的正交試驗L9(34)設計及結果Table 5 Results and design of culture conditions orthogonal experiments

表6 培養(yǎng)條件優(yōu)化的極差分析Table 6 Range analysis of culture conditions orthogonal experiments

表7 培養(yǎng)條件的方差分析Table 7 Analysis of culture conditions variance

由表5～7的結果分析可知:不同發(fā)酵條件對工程菌培養(yǎng)的影響顯著性從大到小依次為通氣量、轉速、接種量。同時，筆者在純化異構酶的過程中發(fā)現(xiàn)異構酶的活性衰退很大，分析異構酶的序列活性中心含有巰基，推測其抗氧化能力較差［18］。當發(fā)酵條件中的溶氧較高時影響異構酶的活性，導致雙酶法中順丁烯二酸異構酶活力較差，進而影響雙酶法的對底物的轉化能力。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為發(fā)酵罐轉速150 r/min，通氣量1.5 L/min，接種量0.5%。

由此得到優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 5 g/L，富馬酸10 g/L，NH4NO38 g/L，乳糖6 g/L，氨水調節(jié)pH至7.5。最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件:發(fā)酵罐的轉速150 r/min，通氣量1.5 L/min，最佳的接種量0.5%。

2.4 優(yōu)化后培養(yǎng)基發(fā)酵罐驗證

搖瓶優(yōu)化得到的培養(yǎng)基在上海傲中BMR-7A型發(fā)酵罐上進行了5 L規(guī)模的發(fā)酵，轉速為200 r/min，培養(yǎng)溫度與誘導溫度37℃，溶氧控制在20%以上，pH控制在6.0～7.8。培養(yǎng)完成的工程菌，將發(fā)酵完成的發(fā)酵液1 L與順丁烯二酸銨4 L (250 g/L，pH 8.2)投入到轉化罐中，在42℃、200 r/min條件下進行轉化實驗，轉化16 h完成轉化實驗，結果見表8。由表8可知:與未優(yōu)化前的培養(yǎng)基相比，優(yōu)化后相同培養(yǎng)體積的菌體轉化的底物量提高了1倍，轉化時間縮短8 h，L-天冬氨酸的質量收率提高了1%。

表8 培養(yǎng)基優(yōu)化前后轉化工程菌對底物轉化能力比較Table 8 Comparison the conversion activity after optimization

2.5 產(chǎn)物鑒定

獲得的產(chǎn)物通過核磁鑒定，結果見圖4。1H NMR(400 MHz，D2O)δ3.96(q，J=2.4，4.4 Hz，1H)，2.90(dd，J=4.0，8.0 Hz，2H)。由圖4可見，通過發(fā)酵得到的產(chǎn)品是L-天冬氨酸。

3 結論

采用基因數(shù)據(jù)庫中挖礦方法尋找合適的異構酶和天冬氨酸裂解酶基因，構建到同一株細菌中，并有效表達，使得該工程菌具有使順丁烯二酸異構化為反丁烯二酸的能力和合成L-天冬氨酸的能力。表達完成的工程菌發(fā)酵液不做任何處理，直接加入到順丁烯二酸銨的轉化液中，同時對發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行正交試驗優(yōu)化，優(yōu)化后相同培養(yǎng)體積的菌體轉化的底物量比較優(yōu)化前提高了1倍。目前在實驗室條件下，可穩(wěn)定實現(xiàn)1 L發(fā)酵液轉化1 kg順丁烯二酸銨，L-天冬氨酸的質量收率達99%。后續(xù)將在工業(yè)生產(chǎn)條件下驗證本實驗的相關結果，期望本生產(chǎn)工藝后續(xù)將能夠成功實現(xiàn)工業(yè)化應用，充分發(fā)揮其環(huán)保優(yōu)勢，為提升企業(yè)經(jīng)濟效應發(fā)揮重要作用。

圖4 產(chǎn)物鑒定的核磁譜圖Fig.4 Product identification by1H NMR

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(責任編輯荀志金)

Optimizing of L-aspartic acid production by a"one-pot two-enzyme"process

LIU Xiangtao1，2，ZHANG Rui1，2，F(xiàn)ENG Jinhui1，2，YI Hong1，2，WU Qiaqing1，2，ZHU Dunming1，2，MA Yanhe1，2
(1.National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China;2.Tianjin Engineering Research Center Of Biocatalytic Technology，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China)

L-aspartic acid has been widely used in medicine，food and chemical industries．It is currently produced by a chemoenzymatic process at industrial scale．We have developed a"one-pot two-enzyme" process for the production of L-aspartic acid，which involves a maleate cis-trans isomerase and an laspartic acid amino lyase that are highly co-expressed in Escherichia coli．The fermentation conditions were optimized by orthogonal experimental design to improve the enzyme production．The optimum medium composition was as follows(g/L):tryptone 20，yeast extract 5，NaCl 5，fumaric acid 10，NH4NO38，lactose 6，and pH 7.5．The optimum conditions were as follow:rotational speed 150 r/min，ventilation 1.5 L/min，inoculum concentration 0.5%．The enzyme activity was two times higher than that before optimization，thus enabling the scale-up of the process to ensure the production of l-aspartic acid at industrial scale by this"one-pot two-enzyme"process．

one-pot two-enzyme process;maleic acid;L-aspartic acid;fermentation optimization

TQ922

A

1672－3678(2017)04－0045－06

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.008

2017－04－21

天津市科技計劃(13ZCZDSY05200)

劉祥濤(1984—)，男，山東臨沂人，助理研究員，研究方向:生物催化與綠色化工;吳洽慶(聯(lián)系人)，研究員，E-mail:wu_qq@tib．cas．cn